本文主要研究内容
作者陈思谨（2019）在《海洋红鼓鱼鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白的高效制备技术及其结构研究》一文中研究指出：本论文研究得到国家海洋三所基本科研业务项目“海洋源超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的关键理化性质表征与构效关系研究”(海三科No.2015003)、厦门海洋研究开发院共建项目“组织工程用海洋源高纯胶原蛋白的关键制备技术研发及其支架材料安全性的初步评估”,以及福建省科技重大专项“海洋生物资源高值化利用技术研究”(No.2013NZ0003)的资助。Ⅰ型胶原蛋白是目前胶原蛋白领域研究关注度较高、市场应用潜力巨大的胶原蛋白。来自海洋鱼鳞的Ⅰ型胶原蛋白可消除消费者对陆生动物源胶原蛋白可能感染疯牛病、口蹄疫或禽流感的疑虑,并符合犹太教、伊斯兰教和印度教的宗教习俗,因此有望替代陆生动物源胶原蛋白,成为胶原蛋白的新原料。然而,海洋鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白的研究尚存在以下不足:提取工艺得率偏低;分离工艺复杂;缺乏准确定量的方法;氨基酸序列测定研究不足;也未见有其在蛋白修饰与功效预测方面的研究报道。为解决在海洋鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白研究过程中存在的问题,本博士论文进行以下几方面的研究,结果如下:1.PSC快速分离技术的研发采用酶溶提取工艺从海产红鼓鱼鱼鳞中提取低抗原性的酶溶性胶原蛋白(PSC);为解决胶原蛋白传统分离工艺复杂耗时的缺点,将亲水超滤技术应用于提取液中胶原蛋白的分离,该技术可快速分离PSC,分离时间由原来的1～3天缩短到3小时以内,处理胶原蛋白料液,从原来透析不足1升提升到一次可处理45升。所得到的红鼓鱼鱼鳞酶溶性Ⅰ型胶原蛋白以SDS-PAGE测定纯度达到95%以上(电泳纯),命名为红鼓鱼鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白,缩写为PSC。2.PSC定量方法的研究采用凝胶色谱(GC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测PSC纯度,结果表明:PSC达到色谱纯;采用RP-HPLC,以峰面积归一化法测定其纯度为94.00%±0.01%;以质量平衡法推算出含量为91.27%±0.01%,并计算出PSC与羟脯氨酸之间转换因子为11.24±0.26。通过该转换因子可以计算一般条件下分离获得的PSC含量。3.PSC理化性质的表征运用质谱、光谱、色谱、电镜、电泳等分析方法较为全面地表征PSC的理化性质。针对热稳定性,选择乌氏粘度法测定PSC的变性温度为27.3℃,另外,通过MALDI-TOF测定PSC的确切分子量为288.2kDa;采用ICP-MS测定PSC蛋白样品的重金属含量,测定结果表明符合国标。4.PSC的结构研究采用全长转录组测序(Full-length transcriptome sequencing)技术,构建专属红鼓鱼鱼鳞的CDS蛋白库;另一方面,采用制备色谱收集PSC在RP-HPLC分离的主峰馏分,进行蛋白鉴定。将鉴定的肽段比对CDS蛋白库,筛选出红鼓鱼鱼鳞Ⅰ型前胶原蛋白的氨基酸序列;根据肽段分布情况,确定红鼓鱼鱼鳞酶溶性Ⅰ型胶原蛋白,即PSC的氨基酸序列。以NCBI、Uniprot和KEGG三个数据库判定:PSC氨基酸序列的确属于Ⅰ型胶原蛋白,确定PSC为Ⅰ型胶原蛋白。Blast Tree View分析结果证实:红鼓鱼鱼鳞Ⅰ型前胶原蛋白α1链和α2链均属于目前尚未被报道的硬骨鱼的未知蛋白。Phyre2 Protein Fold Recognition Server预测PSC的结构与人纤维状Ⅰ型前胶原蛋白类似。进一步研究确定了PSC α1亚基的96个脯氨酸羟基化位点和9个赖氨酸羟基化位点,以及α2亚基的84个脯氨酸羟基化位点和5个赖氨酸羟基化位点;并借助Netphos-3.1、NetGlycate 1.0和YinOYang1.2服务器预测PSC氨基酸序列中磷酸化和糖基化的具体修饰位点,初步解释蛋白修饰作用对PSC分子量、溶解性和低抗原性的影响。同时,通过ABCpred服务器预测红鼓鱼鱼鳞Ⅰ型前胶原蛋白α链N端和C端肽链序列的抗原表位,表明胶原蛋白的N端和C端肽链是主要的抗原决定簇。基于全长转录组测序技术构建的专属红鼓鱼鱼鳞的CDS蛋白库,论文进一步对亲水超滤分离前后的PSC初提物和PSC纯品的SDS-PAGE胶条进行蛋白鉴定,结果显示,亲水超滤分离之前的PSC初提物α链胶条中有33个杂蛋白,其中,α1链上有26个杂蛋白,α2链上有13个杂蛋白,6个杂蛋白在α1链和α2链上均被发现,而亲水超滤分离纯化之后的PSC纯品(色谱纯)α链胶条中则仅有8个杂蛋白,其中,α1链上有6个杂蛋白,α2链上有3个杂蛋白,1个杂蛋白在α1链和α2链上均被发现。亲水超滤前后,PSC α1链中的杂蛋白均多于PSC α2链中的杂蛋白。本论文已将所有杂蛋白的氨基酸序列一一列举;并通过Blast Tree View分析,其中有25个尚未被报道的蛋白。研究发现亲水超滤之前的PSC初提物的α链胶条中,可能存在4种过敏蛋白——parvalbumin beta、tropomyosin alpha-1 chain、beta-enolase和fructose-bisphosphate aldolase A,并通过SWISS-MODEL和Phyre2 Protein Fold Recognition Server预测了它们的结构(见附图)。而亲水超滤之后的PSC纯品的α链胶条中并未发现过敏蛋白的氨基酸序列,这说明亲水超滤技术分离获得的PSC具有低抗原性。