导读:本文包含了软化类芽孢杆菌论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:环糊精糖基转移酶,L-抗坏血酸,麦芽糊精,2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸
软化类芽孢杆菌论文文献综述
许乔艳[1]（2013）在《分子改造软化类芽孢杆菌环糊精糖基转移酶生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸》一文中研究指出维生素C(Vitamin C，VC)，又称L-抗坏血酸(L-AscorbicAcid，L-AA)，是一种水溶性维生素，在保持和促进人体健康以及动物生长方面具有重要的作用。但由于本身化学结构极不稳定，限制了应用范围。研究发现，VC糖基衍生物2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)具有安全、稳定性强和在体内易降解产生L-AA等优点，能更好地为人体和动物吸收和利用，因而更具优势。AA-2G是利用糖基转移酶特异性的转糖基作用将糖基供体上的葡萄糖苷转移到VC的C-2上合成的。来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶(EC2.4.1.19))因其催化生产AA-2G底物来源广泛且产物特异性强而被认为是糖基转移酶的最优选择。研究发现以环糊精为糖基供体时，成本较高且转化效率较低，不利于AA-2G的工业化生产。因此，以价格低廉且易溶的麦芽糊精为糖基供体高度专一地合成AA-2G具有重要意义。本研究通过晶体结构模拟和文献参考确定了CGT酶底物结合的关键位点：-3亚位点和+1亚位点。以在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中成功表达的重组质粒pET20b(+)/cgt为模板，对CGT酶-3亚位点和+1亚位点附近的氨基酸残基进行定点饱和突变，构建了麦芽糊精底物特异性改善的突变体，提高了以麦芽糊精为糖基供体催化合成AA-2G的效率。其中，双亚位点复合突变体K47L/Y89F/N94P/D196Y/L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高，达到2.37g·L-1，比野生型CGT酶提高了97.4%。通过酶学性质分析，确定了突变体酶促反应的最适温度与野生型一致为36oC。最适pH在5.5-7的范围内波动，可能与突变体引入的不同极性的氨基酸改变了底物结合活性位点可解离基团的pKa有关。另外发现突变体酶在40oC和pH5.5条件下仍能分别保持良好的热稳定性和酸耐受性。在最适温度和pH条件下，野生型(突变型)CGT酶均在反应24h时达到AA-2G产量的峰值。对获得的突变体进行动力学分析，发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用。模拟突变体的叁维结构并进行分析，突变体底物特异性的改善可能与亚位点附近氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。(本文来源于《江南大学》期刊2013-12-01）
李兆丰[2]（2009）在《软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析》一文中研究指出环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶,EC 2.4.1.19)是一种能够通过分子内转糖基化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精的胞外酶。随着环糊精在食品、医药、化妆品、农业等领域的应用越来越广,CGT酶已经成为当今研究的热点。为了克服天然菌株的低CGT酶生产能力,cgt基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中过量表达被认为是最有效途径之一,然而,以前的报道表明,CGT酶通常在E. coli中形成不溶性包涵体或积累于周质空间,限制了其工业应用,因此,实现重组CGT酶的胞外生产是迫切需要的;另外,用CGT酶生产环糊精最不利的条件之一是产物特异性差,所有已知的野生CGT酶生产的均是α-、β-和γ-环糊精的混合物,不利于下游操作。