根据《中国药典》(2015年版)的相关规定,提供除PSC以外其他杂蛋白详细的氨基酸序列,还通过SWISS-MODEL和Phyre2 Protein Fold Recognition Server预测它们初步的蛋白结构。借助广泛的文献调研和氨基酸序列比对PSC的结构域进行分析与功能预测。分析PSC三螺旋结构稳定性的位点,进一步预测其三螺旋结构。确定可能存在与整合素(ITG)特异性结合的位点;可能与糖蛋白VI(GPVI)有着为数众多的结合位点;PSC还可能直接结合另外两种胶原蛋白受体——白细胞相关的免疫球蛋白样受体(LAIR)和盘状结构域受体(DDR),并与甘露糖受体通过纤维连接蛋白II型(FnII)结构域间接结合。另外,PSC也可能与血管性血友病因子(VWF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、血小板反应蛋白(TSP)、分子伴侣Hsp47、淀粉样前体蛋白(APP)、破骨细胞相关受体(OSCAR)以及肝素均可能有结合位点。这些结果预示本论文所分离获得的PSC可能可以参与并协助不同受体、蛋白和多糖发挥复杂的生物学功能,为今后该胶原蛋白的进一步进行生物工程组织材料和药物的研究奠定基础;同时,通过对比PSC α1链和α2链能够结合的受体、蛋白和多糖的种类,α1链远多于α2链,这种结果与上一节PSC α1链和α2链中杂蛋白的情况一致。5.PSC高效提取技术研发采用低温匀浆技术用来提取红鼓鱼鱼鳞中的I型胶原蛋白,可大幅度提高胶原蛋白的得率,所获得的PSC与前述章节的分离纯度测定等均一致;保湿抗氧化活性测定结果显示:所提取获得的PSC具有优异的吸湿能力与保湿能力;抗氧化活性与陆生动物源的鼠尾I型胶原蛋白和同为水生动物源的三文鱼鱼皮I型胶原蛋白比较,具有显著差异。结果表明本论文研究从红鼓鱼鱼鳞中高效提取制备的PSC具有较好的应用前景。
Abstract
ben lun wen yan jiu de dao guo jia hai xiang san suo ji ben ke yan ye wu xiang mu “hai xiang yuan chao luo xuan jie gou Ⅰxing jiao yuan dan bai de guan jian li hua xing zhi biao zheng yu gou xiao guan ji yan jiu ”(hai san ke No.2015003)、sha men hai xiang yan jiu kai fa yuan gong jian xiang mu “zu zhi gong cheng yong hai xiang yuan gao chun jiao yuan dan bai de guan jian zhi bei ji shu yan fa ji ji zhi jia cai liao an quan xing de chu bu ping gu ”,yi ji fu jian sheng ke ji chong da zhuan xiang “hai xiang sheng wu zi yuan gao zhi hua li yong ji shu yan jiu ”(No.2013NZ0003)de zi zhu 。Ⅰxing jiao yuan dan bai shi mu qian jiao yuan dan bai ling yu yan jiu guan zhu du jiao gao 、shi chang ying yong qian li ju da de jiao yuan dan bai 。lai zi hai xiang yu lin de Ⅰxing jiao yuan dan bai ke xiao chu xiao fei zhe dui liu sheng dong wu yuan jiao yuan dan bai ke neng gan ran feng niu bing 、kou ti yi huo qin liu gan de yi lv ,bing fu ge you tai jiao 、yi si lan jiao he yin du jiao de zong jiao xi su ,yin ci you wang ti dai liu sheng dong wu yuan jiao yuan dan bai ,cheng wei jiao yuan dan bai de xin yuan liao 。ran er ,hai xiang yu lin Ⅰxing jiao yuan dan bai de yan jiu shang cun zai yi xia bu zu :di qu gong yi de lv pian di ;fen li gong yi fu za ;que fa zhun que ding liang de fang fa ;an ji suan xu lie ce ding yan jiu bu zu ;ye wei jian you ji zai dan bai xiu shi yu gong xiao yu ce fang mian de yan jiu bao dao 。