本论文主要将来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans) JFB05-01的α-CGT酶基因表达于E. coli中,并通过采用一些培养策略,实现了重组酶的胞外过量生产,同时对该酶的产物特异性进行了一定的分析与改善。主要研究结果如下:1.将来源于P. macerans JFB05-01的α-CGT酶基因分别插入质粒pET-20b(+)和pET-22b(+)的pelB信号肽序列下游,构建了表达载体pET-20b(+)/cgt和pET-22b(+)/cgt,并将它们转化宿主E. coli BL21(DE3)。对E. coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)进行摇瓶发酵,确定其胞外生产重组α-CGT酶的较优条件为:发酵培养基为TB培养基,诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为0.01 mM,诱导温度为25°C。在该条件下诱导90 h后,培养基中酶活达到22.5 U/mL,与较优发酵条件下天然菌株P. macerans JFB05-01所产的胞外酶活相比,提高了大约42倍。E. coli BL21(DE3)(pET-22b(+)/cgt)需要更高的IPTG浓度(0.2 mM)进行诱导,且诱导90 h后的胞外酶活仅为17.5 U/mL,因此,E. coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)更适于胞外生产重组α-CGT酶。这是国内外首次报道α-CGT酶在E. coli中的胞外生产。2.当诱导温度恒定时,25°C最适合重组α-CGT酶的胞外生产,然而,诱导的前50 h重组酶主要积累于周质空间,而只有少量释放到培养基中。较高的诱导温度抑制了重组酶的胞外分泌,可能原因是具有信号肽的前体蛋白合成速率太快,导致它们在细胞内膜内侧聚集而形成大量包涵体,并堵塞了内膜转运通道。在较低温度下诱导一段时间后升高温度有利于重组α-CGT酶的胞外生产,尤其是在25°C下诱导32 h后将温度升高到30°C导致胞外酶活明显增加,诱导90 h后的酶活达到32.5 U/mL,相比于恒定在25°C的情况提高了45%。3.甘氨酸的添加促进了重组α-CGT酶的胞外分泌并能明显缩短发酵时间,特别是甘氨酸浓度为150 mM时,诱导40 h后的胞外酶活达到23.5 U/mL,相比于对照在相同诱导时间的酶活提高了10倍,而且,诱导36 h后的重组酶生产强度最大,达到0.60 U/mL/h,相比于对照诱导80 h后的最大生产强度提高了1.5倍,其潜在机理是甘氨酸导致E. coli细胞膜透性的明显增加。然而,甘氨酸对E. coli细胞的生长有明显的负面影响,这限制了重组酶生产强度的进一步提高。Ca2+能补偿甘氨酸对细胞生长的抑制作用,主要体现在单位体积中的细胞数和活细胞数明显增加、细胞自溶明显减少以及细胞形态修复。当TB培养基中同时添加150 mM甘氨酸和20 mM Ca2+,诱导40 h后的胞外酶活达到35.5 U/mL,诱导36 h后的最大生产强度达到0.90 U/mL/h,相比于只添加甘氨酸的情况均提高了50%。4.重组α-CGT酶在C-末端连有6×His-tag,因此能用镍柱进行一步亲合层析,但该方法纯化酶的回收率很低;重组和天然α-CGT酶能通过阴离子交换和疏水色谱两步纯化,纯化酶的回收率较高。α-CGT酶在溶液中是单聚体;重组α-CGT酶环化反应的最适温度为45°C,在40°C、45°C和50°C下的半衰期分别为8 h、1.25 h和0.5 h,而天然酶有稍高的最适温度(50°C)和热稳定性(t1/2, 50°C=0.8 h);重组和天然酶环化反应的最适pH均为5.5,且分别在pH 6~9.5和6~10之间相对稳定;α-CGT酶的环化活力不依赖于金属辅因子,Hg2+、Ni2+、Fe2+和Co2+对环化活力有抑制作用,而一些二价金属离子能激活环化活力,特别是Ca2+、Ba2+和Zn2+。在酶转化的起始阶段,α-CGT酶生产α-环糊精作为主要产物,随着反应时间的延长,β-环糊精的比例明显增加,最终β-环糊精为主要产物;相比于天然酶,重组酶有更高的α-环糊精特异性。α-CGT酶环化反应的动力学性质适合用Hill方程进行描述,Hill常数高于1暗示酶单聚体的底物结合有正协同作用。5.亚位点?3处的Asp372和Tyr89的突变能改变P. macerans CGT酶的环化活力和环糊精产物比例,说明这两个残基对环糊精产物特异性具有重要作用,也进一步证实亚位点-3对CGT酶产物特异性来讲是关键位点。