wei jie jue zai hai xiang yu lin Ⅰxing jiao yuan dan bai yan jiu guo cheng zhong cun zai de wen ti ,ben bo shi lun wen jin hang yi xia ji fang mian de yan jiu ,jie guo ru xia :1.PSCkuai su fen li ji shu de yan fa cai yong mei rong di qu gong yi cong hai chan gong gu yu yu lin zhong di qu di kang yuan xing de mei rong xing jiao yuan dan bai (PSC);wei jie jue jiao yuan dan bai chuan tong fen li gong yi fu za hao shi de que dian ,jiang qin shui chao lv ji shu ying yong yu di qu ye zhong jiao yuan dan bai de fen li ,gai ji shu ke kuai su fen li PSC,fen li shi jian you yuan lai de 1～3tian su duan dao 3xiao shi yi nei ,chu li jiao yuan dan bai liao ye ,cong yuan lai tou xi bu zu 1sheng di sheng dao yi ci ke chu li 45sheng 。suo de dao de gong gu yu yu lin mei rong xing Ⅰxing jiao yuan dan bai yi SDS-PAGEce ding chun du da dao 95%yi shang (dian yong chun ),ming ming wei gong gu yu yu lin Ⅰxing jiao yuan dan bai ,su xie wei PSC。2.PSCding liang fang fa de yan jiu cai yong ning jiao se pu (GC)he fan xiang gao xiao ye xiang se pu (RP-HPLC)jian ce PSCchun du ,jie guo biao ming :PSCda dao se pu chun ;cai yong RP-HPLC,yi feng mian ji gui yi hua fa ce ding ji chun du wei 94.00%±0.01%;yi zhi liang ping heng fa tui suan chu han liang wei 91.27%±0.01%,bing ji suan chu PSCyu qiang fu an suan zhi jian zhuai huan yin zi wei 11.24±0.26。tong guo gai zhuai huan yin zi ke yi ji suan yi ban tiao jian xia fen li huo de de PSChan liang 。3.PSCli hua xing zhi de biao zheng yun yong zhi pu 、guang pu 、se pu 、dian jing 、dian yong deng fen xi fang fa jiao wei quan mian de biao zheng PSCde li hua xing zhi 。zhen dui re wen ding xing ,shua ze wu shi nian du fa ce ding PSCde bian xing wen du wei 27.3℃,ling wai ,tong guo MALDI-TOFce ding PSCde que qie fen zi liang wei 288.2kDa;cai yong ICP-MSce ding PSCdan bai yang pin de chong jin shu han liang ,ce ding jie guo biao ming fu ge guo biao 。4.PSCde jie gou yan jiu cai yong quan chang zhuai lu zu ce xu (Full-length transcriptome sequencing)ji shu ,gou jian zhuan shu gong gu yu yu lin de CDSdan bai ku ;ling yi fang mian ,cai yong zhi bei se pu shou ji PSCzai RP-HPLCfen li de zhu feng liu fen ,jin hang dan bai jian ding 。jiang jian ding de tai duan bi dui CDSdan bai ku ,shai shua chu gong gu yu yu lin Ⅰxing qian jiao yuan dan bai de an ji suan xu lie ;gen ju tai duan fen bu qing kuang ,que ding gong gu yu yu lin mei rong xing Ⅰxing jiao yuan dan bai ,ji PSCde an ji suan xu lie 。yi NCBI、Uniprothe KEGGsan ge shu ju ku pan ding :PSCan ji suan xu lie de que shu yu Ⅰxing jiao yuan dan bai ,que ding PSCwei Ⅰxing jiao yuan dan bai 。Blast Tree Viewfen xi jie guo zheng shi :gong gu yu yu lin Ⅰxing qian jiao yuan dan bai α1lian he α2lian jun shu yu mu qian shang wei bei bao dao de ying gu yu de wei zhi dan bai 。Phyre2 Protein Fold Recognition Serveryu ce PSCde jie gou yu ren qian wei zhuang Ⅰxing qian jiao yuan dan bai lei shi 。jin yi bu yan jiu que ding le PSC α1ya ji de 96ge fu an suan qiang ji hua wei dian he 9ge lai an suan qiang ji hua wei dian ,yi ji α2ya ji de 84ge fu an suan qiang ji hua wei dian he 5ge lai an suan qiang ji hua wei dian ;bing jie zhu Netphos-3.1、NetGlycate 1.0he YinOYang1.2fu wu qi yu ce PSCan ji suan xu lie zhong lin suan hua he tang ji hua de ju ti xiu shi wei dian ,chu bu jie shi dan bai xiu shi zuo yong dui PSCfen zi liang 、rong jie xing he di kang yuan xing de ying xiang 。tong shi ,tong guo ABCpredfu wu qi yu ce gong gu yu yu lin Ⅰxing qian jiao yuan dan bai αlian Nduan he Cduan tai lian xu lie de kang yuan biao wei ,biao ming jiao yuan dan bai de Nduan he Cduan tai lian shi zhu yao de kang yuan jue ding cu 。ji yu quan chang zhuai lu zu ce xu ji shu gou jian de zhuan shu gong gu yu yu lin de CDSdan bai ku ,lun wen jin yi bu dui qin shui chao lv fen li qian hou de PSCchu di wu he PSCchun pin de SDS-PAGEjiao tiao jin hang dan bai jian ding ,jie guo xian shi ,qin shui chao lv fen li zhi qian de PSCchu di wu αlian jiao tiao zhong you 33ge za dan bai ,ji zhong ,α1lian shang you 26ge za dan bai ,α2lian shang you 13ge za dan bai ,6ge za dan bai zai α1lian he α2lian shang jun bei fa xian ,er qin shui chao lv fen li chun hua zhi hou de PSCchun pin (se pu chun )αlian jiao tiao zhong ze jin you 8ge za dan bai ,ji zhong ,α1lian shang you 6ge za dan bai ,α2lian shang you 3ge za dan bai ,1ge za dan bai zai α1lian he α2lian shang jun bei fa xian 。qin shui chao lv qian hou ,PSC α1lian zhong de za dan bai jun duo yu PSC α2lian zhong de za dan bai 。ben lun wen yi jiang suo you za dan bai de an ji suan xu lie yi yi lie ju ;bing tong guo Blast Tree Viewfen xi ,ji zhong you 25ge shang wei bei bao dao de dan bai 。yan jiu fa xian qin shui chao lv zhi qian de PSCchu di wu de αlian jiao tiao zhong ,ke neng cun zai 4chong guo min dan bai ——parvalbumin beta、tropomyosin alpha-1 chain、beta-enolasehe fructose-bisphosphate aldolase A,bing tong guo SWISS-MODELhe Phyre2 Protein Fold Recognition Serveryu ce le ta men de jie gou (jian fu tu )。er qin shui chao lv zhi hou de PSCchun pin de αlian jiao tiao zhong bing wei fa xian guo min dan bai de an ji suan xu lie ,zhe shui ming qin shui chao lv ji shu fen li huo de de PSCju you di kang yuan xing 。gen ju 《zhong guo yao dian 》(2015nian ban )de xiang guan gui ding ,di gong chu PSCyi wai ji ta za dan bai xiang xi de an ji suan xu lie ,hai tong guo SWISS-MODELhe Phyre2 Protein Fold Recognition Serveryu ce ta men chu bu de dan bai jie gou 。jie zhu an fan de wen suo diao yan he an ji suan xu lie bi dui PSCde jie gou yu jin hang fen xi yu gong neng yu ce 。fen xi PSCsan luo xuan jie gou wen ding xing de wei dian ,jin yi bu yu ce ji san luo xuan jie gou 。que ding ke neng cun zai yu zheng ge su (ITG)te yi xing jie ge de wei dian ;ke neng yu tang dan bai VI(GPVI)you zhao wei shu zhong duo de jie ge wei dian ;PSChai ke neng zhi jie jie ge ling wai liang chong jiao yuan dan bai shou ti ——bai xi bao xiang guan de mian yi qiu dan bai yang shou ti (LAIR)he pan zhuang jie gou yu shou ti (DDR),bing yu gan lou tang shou ti tong guo qian wei lian jie dan bai IIxing (FnII)jie gou yu jian jie jie ge 。ling wai ,PSCye ke neng yu xie guan xing xie you bing yin zi (VWF)、se su shang pi yan sheng yin zi (PEDF)、xie xiao ban fan ying dan bai (TSP)、fen zi ban lv Hsp47、dian fen yang qian ti dan bai (APP)、po gu xi bao xiang guan shou ti (OSCAR)yi ji gan su jun ke neng you jie ge wei dian 。zhe xie jie guo yu shi ben lun wen suo fen li huo de de PSCke neng ke yi can yu bing xie zhu bu tong shou ti 、dan bai he duo tang fa hui fu za de sheng wu xue gong neng ,wei jin hou gai jiao yuan dan bai de jin yi bu jin hang sheng wu gong cheng zu zhi cai liao he yao wu de yan jiu dian ding ji chu ;tong shi ,tong guo dui bi PSC α1lian he α2lian neng gou jie ge de shou ti 、dan bai he duo tang de chong lei ,α1lian yuan duo yu α2lian ,zhe chong jie guo yu shang yi jie PSC α1lian he α2lian zhong za dan bai de qing kuang yi zhi 。5.PSCgao xiao di qu ji shu yan fa cai yong di wen yun jiang ji shu yong lai di qu gong gu yu yu lin zhong de Ixing jiao yuan dan bai ,ke da fu du di gao jiao yuan dan bai de de lv ,suo huo de de PSCyu qian shu zhang jie de fen li chun du ce ding deng jun yi zhi ;bao shi kang yang hua huo xing ce ding jie guo xian shi :suo di qu huo de de PSCju you you yi de xi shi neng li yu bao shi neng li ;kang yang hua huo xing yu liu sheng dong wu yuan de shu wei Ixing jiao yuan dan bai he tong wei shui sheng dong wu yuan de san wen yu yu pi Ixing jiao yuan dan bai bi jiao ,ju you xian zhe cha yi 。jie guo biao ming ben lun wen yan jiu cong gong gu yu yu lin zhong gao xiao di qu zhi bei de PSCju you jiao hao de ying yong qian jing 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自南京中医药大学的陈思谨，发表于刊物南京中医药大学2019-07-25论文，是一篇关于无参考基因组论文,氨基酸序列论文,结构研究论文,亲水超滤技术论文,胶原蛋白定量论文,低温匀浆技术论文,南京中医药大学2019-07-25论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自南京中医药大学2019-07-25论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：无参考基因组论文; 氨基酸序列论文; 结构研究论文; 亲水超滤技术论文; 胶原蛋白定量论文; 低温匀浆技术论文; 南京中医药大学2019-07-25论文;