Asp372突变成赖氨酸和Tyr89突变成精氨酸显着提高了P. macerans CGT酶的α-环糊精特异性,单突变体D372K和Y89R在产物特异性上的改变能累加于双突变D372K/Y89R;相比于野生CGT酶,双突变体D372K/Y89R的α-环糊精产量提高了50%,而β-环糊精产量下降了43%。具有更高α-环糊精特异性的突变体比野生酶更适合于α-环糊精的工业化生产。6.氨基酸残基47是定位于亚位点?3附近的主要残基之一,不同类型的CGT酶之间残基47的氨基酸种类明显不同,暗示残基47的种类可能与CGT酶的产物特异性有关。Lys47的突变能改变P. macerans CGT酶的环化活力并影响环糊精的生产,说明这个残基对环化反应和环糊精产物特异性具有重要作用。Lys47的所有突变降低了P. macerans CGT酶的α-环化活力,暗示Lys47对α-环化反应非常重要,但这些突变能显着增加CGT酶的β-环化活力,尤其是Lys47突变成苏氨酸、丝氨酸或亮氨酸,这叁个单突变转化P. macerans CGT酶从α-型到β/α-型,作为结果,所有突变体具有更高的β-环糊精特异性,它们比野生酶更适合于β-环糊精的工业化生产。(本文来源于《江南大学》期刊2009-06-01）
软化类芽孢杆菌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶,EC 2.4.1.19)是一种能够通过分子内转糖基化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精的胞外酶。随着环糊精在食品、医药、化妆品、农业等领域的应用越来越广,CGT酶已经成为当今研究的热点。为了克服天然菌株的低CGT酶生产能力,cgt基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中过量表达被认为是最有效途径之一,然而,以前的报道表明,CGT酶通常在E. coli中形成不溶性包涵体或积累于周质空间,限制了其工业应用,因此,实现重组CGT酶的胞外生产是迫切需要的;另外,用CGT酶生产环糊精最不利的条件之一是产物特异性差,所有已知的野生CGT酶生产的均是α-、β-和γ-环糊精的混合物,不利于下游操作。本论文主要将来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans) JFB05-01的α-CGT酶基因表达于E. coli中,并通过采用一些培养策略,实现了重组酶的胞外过量生产,同时对该酶的产物特异性进行了一定的分析与改善。主要研究结果如下:1.将来源于P. macerans JFB05-01的α-CGT酶基因分别插入质粒pET-20b(+)和pET-22b(+)的pelB信号肽序列下游,构建了表达载体pET-20b(+)/cgt和pET-22b(+)/cgt,并将它们转化宿主E. coli BL21(DE3)。对E. coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)进行摇瓶发酵,确定其胞外生产重组α-CGT酶的较优条件为:发酵培养基为TB培养基,诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为0.01 mM,诱导温度为25°C。在该条件下诱导90 h后,培养基中酶活达到22.5 U/mL,与较优发酵条件下天然菌株P. macerans JFB05-01所产的胞外酶活相比,提高了大约42倍。E. coli BL21(DE3)(pET-22b(+)/cgt)需要更高的IPTG浓度(0.2 mM)进行诱导,且诱导90 h后的胞外酶活仅为17.5 U/mL,因此,E. coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)更适于胞外生产重组α-CGT酶。这是国内外首次报道α-CGT酶在E. coli中的胞外生产。2.当诱导温度恒定时,25°C最适合重组α-CGT酶的胞外生产,然而,诱导的前50 h重组酶主要积累于周质空间,而只有少量释放到培养基中。较高的诱导温度抑制了重组酶的胞外分泌,可能原因是具有信号肽的前体蛋白合成速率太快,导致它们在细胞内膜内侧聚集而形成大量包涵体,并堵塞了内膜转运通道。在较低温度下诱导一段时间后升高温度有利于重组α-CGT酶的胞外生产,尤其是在25°C下诱导32 h后将温度升高到30°C导致胞外酶活明显增加,诱导90 h后的酶活达到32.5 U/mL,相比于恒定在25°C的情况提高了45%。3.甘氨酸的添加促进了重组α-CGT酶的胞外分泌并能明显缩短发酵时间,特别是甘氨酸浓度为150 mM时,诱导40 h后的胞外酶活达到23.5 U/mL,相比于对照在相同诱导时间的酶活提高了10倍,而且,诱导36 h后的重组酶生产强度最大,达到0.60 U/mL/h,相比于对照诱导80 h后的最大生产强度提高了1.5倍,其潜在机理是甘氨酸导致E. coli细胞膜透性的明显增加。然而,甘氨酸对E. coli细胞的生长有明显的负面影响,这限制了重组酶生产强度的进一步提高。Ca2+能补偿甘氨酸对细胞生长的抑制作用,主要体现在单位体积中的细胞数和活细胞数明显增加、细胞自溶明显减少以及细胞形态修复。当TB培养基中同时添加150 mM甘氨酸和20 mM Ca2+,诱导40 h后的胞外酶活达到35.5 U/mL,诱导36 h后的最大生产强度达到0.90 U/mL/h,相比于只添加甘氨酸的情况均提高了50%。4.重组α-CGT酶在C-末端连有6×His-tag,因此能用镍柱进行一步亲合层析,但该方法纯化酶的回收率很低;重组和天然α-CGT酶能通过阴离子交换和疏水色谱两步纯化,纯化酶的回收率较高。α-CGT酶在溶液中是单聚体;重组α-CGT酶环化反应的最适温度为45°C,在40°C、45°C和50°C下的半衰期分别为8 h、1.25 h和0.5 h,而天然酶有稍高的最适温度(50°C)和热稳定性(t1/2, 50°C=0.8 h);重组和天然酶环化反应的最适pH均为5.5,且分别在pH 6~9.5和6~10之间相对稳定;α-CGT酶的环化活力不依赖于金属辅因子,Hg2+、Ni2+、Fe2+和Co2+对环化活力有抑制作用,而一些二价金属离子能激活环化活力,特别是Ca2+、Ba2+和Zn2+。在酶转化的起始阶段,α-CGT酶生产α-环糊精作为主要产物,随着反应时间的延长,β-环糊精的比例明显增加,最终β-环糊精为主要产物;相比于天然酶,重组酶有更高的α-环糊精特异性。α-CGT酶环化反应的动力学性质适合用Hill方程进行描述,Hill常数高于1暗示酶单聚体的底物结合有正协同作用。5.亚位点?3处的Asp372和Tyr89的突变能改变P. macerans CGT酶的环化活力和环糊精产物比例,说明这两个残基对环糊精产物特异性具有重要作用,也进一步证实亚位点-3对CGT酶产物特异性来讲是关键位点。Asp372突变成赖氨酸和Tyr89突变成精氨酸显着提高了P. macerans CGT酶的α-环糊精特异性,单突变体D372K和Y89R在产物特异性上的改变能累加于双突变D372K/Y89R;相比于野生CGT酶,双突变体D372K/Y89R的α-环糊精产量提高了50%,而β-环糊精产量下降了43%。具有更高α-环糊精特异性的突变体比野生酶更适合于α-环糊精的工业化生产。6.氨基酸残基47是定位于亚位点?3附近的主要残基之一,不同类型的CGT酶之间残基47的氨基酸种类明显不同,暗示残基47的种类可能与CGT酶的产物特异性有关。Lys47的突变能改变P. macerans CGT酶的环化活力并影响环糊精的生产,说明这个残基对环化反应和环糊精产物特异性具有重要作用。Lys47的所有突变降低了P. macerans CGT酶的α-环化活力,暗示Lys47对α-环化反应非常重要,但这些突变能显着增加CGT酶的β-环化活力,尤其是Lys47突变成苏氨酸、丝氨酸或亮氨酸,这叁个单突变转化P. macerans CGT酶从α-型到β/α-型,作为结果,所有突变体具有更高的β-环糊精特异性,它们比野生酶更适合于β-环糊精的工业化生产。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
软化类芽孢杆菌论文参考文献
[1].许乔艳.分子改造软化类芽孢杆菌环糊精糖基转移酶生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸[D].江南大学.2013
[2].李兆丰.软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析[D].江南大学.2009
标签：环糊精糖基转移酶; L-抗坏血酸; 麦芽糊精; 2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸;