背根神经节持续受压论文-贾磊

导读:本文包含了背根神经节持续受压论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:慢病毒干扰,DRG原代神经元,钙离子成像,ERK

背根神经节持续受压论文文献综述

贾磊^[1]（2019）在《ERK-TRPV4通路在大鼠背根神经节持续受压致痛觉敏感中的作用机制研究》一文中研究指出背景早在 1994年,国际疼痛学会(International Association for the Study of Pain,IASP)曾将神经病理性疼痛(Neuropathic Pain,NP)定义为,由神经系统的原发性损伤,或功能障碍所激发货引起的异常疼痛,而其临床疼痛的特征是异常疼痛、痛觉过敏及自发性疼痛等。直到2008年,IASP的神经病理性疼痛相关的特别兴趣小组(NeuPSIG)提出,将其定义重新做出了定义,认为NP是指,由躯体感觉系统的损害、或疾病导致的疼痛,所以在2011年,国际疼痛学会将其定义进行了更新。NeuPSIG经过一系列统计分析,认为神经病理性疼痛的全球患病率,约为3.3%～8.2%。尽管国内还暂时没有针对神经病理性疼痛患者的相关生存质量的系统性研究数据,但神经病理性疼痛对于患者的生活质量的影响是不容忽视且显而易见的。长期的疼痛症状,不但会影响患者的睡眠、工作和生活能力,还会增加其患有抑郁、焦虑等情感障碍的比率。神经病理性疼痛通常上被分为周围性和中枢性两种类型,但是,不同类型的疼痛可能会具有相似或相同的发病机制。由于神经病理性疼痛的发病机制复杂多样,其中可能包括了解剖结构的改变,以及组织功能的受损等不同层面的变化,且经常是由多种机制引起的。可能涉及的机制具有多样化,可能涉及的病理变化亦较。其中值得重视的是,外周敏化和中枢敏化是参与神经病理性疼痛的重要发病机制,其中,中枢敏化是指脊髓及脊髓以上与痛觉相关的神经元的兴奋性异常升高,或者突触传递增强,也包含了多个病理改变。其相应的临床表现有自发性疼痛(spontaneous pain)、痛觉过敏(hyperalgesia)、痛觉敏感或痛觉超敏(allodynia)等。神经病理性疼痛是一个持续的过程,病情可能出现反复,患者需要经过长期治疗。然而,目前的治疗现状却不尽如人意,约一半左右的患有神经病理性疼痛患者,其疼痛症状不能充分得到缓解。目前,对于许多患者来说,神经性疼痛的治疗方法主要是药物治疗,其他治疗方法的应用具有挑战性的,且缺乏有效的。因此,亟需使用一些新的方法,以控制疼痛并改变其在临床治疗中的预后。在临床上,根性神经痛是一种常见的病理性神经痛的类型,而各种腰部疾患引起的相应节段的神经节或神经根压迫后,导致的疼痛是临床上最为常见的根性神经痛的类型。当脊髓背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)受到伤害性因素的刺激时,根性疼痛的症状被诱发产生,常见疾病有腰椎间盘突出、腰椎椎管狭窄、脊髓压迫及周围炎症等。我们课题组多年研究,总结改良了大鼠的背根神经节持续受压(chronic compression of DRG,CCD)模型,而CCD的动物模型作为一种较为成熟且典型的慢性神经痛模型,用于引发大鼠的根性神经痛,有效地模拟了在动物模型中神经病理性疼痛的痛觉改变。在大鼠CCD模型建立后,我们在行为学检测中发现,大鼠出现了机械痛敏、热痛敏和异常疼痛的现象。同时,DRG神经元出现异常兴奋,神经元细胞出现自发性放电增加,同时伴随着动作电位以及电流阈值的降低。这些变化可能是由调节细胞兴奋性、介导突触传递的某些离子通道和某些信号通路共同参与而完成的。因此,当离子通道功能或通路内蛋白激酶的表达受到抑制时,神经元的兴奋性可能会降低,从而缓解疼痛症状和不适。课题组先前的研究(基金号:81071597)发现,CCD后,大鼠的DRG中瞬时感受器-电位离子通道家族中的香草素受体亚家族中TRPV4(transient receptor potential vanilloid receptor 4)被异常激活,TRPV4参与了 CCD导致的DRG的高兴奋性、痛觉敏感和异常疼痛的发生。随后的研究(基金号:81401862),我们又发现,干预TRPV4的表达及功能,可以改变大鼠背根神经节持续受压导致的疼痛症状。然而,在参与痛敏的机制过程中,TRPV4的激活受到何种因素的调节以及干预,都需要进一步研究。DRG神经元是感觉传入的第一级神经元,疼痛的信息传导起始于DRG中的初级感觉神经元,我们也称之为伤害性感受器。DRG神经元在疼痛的信息传导过程中发挥着不可替代的重要作用,DRG神经元纤维的中枢端,将疼痛的伤害性信号传递到了位于脊髓背角神经元(第二级神经元),他们再发出神经纤维,组成脊髓丘脑侧束逐级向上。所以,在探索神经病理性疼痛的发生机制的过程中,不仅要研究外周敏化,中枢敏化参与疼痛的作用更加不能忽略。周围神经损伤可引起神经性疼痛,并使外周丝裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen-actived protein kinases,MAPKs)激活,并在DRG和脊髓背角组织中发生相应的磷酸化反应。MAPKs家族包含了叁类主要的成员,即细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p38和c-JNK,它们分别代表着叁个独立的信号通路。神经损伤发生后,ERK、p38和JNK都可以在脊髓背角及薄束核的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞,以及受损的大DRG神经元中均被激活,从而导致促炎或促痛介质的合成,增强和延长疼痛。特别是ERK,通过痛觉活性激活脊髓背角神经元,通过调节谷氨酸受体和钾离子通道的活性,诱导了多种基因的转录。近年来,已有文献报道,在多种神经性疼痛动物模型中,MEK1已被确定为治疗神经性疼痛的新靶点。ERK系与MEK1直接相连的下游分子,MEK1的一些药理学抑制剂,如PD198306、U0126和PD98059,已经被证明可以通过抑制ERK信号的激活来减轻疼痛。因此,靶向抑制ERK亦可以被认为是治疗神经性疼痛的一个较有前景的治疗靶点。基因治疗(gene therapy)具有巨大的治疗潜力,其特点在于作用位点在基因水平,它可以通过替换有缺陷或缺乏的蛋白,也可以通过靶向抑制相关蛋白表达的方法,将以前被归类为不可治疗的疾病或药物治疗疗效欠佳的疾病达到良好预后,甚至完全治愈。慢病毒介导的基因治疗可以提供一种独特的工具来整合小RNA干扰(RNA interference,RNAi)的表达构建,目的是局部抑制特定基因的表达,从而研究该改基因在某些指定信号通路中的功能。慢病毒介导的短探针RNA(shorrt hairpin RNA,shRNA)的载体方式,已被证明是一种长期且以剂量依赖的方式介导稳定的RNAi,因此为整合RNAi表达结构提供了一种方便的方法。例如,通过慢病毒载体转导shRNA可导致大脑中某特定基因表达的持续下调。因此,利用慢病毒稳定表达shRNA,是探索基因在体内功能和神经系统疾病基因治疗的有力手段。ERK与TRPV4共同参了多种病理性疼痛的发生机制,如原发性叁叉神经痛、颞下颂关节功能紊乱引起的咀嚼痛、以及骨关节炎疼痛等,但这些疼痛并非CCD引起的异常疼痛类型。早期的研究已证实,TRPV4的表达量在CCD手术后明显增加,TRPV4通道开放也随之增加,Ca2+的内流增加。研究证实了细胞内的Ca离子浓度的异常升高,促使MAPK家族各成员的活性被激活,MAPK家族的激活又可影响下游分子的生物学效应。随后的研究发现,CCD后P-ERK的表达量较正常组明显增加,ERK被激活后发挥其生物学效应,然而应用MEK1抑制剂U0126后,P-ERK的表达下调明显,改变了 DRG神经元的高兴奋性状态,其动作电位的电流阈值亦随之升高。TRPV4通道的开通引起的DRG神经元兴奋性增高可能也受到ERK表达和生物学功能的影响。本课题组前期研究已证实TRPV4-p38通路参与了CCD后神经病理性疼痛的发生和发展过程,且TRPV4与p38两者之间,亦存在着相互影响的作用关系。因此,我们推出TRPV4与ERK之间亦存在相互联系,继而探索ERK-TRPV4途径在大鼠CCD致痛觉敏感中的作用机制是亟待解决的,这将为靶向抑制ERK用于治疗神经病理性疼痛提供重要依据。第一部分ERK对大鼠背根神经节持续受压后背根神经节原代神经元中TRPV4表达及功能影响的研究目的1.构建慢病毒干扰ERK的shRNA载体并筛选干扰ERK表达的有效病毒片段,研究干扰ERK后是否会影响大鼠CCD后背根神经节原代神经元中TRPV4的表达及功能。2.研究大鼠背根神经节原代神经元中,TRPV4与ERK两者之间的相互联系是否存在。实验方法1.大鼠背根神经节持续受压模型的制作实验用的Wistar大鼠:体重约为150-180g,健康成年,雄性大鼠。以10%水合氯醛(大鼠体重,0.3mL/l00g)腹腔麻醉后,然后在两侧髂棘间切开大鼠背部的皮肤,切口约为2cm,充分暴露深筋膜和肌肉,暴露L4、L5节段的右侧椎间外孔后,选用形状类似“U”形的不锈钢钢棒,将其压迫在L4和L5对应节段的椎间外孔处。术后冲洗切口,逐层缝合。大鼠术后,未出现自残现象、感觉完全缺失及行走不能等现象。2.大鼠背根神经节原代神经元的培养应用腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后,减去心脏,酒精消毒后,放入超净台中,剪开椎管暴露椎间孔,迅速摘取DRG,尽量将与之相连的神经根去除干净,取出神经节置于盛有Hanks液的培养皿中且尽量置于冰袋上。取材完毕,吸出培养皿中Hanks液,经过0.25%胰酶在37℃水浴下消化30min并将其离心后,加入完全培养液。用预想处理过尖部吸管重新吹打,吹散后使用细胞筛网(密度为200目)进行细胞滤过,最终得到单细胞悬液。滴加单细胞悬液在已事先经多聚赖氨酸处理的细胞培养皿中,前后左右,呈“8”水平摇晃细胞板,后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育,培养液为含有15%含胎牛血清、100U/mL青链霉素、5umol/L阿糖胞苷等的完全培养基,培养12h至24h后细胞贴壁,备用。3.细胞免疫荧光技术与神经元鉴定大鼠DRG神经元提取并培养72h后,在培养板中将已爬好DRG神经元的玻片,经过4%多聚甲醛固定、0,5%Triton X-100通透、以及小鼠抗大鼠NeuN多克隆抗体(1:500,Abcam,USA)4℃过夜后。再用波长594荧光标记的驴抗小鼠IgG(H+L)-红色荧光二抗(1:450,Thermo Invitrogen,USA)37℃孵育30min,即用型DAPI染核剂染核,防荧光淬灭封片剂封片,观察并采集图像。4.慢病毒干扰ERK shRNA有效病毒片段的筛选及有效片段载体的转染首先,提取正常大鼠原代神经元,培养12-24h后,细胞换液加入含有慢病毒载体的全培养基,即慢病毒阴性对照组和4个不同的慢病毒干扰ERK shRNA片段,感染72小时后,观察细胞GFP(绿色)荧光。慢病毒转染5天后,提取各组细胞总蛋白及总mRNA,检测慢病毒干扰的转染效果。随后提取CCD手术4天后的大鼠DRG原代细胞,培养并给予有效片段载体的转染。5.DRG神经元的细胞活性检测提取原代DRG神经元,以1×104/孔的细胞密度接种于96孔培养板中,37℃、5%CO2的培养箱中培养,过夜后,细胞贴壁生长状态良好。采用MTT法检测慢病毒感染后24h、48h、72h、96h和120h,在波长490nm的吸光光度值(OD值),以正常培养基培养的DRG神经元的OD值作为100%,分别将各组样品的OD值与正常培养基培养的DRG神经元的OD值比较,得出其百分比。6.蛋白印记法测定DRG原代神经元中的蛋白表达情况收集各组细胞并提取总蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳法后,通过电转印的方式将蛋白条带转至PVDF膜。室温封闭后一抗4℃孵育过夜,二抗室温孵育后,化学显影。检测并评价慢病毒干扰ERK的转染效果,观察TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表达变化。7.Real-time quantitative PCR法提取各组细胞总mRNA,利用实时荧光定量PCR检测基因水平慢病毒干扰ERK表达的效果,检测慢病毒转染CCD后DRG原代神经元中ERK与TRPV4的总RNA的表达变化。8.钙离子成像技术慢病毒转染5天后,使用激光共聚焦显微镜观察荧光强度。首先将各组培养细胞的培养基吸出,等渗溶液冲洗3次。然后加入Fluo-3/AM,室温下负载45min,负载过程中轻轻摇晃促进染色。等渗液冲洗3次,以去除细胞外多余的Fluo-3/AM。不同刺激细胞内钙离子荧光强度测量,分别记录单个细胞最大荧光强度(Fmax)和最小荧光强度(Fmin),以计算细胞内Ca2+的相对浓度。观察DRG中钙离子浓度的变化。钙浓度变化以AF/F来表示,其公式为:AF/F=(F-Fbase)/(Fbase-B)。9.试剂对实验组给予干扰ERK shRNA序列(中国上海吉玛基因通用制药有限公司)。应用荧光钙指示剂染料氟-3/乙酰氧基甲基酯(Fluo-3/AM,Sigma,美国)进行钙成像。Trpv4抑制剂钌红(RR,Sigma,美国,推荐浓度=1μmol/L)和Trpv4激动剂4α-PDD(CST,美国,推荐浓度=3μmol/L)均溶解于二甲基亚砜(DMSO)。结果1.大鼠背根神经节原代神经元的鉴定原代DRG神经元细胞提取培养72h后,显微镜下观察,原代神经元胞体呈圆形、椭圆形和多角形,大部分细胞呈椭圆形和多角形,且胞体较大,细胞周围光晕明显台盼蓝染色实验显示>90%的细胞有活性。应用神经元标志性(Neuronal Marker)抗体NeuN和DAPI细胞核染色剂进行免疫细胞荧光染色,可以发现细胞中标记为红色荧光的细胞为DRG神经元细胞。2.慢病毒载体对DRG神经元细胞活性的影响根据吉玛慢病毒使用手册推荐的感染复数,选用MOI=5的推荐值,进行慢病毒感染DRG神经元细胞。慢病毒阴性对照感染DRG神经元,24h、48h、72h、96h及120h时,DRG神经元MTT检测发现,神经元的活性均未受影响。3.慢病毒干扰ERK shRNA有效病毒片段的筛选感染慢病毒72小时后观察细胞荧光,标记了 GFP(绿色)荧光的细胞占总细胞的比率>85%。感染慢病毒5天后,提取各组细胞总蛋白及总RNA。与空白对照组相比,慢病毒阴性对照组(Lv-shNC)的ERK的蛋白表达及mRNA无明显变化,即慢病毒载体对大鼠DRG原代神经元的ERK表达无明显影响;慢病毒干扰组Lv-shERK#1、Lv-shERK#3和Lv-shERK#4的ERK蛋白表达均明显下调,而Lv-shERK#2组无明显变化。Lv-shERK#1、Lv-shERK#3和 Lv-shERK#4的ERK1及ERK2的mRNA表达均明显下调(n=6,各组P<0.01),而其中Lv-shERK#1组转染效率最佳,基因及蛋白下调比例最佳;Lv-shERK#2组无明显变化。mRNA表达与蛋白表达的变化趋势相类似,进一步验证慢病毒干扰ERK表达的转染效果。筛选得到感染效率最佳的慢病毒片段为Lv-shERK(550-571,5'-GCTCTTGAAGACACAGCACCT-3')。4.大鼠DRG原代神经元细胞中TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表达变化感染慢病毒5天后,提取各组细胞总蛋白。CCD组与CCD+Lv-shNC组无明显差异;与CON组相比,CCD组TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表达增加;与Lv-shNC组相比,Lv-shERK组的TRPV4、ERK及P-ERK表达下降(n=6,各组P<0.01),慢病毒干扰ERK后,ERK明显下降的同时,TRPV4的蛋白表达随之亦下降。5.大鼠DRG神经元细胞相关mRNA表达的变化。感染慢病毒5天后,检测细胞的总RNA。与CON组相比,CCD组TRPV4、ERK1及ERK2在mRNA水平的表达增加;给予慢病毒干扰后,ERK1及ERK2表达明显下调,同时,TRPV4的mRNA水平亦下调(n=6,各组P<0.01)。这一变化趋势与相应蛋白表达变化相一致。6.CCD模型后大鼠DRG神经元细胞钙离子浓度的变化各组钙离子浓度变化的统计分析,CCD可引起30%低渗溶液和4α-PDD介导的DRG神经元内Ca离子浓度升高(n=6,各组均重复检测20次,与CON相比较),而正常大鼠DRG神经元去除细胞外液中的钙以及钌红(RR)可以抑制4α-PDD介导的Ca离子浓度升高。CCD手术后,DRG神经元钙离子浓度明显增加,而CCD后给予慢病毒转染干扰ERK,CCD+Lv-shERK组较CCD+Lv-shNC组明显下降,即与CCD+Lv-shNC组相比,慢病毒干扰ERK后明显抑制CCD后大鼠DRG神经元内Ca离子浓度的升高(n=6,各组均重复检测20次,P<0.01)。CCD+Lv-shNC组与CCD组无明显差异。结论1.大鼠DRG神经元的特异性慢病毒干扰ERK的shERK有效片段为ERK-shRNA(550-571,5'-GCTCTTGAAGACACAGCACCT-3')。2.大鼠DRG原代神经元中TRPV4与ERK存在相互影响关系,利用慢病毒干扰靶向抑制ERK,大鼠DRG原代神经元的TRPV4的表达及功能均发生改变。第二部分:ERK-TRPV4通路参与大鼠背根神经节持续受压致痛觉敏感的周围敏化与中枢敏化的研究目的1.研究ERK-TRPV4通路是否参与大鼠背根神经节持续受压后痛觉敏感的发生与发展。2.研究ERK-TRPV4通路是否参与大鼠背根神经节持续受压后痛觉敏感的外周敏化与中枢敏化的机制中。方法1.实验动物及动物模型健康成年雄性Wistar大鼠(山东大学实验动物中心),体重约150-180g,动物实验已经经过山东大学实验动物伦理委员会批准。动物模型制作的方法与第一部分相同。2.鞘内注射慢病毒载体小动物麻醉机吸入性麻醉。大鼠背部剃毛、皮肤消毒后鞘内注射。以双侧髂棘连线的中点处,定位L4与L5间的椎间隙,向下一个椎间隙进针。微量注射器的针头垂直刺入椎间隙,进针时感到有突破感,此时,大鼠出现快速甩尾想想,表明针头已进入蛛网膜下腔。轻轻回抽,如无血液回流,即可缓慢推注,每只大鼠每次注射药物的体积均为10uL,注射的速度应小于2uL/秒。迅速抽出注射器针头抽出,按压注射部位以防脑脊液漏出。停止吸入麻醉后2min至5min,大鼠恢复翻正反射。3.大鼠行为学检测(1)观察大鼠术后自然状态下,随意运动的步态情况,进行评定并评分,只使用步态正常且无足畸形的大鼠,即评分为1分的大鼠用于后续实验。(2)机械刺激缩爪反应阈值的检测:使用BME-404型电子式机械刺激测痛仪进行测试,温度适宜,安静明亮。将大鼠置于0.5cm×0.5cm的金属网格之上。大鼠适应环境10分钟后,进行测试。垂直向上刺激大鼠后肢足趾间皮肤,大鼠如出现缩爪并记录刺激阈值。每只大鼠需测试5次,每次刺激的间隔时间为5min,最终取其平均值作为统计数据量。(3)热刺激缩爪反应潜伏期的检测:使用BME-410C型热痛刺激仪进行测试。预先将热痛刺激仪至于0.5cm×0.5cm的金属网格下方,将大鼠发在金属网格之上,使得热光源聚焦照射于大鼠后肢足底掌心,电子秒表计时,记录从热辐射照射开始至大鼠后肢回缩的时间,即为热刺激缩爪反应潜伏期。每只大鼠需测试5次,每次刺激的间隔时间为5min,最终取其平均值作为统计数据。4.大鼠慢病毒鞘内注射滴度的确定为了避免慢病毒载体中绿色荧光GFP对后续实验的影响,大鼠鞘内注射采用了无GFP的慢病毒介导的RNAi表达系统。取实验大鼠随机分为5组,分别给予生理盐水、shRNA 10^4 病毒单位(toxic units,TU)、10^5 TU、10^6 TU和10^7 TU,每组各位6只大鼠。各组中,每只大鼠鞘内注射体积均为10uL,连续注射3天。自第1天注射开始计算,第5天时,生理盐水心脏灌注后取材。随后利用Western Blot及RT-qPCR的方法,进行检测并评价慢病毒鞘内注射的效果从而确定慢病毒的注射滴度。5.蛋白印记法测定CCD后DRG及脊髓背角组织中的蛋白表达手术侧L4及L5背根神经节以及相应节段的脊髓背角,提取总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳法使蛋白分离,转印蛋白至PVDF膜,室温封闭、一抗及二抗孵育后显影。检测鞘内注射慢病毒干扰ERK后,DRG及脊髓背角组织中TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表达变化。6.实时定量荧光PCR测定DRG及脊髓背角组织中mRNA的表达变化手术侧L4及L5背根神经节及相应节段的脊髓背角,快速取材,提取总RNA,测定浓度。利用Real-time quantitative PCR检测DRG及脊髓背角组织中TRPV4、ERK1及ERK2的mRNA表达变化。各指标的引物序列同第一部分。7.免疫共沉淀使用IP-WB裂解液,提取DRG和脊髓背角的组织总蛋白后,采用Prorein A-argarose方法,分别用anti-TRPV4抗体和anti-ERK抗体与之反应,进行免疫共沉淀结合。沉淀后的复合物利用蛋白印记法进行分析,分别观察各组中是否存在所需目的蛋白。8.脊髓和DRG的免疫组织化学染色一抗为:anti-NeuN 多克隆抗体(小鼠抗大鼠,1:300,Abcam,USA);anti-ERK多克隆抗体(兔抗大鼠,1:500,CST,USA);anti-P-ERK多克隆抗体(兔抗大鼠,1:200,CST,USA);anti-TRPV4多克隆抗体(兔抗大鼠,1:200,Abcam,USA)。二抗为:辣根过氧化物酶标记-山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记-山羊抗兔IgG(北京义翘神州科技有限公司)。经DAB显染色和苏木素染核后,观察目的蛋白的组织定位。9.脊髓和背根神经节ERK-TRPV4免疫荧光双标染色一抗分别为:小鼠抗大鼠ERK多克隆抗体(1:500,CST,USA),采用兔抗大鼠TRPV4多克隆抗体(1:200,Abcam,Cambridge,,UK)。二抗为:488(绿色)荧光标记的驴抗小鼠-IgG(H+L)和594(红色)标记的驴抗兔-IgG(H+L),采用防荧光淬灭封片剂的DAPI染剂封片,观察并采集图片,计数阳性细胞并分析共同表达阳性细胞比率。10.脊髓NeuN-ERK和NeuN-TRPV4免疫组织荧光双标染色采用NeuN神经元标记物标记脊髓背角的神经元细胞,一抗分别为:小鼠抗大鼠NeuN多克隆抗体(1:300,Abcam,USA);兔抗大鼠ERK多克隆抗体(1:500,CST,USA);兔抗大鼠TRPV4多克隆抗体(1:200,Abcam,USA)。二抗为 488(绿色)标记的驴抗小鼠-IgG(H+L)和594(红色)标记的驴抗兔-IgG(H+L),采用防荧光淬灭封片剂的DAPI染剂封片。高倍镜下观察神经元形态,同时统计计算阳性神经元细胞比率。结果1.正常大鼠鞘内注射慢病毒及滴度确定由于10^7 TU组,鞘注后死亡4只,死亡率大于50%,该病毒滴度不利于大鼠的正常生存,取消该分组。其余各组未出现大鼠死亡。鞘内注射慢病毒ERK干扰载体后5天,Western Blot检测发现10^6组ERK表达均明显下调(n=6,P<0.05,与CON组比较),而10^4组和10^5组无明显变化。RT-qPCR检测发现,10^6 TU组的ERK1和ERK2的mRNA表达均明显下调(n=6,P<0.01,与CON组比较)。通过ERK总蛋白及mRNA含量测定以观察ERK干扰效果,10^6 TU即为慢病毒转染载体实验有效滴度。2.机械刺激缩爪反应阈值和热刺激缩爪反应潜伏期的变化连续14天的行为学检测发现,大鼠CCD模型术后,机械刺激缩爪反应阈值自第2天开始,出现下降,与CON组相比较,CCD组第4天到第10天机械刺激缩爪反应阈值的显着降低(n=6,P<0.01)。给予鞘内注射慢病毒ERK shRNA干扰后第2天,机械刺激缩爪反应阈值较慢病毒阴性对照组显着提高(n=6,P<0.01),慢病毒阴性对照组与CCD组不显着差异。CCD术后第2天开始,大鼠热刺激缩爪反应潜伏期开始下降,与CON组相比较,CCD组第4天到第12天机热刺激缩爪反应潜伏期的显着降低(n=6,P<0.01)。给予鞘内注射慢病毒ERK shRNA干扰后第3天,热刺激缩爪反应潜伏期较慢病毒阴性对照组显着提高(n=6,P<0.01),慢病毒阴性对照组与CCD组不显着差异。3.CCD大鼠鞘内注射慢病毒ERK shRNA干扰后蛋白表达的变化大鼠DRG及脊髓背角的CCD组与CCD+Lv-shNC组均无明显差异;分别比较两种组织中蛋白,与CON组相比,CCD组TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表达均增加(n=6,P<0.01);与CCD+Lv-shNC组相比,CCD+Lv-shERK组TRPV4、ERK及P-ERK均表达下降(n=6,P<0.01)。4.TRPV4和ERK1/2的mRNA基因检测大鼠DRG及脊髓背角的CCD组与CCD+Lv-shNC组均无明显差异;分别比较两种组织mRNA水平的表达发现,与CON组相比,CCD组TRPV4、ERK1及ERK2在mRNA水平的表达上调(n=6,P<0.01);给予慢病毒干扰后,ERK1和ERK2明显下调,而TRPV4亦伴随ERK的变化而变化,TRPV4的mRNA表达明显下调(n=6,P<0.01,与阴性对照相比较)。5.脊髓背角和DRG组织免疫共沉淀经过anti-TRPV4抗体共沉淀反应后,免疫复合物进行Western Blot检测分析,可检测到TRPV4和ERK蛋白,即表明在脊髓背角和DRG中ERK可被TRPV4抗体沉淀。同时,anti-ERK抗体沉淀的免疫复合物,亦可检测到TRPV4和ERK蛋白,即表明在脊髓背角和DRG中TRPV4可被ERK抗体沉淀,ERK与TRPV4之间存在密切联系。6.免疫组织化学染色法定位DRG组织中NeuN、TRPV4和ERK的分布正常大鼠DRG组织中,NeuN标记的神经元细胞,TRPV4、ERK及P-ERK在DRG中主要分布于大、中型神经元细胞中。7.免疫组织化学染色法定位脊髓背角组织中NeuN、TRPV4和ERK的分布正常大鼠的脊髓背角中,NeuN标记的神经元,TRPV4和ERK、P-ERK标记的细胞均在大鼠脊髓背角的灰质的第I至IV层中均表达及分布。8.CCD后ERK和TRPV4在背根神经节和脊髓背角的阳性细胞数的变化ERK和TRPV4荧光标记的阳性细胞在手术侧和非手术侧均有分布。相较于非手术侧,手术侧的脊髓背角内TRPV4阳性细胞数目和ERK阳性细胞数目,统计技术后均明显较多(n=6,P<0.01)。进而分析ERK和TRPV4共同表达的阳性细胞数,手术侧明显高于对侧(n=6,P<0.01)。9.CCD后TRPV4和ERK在脊髓背角的蛋白表达变化手术侧脊髓背角大鼠背根神经节持续受压后第2至第10天,TRPV4表达升高,同时伴随ERK及P-ERK的表达升高,差异有显着性意义。非手术侧,各组与对照组相比,差异无统计学意义。10.ERK和TRPV4在脊髓背角的阳性神经元比率的变化NeuN神经元标记物标记脊髓背角的神经元细胞,在大鼠脊髓背角的神经元细胞质及细胞核内ERK和TRPV4均有表达,与非手术侧相比,手术侧表达NeuN-ERK和NeuN-TRPV4的阳性神经元百分比同时明显增加(n=6,P<0.01)。结论1.ERK-TRPV4通路参与大鼠背根神经节持续受压致痛觉敏感的发生机制。2.慢病毒干扰ERK后可缓解CCD诱导的痛觉敏感,同时伴随背根神经节和脊髓背角中TRPV4的表达下降。3.大鼠背根神经节持续受压后,手术侧脊髓背角内ERK和TRPV4蛋白表达上调及阳性神经元比率增多,且两者在DRG和脊髓背角共定位的阳性细胞增加,两者之间存在相互联系,ERK-TRPV4通路参与了CCD后痛觉敏感的DRG周围敏化和脊髓中枢敏化的机制。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-20）

曲玉娟,张晓,魏慧,怀娟,张杨^[2]（2017）在《大鼠背根神经节持续受压后脊髓背角TRPV4蛋白表达及分布的变化》一文中研究指出目的:探讨大鼠背根神经节持续受压(chronic compression of the dorsal root ganglion,CCD)后瞬时感受器电位离子通道香草素亚族受体4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)在脊髓背角中的蛋白表达及分布规律。方法:选取清洁级雄性Wistar大鼠30只,按随机数字表法分组:空白对照组5只,手术组25只(术后4天、7天、14天、28天各5只;免疫荧光组5只)。制备大鼠背根神经节持续受压模型,于术后4天,7天,14天及28天,测量机械刺激缩爪反应痛阈,观察机械痛阈的变化;利用western blot技术检测空白对照组及术后4天,7天,14天及28天,手术侧及对侧脊髓背角TRPV4蛋白表达的变化;利用免疫荧光技术检测术后4天,手术侧与对侧脊髓背角TRPV4阳性细胞分布。结果:大鼠背根神经节持续受压后4—14天,机械痛阈值明显下降(P<0.001);术后4—7天,手术侧脊髓背角TRPV4表达升高(P<0.01),对侧无明显变化;手术侧脊髓背角内TRPV4阳性细胞数目高于对侧(P=0.0008)。结论:大鼠背根神经节持续受压后,机械痛阈下降的同时,手术侧脊髓背角内TRPV4蛋白表达上调及阳性数目增多,TRPV4可能参与CCD后病理性神经痛的中枢敏化机制。(本文来源于《中国康复医学杂志》期刊2017年02期）

张晓,曲玉娟,贾磊,滕永波,岳寿伟^[3]（2017）在《大鼠脊髓背角TRPV4在背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用》一文中研究指出目的:探讨大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)持续受压(chronic compression of right side dorsal root ganglion,CCD)后脊髓背角瞬时感受器电位离子通道4(TRPV4)基因及蛋白变化,明确脊髓背角TRPV4在CCD致神经病理性疼痛中的作用。方法:采用健康成年雄性Wistar大鼠,共36只,随机分为3组,分别为空白对照组、CCD手术组、CCD+钌红组。制备大鼠背根神经节持续受压模型,于术前1天、术后第7天、给药前及给药2h后,测量大鼠机械刺激缩爪反应阈值,观察机械痛阈的变化;利用RT-PCR及Western Blot技术检测各组大鼠手术侧脊髓背角TRPV4基因及蛋白表达的变化。结果:与空白对照组相比,术后第7天,CCD组大鼠术侧机械痛阈值明显下降(P<0.001),同侧脊髓背角TRPV4基因及蛋白表达升高(P<0.05);与给药前相比,给予钌红2h后,术侧机械痛阈值明显升高(P<0.001),同侧脊髓背角TRPV4基因及蛋白表达下降(P<0.05)。结论:CCD后大鼠术侧机械痛阈下降,脊髓背角TRPV4基因及蛋白表达升高;钌红可部分逆转CCD后痛觉过敏,部分降低脊髓背角TRPV4基因及蛋白表达。脊髓背角TRPV4参与CCD后大鼠神经病理性疼痛形成。(本文来源于《中国康复医学杂志》期刊2017年02期）

曲玉娟^[4]（2016）在《TRPV4-MAPK通路在大鼠背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用机制研究》一文中研究指出背景神经病理性疼痛(Neuroapthic pain, NP)在2008年被国际疼痛学会(Intrenational Association for the Study of pain, IASP)下设的神经病理性疼痛特别兴趣小组(NeuPSIG)将神经病理性疼痛更新定义为由躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛。神经病理性疼痛按照损伤部位可分为周围性疼痛及中枢性疼痛两种类型。常见的周围性神经病理性疼痛有：叁叉神经痛、根性神经病变(颈、胸或腰骶)、带状疱疹后神经痛、糖尿病周围神经病变、嵌压性神经病变(腕管综合征等)、创伤后神经痛、残肢痛等等；常见的中枢性神经病理性疼痛有：脑卒中后疼痛、脊髓空洞症疼痛、脊髓损伤性疼痛、缺血性脊髓病疼痛、压迫性脊髓病(脊髓型颈椎病、肿瘤)疼痛等等。神经病理性疼痛的产生有很多原因,临床特点为：1、自发痛：是指在没有外伤及损伤性刺激的情况下,局部区域可出现疼痛；2、非伤害性刺激即可引起疼痛：疼痛可因为轻微的刺激或微小的温度变化而诱发；3、痛觉过敏-机体对正常致痛刺激可出现较强的痛觉反应；4、疼痛的性质多种多样：疼痛可表现为牵扯样痛、电击样痛、针刺样痛、烧灼样痛等；5、异常感觉：可出现感觉迟钝、麻木、瘙痒感等不适症状。而神经病理性疼痛的发病机制也相当复杂,最主要的原因可能由于神经系统解剖结构的改变以及神经功能受损,从而引起外周和/或中枢敏化、背根神经节或脊髓内的胶质细胞活化、脑干或大脑皮层下行的抑制系统失能、神经元细胞离子通道发生改变等等,从而导致神经损伤、神经源性炎症、神经末梢兴奋性改变、交感神经系统异常以及神经的可塑性改变等等一系列的病理生理变化,最终引发各类的疼痛表现。神经病理性疼痛2008年IASP推荐的诊断标准为：1、疼痛有明确的神经解剖范围；2、病史提示患者的周围或中枢感觉神经系统中存在相关的疾病或损害；3、至少有一项辅助检查证实了疼痛的分布范围符合神经解剖的范围；4、至少有一项辅助检查证实存在疼痛相关的神经系统的疾病或损害。目前,临床上对神经病理性疼痛的治疗效果欠佳,一线用药为加巴喷丁、普瑞巴林等钙离子拮抗剂以及抗抑郁药物,也可给以卡马西平、奥卡西平等钠通道阻断剂或局部给予利多卡因治疗,但临床上约有一半的患者疼痛不能得到有效缓解。根性神经痛是一种临床上较为常见的神经病理性疼痛类型,它的发生是由于脊神经根或神经节受到某些伤害性刺激(如腰椎间盘突出、脊髓肿瘤的压迫、腰椎管狭窄或炎性物质的刺激等)导致神经炎症、兴奋性增强而引起的疼痛。大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)持续受压(chronic compression of DRG, CCD)模型是实验研究中典型的神经病理性疼痛模型,造模成功后,CCD大鼠可出现自发性的疼痛、机械痛敏、热痛敏和异常疼痛,并且伴随有神经元自发性放电的增加、动作电位降低,且出现电流阈值降低。DRG神经元细胞膜上存在有多种离子通道,其中一种跨膜的离子通道：瞬时感受器电位离子通道家族中香草素受体亚家族4(transient receptor potential vanilloid receptor 4, TRPV4)的作用越来越受到关注。我们前期的研究(国家自然基金项目30472006)发现TRPV4参与了CCD导致的DRG的高兴奋性、痛觉过敏和异常疼痛,乔内注释TRPV4反义核苷酸干扰序列后,CCD导致的疼痛阈值的降低可被部分逆转,而对大鼠的基础疼痛阈值无影响。但TRPV4传导CCD大鼠痛觉过敏和异常疼痛的通路机制和分子基础还有待进一步研究。DRG是感觉信号传入通路上的第一级神经元,CCD模型中DRG神经元持续受压,导致神经元胞体兴奋性增加,电活化之后产生大量持久的异位放电,上行可引起脊髓和高位中枢的敏化,从而引起自发疼痛、痛觉过敏及触诱发痛等神经病理痛症状,所以说,DRG可以称为神经病理性痛的信号源；抑制损伤后DRG神经元的异位放电可以抑制慢性疼痛信号。产生放电的神经纤维主要包括介导刺痛的细的有髓鞘的Aδ类轴突纤维和介导灼痛的无髓鞘的C类纤维,且不同神经纤维在不同状态下的放电形式不同。我课题组先前的实验证明(基金号：81071597),TRPV4参与CCD模型中DRG的异常放电,但其传导异常放电的机制尚未明确；且TRPV4介导的DRG异常放电以哪类纤维为主,以及TRPV4的激活对放电形式的影响都需进一步研究。疼痛的传导起始于背根神经节中的初级感觉神经元,经神经纤维的中枢端将伤害性信息传向脊髓背角,传入神经纤维的中枢端止于脊髓背角的中间神经元,中间神经元再发出上行神经纤维组成脊髓丘脑侧束等痛觉传导束,进一步将伤害性信息上传至背侧丘脑和大脑皮层,经加工整合最后产生痛觉。在CCD模型中,对DRG的慢性压迫,使其缺血、水肿,促进炎性介质释放,引起DRG神经元的兴奋性增高,将伤害性刺激信号传入脊髓背角,进而兴奋脊髓背角,产生痛敏和异常疼痛。脊髓背角神经元的过度兴奋,可能参与CCD后神经病理性疼痛的中枢敏化机制。本课题组前期的研究主要着眼于CCD后的外周敏化机制的研究,但脊髓背角作为伤害性信息传导通路中不可或缺的重要组成部分,亟需进一步的研究。也有研究表明外周组织及神经的炎症使脊髓内TRPV1、TRPA1及TRPM8表达上调,而有关TRPV4在脊髓背角处的变化与疼痛信号传递的研究甚少。外周丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinases, MAPKs)系统广泛存在于神经系统中,主要包括ERK(胞外信号调节激酶)、JNK(c-jun氨基末端蛋白激酶)和p38(高渗甘油反应激酶)叁个亚系统,以磷酸化形式来发挥生物效应。MAPK信号通路分子接受细胞表面的受体传递的胞外刺激,并将其转化为胞内的转录和翻译后反应,从而将胞外刺激同胞内关键的调节目标联系起来,在细胞内信号转导通路中发挥关键作用。研究证实,MAPK信号通路与神经病理性疼痛的形成与发展密切相关。在炎性痛、神经瘤疾病、脊髓损伤以及部分神经病理性疼痛模型的病理生理机制中,外周丝裂原活化蛋白激酶家族(ERK、JNK和p38)通过对现有蛋白的表达后修饰以及对一些关键基因在表达时的转录调节,进而以其磷酸化形式来对在外周伤害感受器或者背角神经元产生的痛觉起维持和放大作用,而且局部注射MAPK家族的抑制剂可以明显抑制机械和热痛觉过敏。在CCD大鼠中,p-ERK的表达增加,抑制p-ERK的表达可导致DRG神经元的兴奋性降低。CCD模型中,DRG持续受压后,TRPV4基因、蛋白的表达量增加,低渗溶液和4 α-PDD引起的TRPV4通道开放增加,通过TRPV4的电流内流增加,细胞内钙峰值升高。研究表明,细胞内Ca2+的升高可以使MAPK家族激活和磷酸化,从而介导MAPK发挥其生物作用。如离体和在体研究均证实细胞内Ca2+浓度升高可使p38MAPK激活和磷酸化,从而介导机械痛敏及炎性痛敏。在染色体隐性多囊性肾病中,TRPV4亦可通过调节胆管上皮细胞内Ca2+的水平进而调节B-Raf/ERK的活性和表达。有研究表明C类纤维受到刺激时,ERK和P38发生磷酸化和活化,而A类纤维受到刺激时,ERK亦有部分磷酸化。CCD模型中, p-ERK表达增加,应用U0126抑制p-ERK的表达可导致DRG神经元的兴奋性降低,产生动作电位的电流阈值和平均基强度升高。因此,我们猜测,CCD模型中,TRPV4参与了DRG持续受压所致神经病理性疼痛的外周敏化及中枢敏化机制,其中TRPV4通道的变化可调节MAPK通路的活性和表达,进而调节其在神经病理性疼痛外周敏化中的生物作用。基于以上研究进展,本研究采用神经纤维电生理技术、Real-time PCR、 Western Blot、免疫组织化学及免疫荧光等方法研究TRPV4-MAPK途径在CCD模型所致痛敏和DRG神经元异常放电中的作用,同时研究了脊髓背角内TRPV4蛋白表达及分布的变化,以期为神经病理性疼痛的发生探讨新理论。第一部分：TRPV4-p38 MAPK通路在大鼠背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用目的1.研究干预TRPV4及p38 MAPK通路是否会影响大鼠背根神经节持续受压所致神经病理性疼痛。2.研究大鼠背根神经节中TRPV4与p38 MAPK是否存在相互影响关系。方法1.大鼠背根神经节持续受压模型制作采用体重约为180-220g的健康成年雄性Wistar大鼠(购自山东大学实验动物中心),以水合氯醛(0.3ml/l00g体重)腹腔麻醉后,暴露右侧L4及L5椎间外孔,将直径0.63mm“L”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁与脊柱斜向上成30。角插入椎间孔内,另一端位于椎间孔外。术后用生理盐水冲洗切口,依次缝合肌肉、腰背筋膜和皮肤,术中采用无菌操作,术后给予青霉素腹腔注射以预防感染。剔除术后出现自残现象或出现感觉完全缺失的大鼠。2.鞘内注射以异氟烷和氧气混合吸入麻醉大鼠。大鼠皮肤消毒后,以双侧髂棘连线与脊柱的交点定位L4/L5椎间隙,向下一椎间隙及L5/L6椎间隙进针,微量注射器针头沿食指尖端刺入椎间隙(针头方向略偏向前方),至有突破感,大鼠出现侧向快速甩尾,表明进入蛛网膜下腔,小心回抽,无血液回流,以1ul/s的速度缓慢推注,鞘注完毕后快速抽出微量注射器,按压注射部位约lmin,防止脑脊液漏出。结束操作,停止吸入麻醉,大鼠lmin内可恢复翻正反射。3.神经行为学测定-机械刺激缩爪反应痛阈的测量室温25℃,安静明亮,将大鼠置于长*宽*高分别为40cm*20cm*40cm的红色半透明玻璃笼内,底部及顶部无玻璃覆盖,底部铺以0.5cm*0.5cm的金属网格。大鼠适应环境20分钟后,以BME-404型电子式机械测痛仪进行测试。以针刺端垂直刺激大鼠足底第叁、四趾间皮肤,大鼠出现缩爪或舔足现象视为阳性,记录刺激数值(G),每次刺激间隔5min,连续测5次,取其平均值作为统计变量。4. TRPV4和P38蛋白含量测定选取大鼠术侧L4及L5背根神经节,冰上快速取材,提取总蛋白,采用SDS-PAGE凝胶电泳方法分离蛋白,将分离后的蛋白条带转印至PVDF膜,用5%牛奶室温封闭2h,4℃一抗孵育过夜,二抗孵育2小时,显影。检测CCD术后及给予各激动剂和抑制剂后大鼠背根神经节TRPV4及P38表达变化。5.大鼠背根神经节神经元TRPV4及P38免疫组织化学染色处死大鼠,用预冷的生理盐水和4%多聚甲醛依次灌注,先快后慢,待灌注液清亮后,快速冰上取出术侧L4及L5背根神经节,制作石蜡切片,92-98℃抗原修复15分钟,兔抗大鼠TRPV4及P38一抗4℃孵育过夜,HRP结合的二抗室温孵育2小时。DAB染色,苏木素复染,进行TRPV4及P38蛋白定位。6.异位放电记录造模后3-8天,大鼠水合氯醛腹腔麻醉(0.3ml/100g),小心去除腰骶段椎板,充分暴露腰膨大、马尾及L5背根神经节,切断L5外周端及周围交通支,以中断外周及其他节段的感觉传入；将大鼠背部两侧皮肤悬吊,形成浴槽,浴槽内加入适量37℃的人工脑脊液；分离L5神经节前纤维,轻放于引导电极上,用37℃的液体石蜡覆盖,参考电极刺入大鼠骶尾部皮下,通过BL-420E生物机能实验系统记录神经放电。结果1.鞘内注射激动剂及抑制剂后CCD大鼠机械刺激缩爪反应阈值的变化CCD术后第二天大鼠机械刺激缩爪反应阈值明显下降,持续至14天(P<0.01),之后恢复至正常水平。给予RR和SB203580后,与盐水组相比,机械刺激缩爪反应阈值增高。给予4 α-PDD和anisomycin后,机械刺激缩爪反应阈值明显降低。药物注射后2小时,反应最明显,没有明显的剂量依赖性。2.CCD大鼠鞘内注射激动剂和抑制剂后TRPV4和p38蛋白表达的变化RR和4 α-PDD的使用浓度分别为1 nmol/L,10 nmol/L和100 nmol/L; SB203580的使用浓度为10 μmol/L,20 Wnol/L和40 μmol/L; anisomycin的使用浓度为5 μg/mL,25 μg/mL和40 μg/mL.鞘内注射1、2、4、8小时后检测TRPV4, p38和P-p38的表达变化。对照组CCD大鼠鞘内注射等体积生理盐水。TRPV4, p38和P-p38的表达可被RR明显抑制(2-4 h for TRPV4; 1-8 h for p38 1-4 h for P-p38), RR对TRPV4和p38蛋白表达的影响具有剂量依赖性。鞘内注射4α-PDD后,TRPV4蛋白表达增高(2h),同时p38和P-p38的表达也上调,且具有剂量依赖性。鞘内注射SB203580可显着抑制p38和P-p38 (4 h for p38; 2-4 h for P-p38)的蛋白表达,但TRPV4 (1-8 h)的表达明显上升且不具有剂量依赖性。鞘内注射anisomycin后；p38蛋白表达显着增高(1-2 h),TRPV4的表达显着降低(1-8h),P-p38的表达无明显变化,无明显的剂量依赖性。3.CCD大鼠鞘内注射TRPV4和P38激动剂或抑制剂后蛋白分布的变化背根神经节内大、中、小神经元细胞内TRPV4和p38均有阳性表达(small < 30 μm, middle 30 μm-40 μm, large> 40 μm)。 CCD术后阳性细胞数目增加,并可被鞘内注射的激动剂或抑制剂影响。计数分析结果显示,TRPV4阳性的小体积神经元及总神经元数目明显增加(P<0.01,与对照组相比)。鞘内注射RR和SB203580后,TRPV4阳性的小体积神经元及总神经元细数目减少(P<0.01)。鞘内注射anisomycin后,与对照组相比,总的阳性细胞数目增加(P<0.01)。与对照组相比,CCD大鼠大、中、小体积的P38阳性细胞数目均明显增加,(P< 0.05, large; P< 0.01, medium, small and total)。鞘内注射SB203580后,P38阳性的小体积神经元和总神经元细胞数目均明显减少(P<0.01),鞘内注射4 α-PDD (P< 0.01)和anisomycin后(P<0.01)P38阳性的小体积神经元和总神经元细胞数目均明显减少。4.鞘内注射TRPV4和P38激动剂或抑制剂对背根神经节异位放电的影响。正常对照大鼠很少出现异位放电,各组间异位放电的频率无明显差异。然而,RR组及SB203580组放电幅度明显减低(P<0.01),4α-PDD和anisomycin组放电幅度明显增加(P<0.01)。结论1.干预TRPV4及p38 MAPK通路可影响大鼠背根神经节持续受压所致神经病理性疼痛的程度,TRPV4及p38 MAPK参与了CCD后神经病理性疼痛的形成。2.大鼠背根神经节TRPV4与p38 MAPK存在相互影响关系。第二部分：MAPK通路参与介导大鼠背根神经节持续受压后的神经病理性疼痛目的研究MAPK通路是否参与大鼠背根神经节持续受压后神经病理性疼痛的形成与发展实验动物及方法1.实验动物及造模健康成年雄性Wistar大鼠,购自山东大学实验动物中心,体重180-2208,室内层流滤菌,室内温度20+-2℃,每笼两只,维持12小时昼夜节律,水、食持续供给。大鼠笼内饲养适应环境7天后开始进行后续实验。所有动物实验已经经过山东大学实验动物伦理委员会批准。采用10%水合氯醛(300mg/100gi.p.)腹腔注射,将不锈钢棒插入右侧L4、L5椎间外孔,假手术组手术方式同手术组,仅不插入钢棒。剔除出现自噬、感觉缺陷及残疾的大鼠。2.行为学测试于术前、术后4天及给药后2小时进行机械刺激缩爪反应阂值测定。采用BEM-404型机械刺激仪(中国医学科学院研制)检测机械刺激缩爪反应阈值的变化。将刺激针对准大鼠足底第叁、四足趾间皮肤,缓慢均匀施加刺激力,出现缩爪或舐足为阳性反应,记录此刻施加的力,间隔5min再次测试,重复5次,取平均值。3.蛋白免疫印迹术后4天,鞘内注射MAPKs抑制剂后2小时,处死大鼠,冰上快速取术侧L4、L5背根神经节。提取总蛋白,采用5%及10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,转印至PVDF膜上,5%牛奶室温封闭2小时,一抗4℃孵育过夜,HRP结合的二抗室温孵育1小时,发光显影。一抗为兔抗大鼠ERK多克隆抗体(1:1000, CST, USA),兔抗大鼠p-ERK多克隆抗体(1:2000, CST, USA),兔抗大鼠JNK多克隆抗体(1:1000, CST, USA),兔抗大鼠p-JNK多克隆抗体(1:1000, CST, USA),兔抗大鼠P38多克隆抗体(1:200, CST, USA),兔抗大鼠p-P38多克隆抗体(1:1000, CST, USA).4.背根神经节神经元p38, ERK, JNK免疫组织荧光染色采用5%异氟烷将大鼠深度麻醉,经预冷的生理盐水和4%多聚甲醛灌注后,取手术侧L4和L5被跟神经节,4%多聚甲醛4℃后固定过夜,脱水后石蜡包埋,制作不连续石蜡切片,切片厚度4um。一抗4℃孵育过夜,一抗分别为：兔抗大鼠ERK多克隆抗体(1:200, CST, USA),兔抗大鼠JNK多克隆抗体(1:200, CST, USA),兔抗大鼠P38多克隆抗体(1:50, CST, USA),采用小鼠抗大鼠NF200多克隆抗体(1:1,000, Abeam, Cambridge, UK)标记背根神经节神经元。二抗为Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG (H+L)和Alexa Fluor 594标记的驴抗小鼠IgG(H+L),二抗混合后室温孵育2小时。DAPI染核10min后,采用抗荧光淬灭封片剂封片,观察。使用Olympus-u-rf1-t/dp 72自动荧光显微镜观察,采集图片,采用IPP.6进行图像分析,计数阳性细胞,每种抑制剂(SB203580, U0126 and SP600125)取6只大鼠。5. Real-time quantitative RT-PCRL4及L5背根神经节快速冰上取材,提取总RNA,测定浓度。p38, JNK, ERK和β-actin的引物序列分别为:p38 (forward,5'-CCTGCGAGGGCTGAAGTA-3'; reverse, 5'-ACGGACCAAATATCCACTGTCT-3'), JNK(forward,5'-AGCCTTGTCCTTCGTGTC-3'; reverse, 5'-AAAGTGGTCAACAGAGCC-3'), ERK1(forward,5'-CCAGAGTGGCTATCAAGA AG-3'; reverse, 5'-TCCATGAGGTCCTGAACAA-3'), ERK2(forward,5'-TGCCGTGGAACAGGTTGT-3'; reverse, 5'-TGGGCTCATCACTTGGGT-3'), β-actin (forward,5'-AGACCTTCAACACCCCAG-3'; reverse, 5'-CACGATTTCCCTCTCAGC-3').6.主要试剂SB203580(p38抑制剂,CST, USA,推荐浓度=40 Wnol/L), SP600125 (JNK抑制剂,CST, USA,推荐浓度=50 μnol/L) and U0126 (ERK抑制剂,CST, USA,推荐浓度=40 μmol/L).试剂采用DMSO溶解,储存至-20℃,鞘内注射时用生理盐水稀释至使用浓度,现用现配。结果1.CCD术后机械刺激缩爪反应阈值的变化CCD术后4天大鼠术侧机械刺激缩爪反应阈值明显降低(n=8 in each group, **P<0.01)。 CCD诱导的机械痛敏可被SB203580, SP00125或U0126 (n=8 in each group,#P<0.05)缓解,假手术组与对照组相比,无明显差异。2.背根神经节内p38、erk及jnk蛋白表达的变化CCD术后,大鼠背根神经节内p38、erk及jnk蛋白表达及磷酸化水平显着增高(n=5,*p<0.05,**p<0.01与对照组相比;#p<0.05,##p<0.01与假手术组相比)。CCD诱导的MAPKs蛋白表达及磷酸化水平增高可被相应的抑制剂抑制(SB203580 for p38, SP600125 for JNK, U0126 for ERK)(&p<0.05,&&p<0.01与CCD组相比).3.背根神经节内p38、erk及jnk基因表达的变化MAPK通路抑制剂不仅可以抑制CCD术后大鼠背根神经节神经元细胞内p38,ERK和JNK蛋白表达,也可影响其基因表达。CCD术后大鼠背根神经节内p38,JNK和ERK基因表达上调(n=6,*p<0.05,**p<0.01与对照组相比)。CCD诱导的MAPK基因水平上调可被其特异性抑制剂抑制(n=6,##p<0.01与CCD组相比)。4. p38, ERK和JNK在背根神经节神经元的分布变化在背根神经节神经元细胞质及细胞核内p38, JNK和ERK均有表达,与对照组相比,CCD术后,NF200标记的大、中神经元细胞数目明显增加(n=6,*p<0.05,**p<0.01)。SB203580,SP600125或U0126鞘内注射后,NF200阳性细胞数目明显减少(n=6,#p<0.05,##p<0.01与CCD组相比)。NF200阴性的小体积神经元细胞数目无明显变化。结论1. MAPK通路参与大鼠背根神经节持续受压后神经病理性疼痛机制2.抑制MAPK通路可缓解CCD诱导的神经病理性疼痛第叁部分：大鼠背根神经节持续受压后脊髓背角TRPV4蛋白表达及分布的变化目的探讨大鼠背根神经节持续受压(CCD)后瞬时感受器电位离子通道香草素亚族受体4(TRPV4)在脊髓背角中的蛋白表达及分布规律。方法1.实验分组选取清洁级雄性Wistar大鼠30只,按随机数字表法分组：空白对照组5只,手术组25只(术后4天、7天、14天、28天各5只；免疫荧光组5只)。2.制备大鼠背根神经节持续受压模型手术方式同第一部分。3.行为学检测于造模成功后4天,7天,14天及28天,测量机械刺激缩爪反应痛阈,观察机械痛阈的变化。4.蛋白免疫印迹技术利用western blot技术检测空白对照组及术后4天,7天,14天及28天,手术侧及对侧脊髓背角TRPV4蛋白表达的变化。5.免疫荧光技术利用免疫荧光技术检测术后4天,手术侧与对侧脊髓背角TRPV4阳性细胞分布。结果1.大鼠背根神经节持续受压后机械痛阈变化手术组分别于术前及背根神经节持续受压后4天、7天、14天、28天测量大鼠机械刺激缩爪反应痛阈,对照组同时进行测量。与术前相比,术后4天,7天及14天时机械痛阈值明显下降,差异有显着性意义(n=5,P<0.001)；对照组不同时间测量结果无明显差异。2.脊髓背角TRPV4蛋白表达变化于术后4,7,14与28天进行完行为学测试后取材。与空白对照组比较,大鼠背根神经节持续受压后4天及7天,手术侧脊髓背角TRPV4表达升高,差异有显着性意义(n=5,p<0.01)；14天及28天,差异无统计学意义。手术对侧与对照组相比,差异无统计学意义。3、脊髓背角TRPV4阳性细胞数目变化大鼠背根神经节持续受压4天后,手术侧及对侧均存在TRPV4阳性细胞,荧光信号分布于胞质及胞膜上,轴丘处荧光信号集中。共5只大鼠,每只大鼠选取5张不连续切片,统计高倍视野内,脊髓背角TRPV4阳性细胞数目。相较于对侧,手术侧脊髓背角内TRPV4阳性细胞数目较多,差异有显着性意义(n=5,p=0.0008)。结论大鼠背根神经节持续受压后,机械痛阈下降的同时,手术侧脊髓背角内TRPV4蛋白表达上调及阳性数目增多,TRPV4可能参与CCD后神经病理性疼痛的中枢敏化机制。(本文来源于《山东大学》期刊2016-09-05）

张晓^[5]（2016）在《大鼠脊髓背角TRPV4在背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用》一文中研究指出研究背景神经病理性疼痛(NP, neuropathic pain)因其反复发作,较难治愈,已成为严重危害人类健康的世界性难题。各种动物模型的出现为神经病理性疼痛的研究提供了基础。背根神经节持续受压(CCD, chronic compression of the dorsal root ganglion)模型是一种公认的神经病理性疼痛模型,其模拟了临床椎间孔狭窄所致的根性疼痛痛觉过敏和自发性疼痛等症状。瞬时感受器电位离子通道(TRP, transient receptor potential)家族为最大的离子通道家族之一,其家族成员TRPV1和TRPV4作为感觉传导器,可参与介导各种病理因素所诱发的疼痛敏感过程。目前已经发现,TRPV1可表达于脊髓背角片层Ⅰ和Ⅱ,脊髓背角TRPV1离子通道可能介导NP的病理过程。研究发现,坐骨神经慢性压迫损伤模型大鼠脊髓背角TRPV1表达量增加可持续2周以上,并与机械痛敏的变化时程相一致。新的研究也指出,预先鞘内注射TRPV1抑制剂后,树脂毒素致痛模型大鼠脊髓背角TRPV1表达下调的同时可延缓大鼠热痛阈的升高,提示脊髓背角TRPV1可能与树脂毒素致痛模型大鼠神经痛的形成相关。以上研究表明脊髓背角TRPV1在神经病理性疼痛的发病机制中发挥重要的作用。脊髓背角是外周感觉传入的聚集地,外周的伤害性感觉信息在上传至大脑产生痛觉前必须经过脊髓背角的初步整合,而大脑下传至外周的调制信息亦必须经过脊髓背角的加工处理,脊髓背角在解剖学结构和位置上的重要性决定了其势必在痛觉的传导中发挥重要作用。目前的研究结果显示TPRV4在神经系统的分布多见于DRG、皮肤感觉神经终端及游离神经末梢。我们课题组的研究也显示大鼠DRG神经元内TRPV4可参与CCD机械痛敏的病理过程；TRPV4可能通过NO-cGMP-PKG通路发挥作用。我们的研究还显示抑制DRG神经元内TRPV4的表达仅可部分减轻CCD诱导的疼痛过敏,提示CCD所致神经病理性疼痛还存在其他机制。我们近期通过免疫荧光技术发现CCD大鼠术侧脊髓背角TRPV4阳性表达增多。TRPV1和TRPV4同属TRP家族,氨基酸序列同源性较高,二者的生物活性具有较高的统一性。综合以上研究我们初步推断脊髓背角TRPV4可能参与CCD诱导的神经病理性疼痛的病理过程。研究目的探讨瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4(TRPV4, transient receptor potential vanilloid 4)在脊髓背角是否有表达,大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)持续受压(chronic compression of dorsal root ganglion, CCD)后,脊髓背角TRPV4基因及蛋白变化,初步探讨脊髓背角TRPV4在CCD致神经病理性疼痛中的作用。研究方法1.制备CCD模型采用清洁级健康成年雄性Wistar大鼠,共60只,随机分为叁组,分别为空白对照组20只、CCD手术组20只、CCD+钌红组20只。CCD手术为将直径0.63mm长度约4mm"U"型不锈钢棒植入大鼠腰椎第4及第5椎间孔,使之挤压背根神经节及周围组织,挤压成功时可见术侧后肢肌肉突然的不自主收缩。空白组除了不插入钢棒外,其他步骤与CCD组相同。CCD术后第7天,CCD+钌红组大鼠进行鞘内注射TRPV4抑制剂钌红。2.机械刺激痛阈值检测机械刺激疼痛阈值检测选在术前1天,术后第7天鞘内注射给药前及给药后2小时。方法如下：将大鼠置于红色半透明玻璃箱内适应环境30min,使用BME-404型电子式机械测痛仪以针刺端透过玻璃箱底部网格层垂直刺激大鼠术侧后肢足底第叁、四趾间皮肤,缩爪或舔足现象为阳性表现。此时刺激数值即代表大鼠机械刺激痛阈值,连续测量需间隔5min,以5次测量的平均值作为变量进行数据统计。3.脊髓背角TRPV4基因及蛋白检测术后第7天大鼠机械刺激痛阈值检测结束后将所有大鼠处死取材,使用RT-PCR及Western Blot技术检测各实验组大鼠脊髓背角TRPV4基因及蛋白变化。结果1.TRPV4在大鼠脊髓背角中的表达Western-Blot和RT-PCR结果显示：空白对照组大鼠脊髓背角存在TRPV4蛋白及基因表达,表明TRPV4在脊髓背角有表达。2.CCD模型后大鼠术侧脊髓背角内TRPV4表达变化Western-Blot结果显示：与空白对照组相比,术后第7天,CCD手术组大鼠术侧脊髓背角TRPV4蛋白表达显着增加,差异有统计学意义(P<0.05)；RT-PCR结果显示,与空白对照组相比,术后第7天,CCD手术组大鼠术侧脊髓背角TRPV4基因表达显着升高,差异有统计学意义(P<0.05)；3.钌红对CCD大鼠术侧机械刺激痛阈值的影响机械刺激痛阈值测量结果显示：与CCD手术组相比,鞘内注射TRPV4抑制剂钌红2小时后,CCD+钌红组大鼠手术侧机械刺激痛阈值明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)。4.钌红对CCD大鼠术侧脊髓背角内TRPV4表达的影响Western-Blot结果显示：与CCD手术组相比,鞘内注射TRPV4抑制剂钌红2小时后,CCD+钌红组大鼠术侧脊髓背角TRPV4蛋白表达显着减少,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示,与CCD手术组相比,鞘内注射TRPV4抑制剂钌红2小时后,CCD+钌红组大鼠术侧脊髓背角TRPV4基因表达显着下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论TRPV4蛋白在脊髓中有表达；CCD造模后脊髓背角内TRPV4的表达明显增高,鞘内注射钌红后,TRPV4的表达受到抑制的同时大鼠机械痛阈值明显提高。本研究表明,TRPV4参与了CCD所诱导的神经病理性疼痛的中枢性敏化过程。(本文来源于《山东大学》期刊2016-05-09）

王洁^[6]（2015）在《Ca~(2+)内流对大鼠背根神经节持续受压后痛觉过敏的调控及机制研究》一文中研究指出背景神经病理性疼痛(neuropathic pain)可继发于中枢或外周神经系统任何部位的损伤或疾病,特征性表现为自发性疼痛(spontaneous pain)、痛觉过敏(hyperagesia)及痛觉超敏(allodynia)。目前针对神经性疼痛的一些研究集中在DRG神经元的瞬时感受器电位离子通道家族(Transient receptor potential channel, TRP channel)及其功能上。背根神经节是许多伤害性刺激传入的通道,与疼痛相关的许多受体、离子通道以及信号转导分子都存在于DRG。炎性介质如PGE2.5-HT、肾上腺素和神经生长因子(NGF),在初级传入神经元中通过激活细胞内的第二信使环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)-依赖性的蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和环磷鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)-依赖性的蛋白激酶G (protein kinase G, PKG),介导CCD大鼠的痛觉过敏。瞬时感受器电位离子通道家族中香草素受体亚家族TRPV4是近年来研究较多的TRPV家族成员之一,它广泛分布于背根神经节、肾远曲小管的上皮组织、心、肝、肺、脾以及许多其它组织。TRPV4是一种多觉感受器,可以被低渗、机械刺激、热、佛波醇酯、低pH值、柠檬酸盐、anandamide (AEA)和其代谢产物花生四烯酸(arachidonic acid, AA)、以及bisandrographolide A (BAA)等激活。TRPV4基因敲除的小鼠表现出对炎症引起的热痛觉过敏降低以及对伤害性压力刺激的回避反应降低,但对非伤害性热和触觉刺激的反应正常。一氧化氮(nitric oxide, NO)是细胞内重要的信使分子和神经递质,它对炎性疼痛的发展和维持起到了重要作用。动物实验研究证明,使用NO或cGMP合成酶抑制剂能够减轻炎性痛和神经病理性疼痛。NF-κB是基因转录的调控因子,当受到细胞因子、氧化应急、一些化学和疼痛性伤害时,NF-κB被激活,参与众多基因的诱导表达。研究者发现,在脊髓和背根神经节中NF-κB参与伤害性感觉信息的传递。我们前期的研究发现,TRPV4-NO-cGMP-PKG信号通路在CCD大鼠痛觉过敏中发挥重要的作用,NF-κB参与介导了TRPV4-NO信号通路。然而,到目前为止,在CCD大鼠痛觉过敏中TRPV4与NO之间,TRPV4与NF-κB之间的具体的机制尚不清楚。TRPV4是非选择性阳离子通道,对钙离子具有较高的通透性,细胞内外钙离子浓度可以调节TRPV4的功能。钙离子通道通过调节钙离子内流,在神经系统的很多过程中都发挥重要的作用,如递质在突触部位的释放、神经元兴奋性的调节以及突触可塑性和基因转录等。胞内钙离子浓度的升高胞内Ca2+浓度增高活化腺苷环化酶(AC),使cAMP合成增加,由此可以激活cAMP依赖性的PKA。研究发现,在皮肤上皮细胞,钙离子通透性的TRPV4通道是在将UVB刺激转化为细胞内信号并将该信号传递到感觉神经元从而使皮肤产生疼痛的过程中发挥关键作用,目前,已经确定有五种类型的钙离子通道：L型、T型、N型、P/Q型和R型,他们各自具有独特的电生理学和药理学特性。T型钙通道是在背根神经节的外周感觉神经元中首次被发现的,它具有快速激活、缓慢关闭和在静息电位下即可激活的特点,可直接或间接的影响多种生理过程如激发神经动作电位形成、增加突触兴奋性和促进神经递质释放等,对调节神经元的兴奋性加剧疼痛进展,发挥重要作用。神经系统T型钙通道广泛分布于外周感觉初级神经元、背根神经节、脊髓背角和脑内神经组织等部位,根据其编码基因不同分为a1G(CavT.1), a1H (CavT.2)和a1I(CavT.3)叁种亚型。T型钙通道通过调节钙离子内流,与神经兴奋性动作电位形成、神经递质释放以及钙依赖相关基因的表达有关。在糖尿病性神经痛和CCI动物模型中,T型钙离子通道的密度显着增加。因此,我们推测TRPV4依赖性的钙离子浓度变化可能介导了CCD大鼠痛觉过敏中TRPV4-NO的信号通路。目的研究TRPV4依赖性的Ca2+在CCD大鼠痛觉过敏TRPV4-NO信号通路中的作用。方法1.大鼠蛛网膜下腔置管(鞘内置管)及CCD模型的制备将大鼠随机分为CCD组和假手术组。大鼠先用戊巴比妥钠(50 mg/kg,腹腔注射)麻醉后,沿L4-S1棘突作后正中偏右切口,显示L4与S1棘突间隙,将PE-10聚乙烯导管插入蛛网膜下腔并固定,生理盐水填满并加热封闭末端。暴露右侧L4及L5椎间外孔,将“U”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,另一端位于椎管壁外。使之挤压大鼠L4、L5的背根神经节。术后局部生理盐水冲洗,间断缝合肌肉、腰背筋膜、皮下组织以及皮肤。用金属保护罩保护导管远端。腹腔注射青霉素预防感染。术毕将大鼠放入鼠笼,于温暖、安静环境自由喂养。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组。手术由同一人操作以保证一致性。术后大鼠没有发生自残现象,也没有表现出感觉完全缺失2. TRPV4 siRNA对痛觉敏感的影响为了测量TRPV4 siRNA对痛觉敏感的影响,大鼠被随机分为假手术组(sham)和CCD组。每个组又分为对照组、TRPV4慢病毒干扰组(CCD+LV-TRPV4)和TRPV4'慢病毒阴性对照组(CCD+LV-NC)叁个亚组。假手术组中未接受任何处理的大鼠作为对照,CCD组中只接受CCD手术的大鼠作为对照。TRPV4 siRNA通过鞘内置管注射,注射时间不少于10min, 10μl/d,每天一次,共3天。3.钙通道阻断剂对痛觉敏感的影响为了测量钙通道阻断剂(mibefradil)对痛觉敏感的影响,大鼠被随机分为假手术组(sham)、mibefradil处理组、生理盐水处理组。其中,mibefradil处理组又分为mibefradil (20mg/kg)组、mibefradil (10mg/kg)组、mibefradil (5mg/kg)叁个亚组。Mibefradil溶于0.9%的生理盐水中,总体积为0.1 ml/kg。4.神经行为学测定对大鼠的手术同侧后肢进行行为学检测,TRPV4 siRNA对行为学影响的检测时间为：CCD手术前,CCD手术后第4、7、14、21天；腹腔注射钙通道阻断剂(mibefradil)对行为学影响的检测时间为：药物处理前测量,排除痛觉表现不明显者(<5%)；药物处理后15、30、45、60min分别测量。所有的测量均使用单盲法。(1).运动功能(motor function)观察CCD大鼠自然状态下随意行走的步态,采用记分制。计分方法为：1分=正常步态、足无畸形；2分=正常步态伴明显足畸形；3分=轻度步态障碍伴足下垂；4分=严重步态障碍伴肌无力。(2).热辐射刺激缩爪反应潜伏期((Thermal paw withdrawal latency, PWL):选用BME-410C型热痛刺激仪。预先将热痛刺激仪放在有机玻璃板下方,将大鼠放在6mm厚有机玻璃板下方,使光源聚焦照射动物后肢足底掌心,电子秒表记录从照射开始到引起后肢回缩反应时的的时间即为热福射刺激缩爪反应潜伏期的观测指标。取每只大鼠6次测量结果的均值为统计数据。(3).机械刺激缩爪阈值(Mechanical withdrawal threshold, MWT):使用BME-403型Von Frey Fibers机械痛刺激仪。先将大鼠放在铁丝网上,用不同折力的Von Frey纤毛刺激大鼠手术侧足底,如大鼠出现快速缩足或舔足现象为阳性反应。每只大鼠均从小剂量的针丝开始刺激,,每根针丝测量5次,至少能够引发3次缩爪反应的针丝强度即为机械痛阈值。取每只大鼠6次测量结果的均值为统计数据。结果1.TRPV4 siRNA对痛觉敏感的影响与假手术组相比,CCD大鼠手术侧热辐射刺激缩爪反应潜伏期(PWL)和机械刺激缩爪阈值(MWT)明显降低(P<0.05)。术后7天时,机械痛觉和热痛觉阈值降至最低,此后逐渐升高。鞘内注射TRPV4 siRNA 10μl/d,分别测CCD手术后第0、4、7、14、21天热辐射刺激缩爪反应潜伏期(PWL)和机械刺激缩爪阈值(MWT)。结果显示：在CCD组大鼠,与阴性对照组(LV-NC)相比,TRPV4 siRNA (LV-TRPV4)对CCD后大鼠的热痛敏和机械痛敏产生明显抑制作用(P<0.05)；而在假手术组,TRPV4 siRNA并未对大鼠的热痛敏和机械痛敏产生明显的作用(P>0.05)。2.钙通道阻断剂对痛觉敏感的影响腹腔注射不同浓度的钙通道阻断剂mibefradil (20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg),分别测注射后0、15、30、45、60min的热辐射刺激缩爪反应潜伏期(PWL)和机械刺激缩爪阈值(MWT),结果显示：与生理盐水组相比,浓度20mg/kg和10mg/kg的mibefradil可部分抑制CCD后大鼠的机械痛敏和热痛敏(P<0.05),此抑制作用呈剂量依赖性升高。此抑制作用于腹腔注射15min可测得,30min作用达到最大,抑制作用可持续至60min。而5mg/kg mibefradil则没有明显的抑制作用(P>0.05)。3. TRPV4激动剂4a-PDD对钙通道阻断剂的作用腹腔注射钙通道阻断剂mibefradil (20mg/kg),分别测注射后0、15、30、45、60min时的热辐射刺激缩爪反应潜伏期(PWL)和机械刺激缩爪阈值(MWT)。与生理盐水组相比,mibefradil (20mg/kg)对CCD后大鼠热痛觉过敏产生抑制作用(P<0.05)。鞘内注射TRPV4激动剂4a-PDD(100μmol/L)预处理后,能够明显逆转mibefradil (20mg/kg)对CCD后大鼠热痛敏和机械痛敏过敏产生抑制作用(P<0.05)。结论在CCD大鼠的痛觉过敏中,TRPV4依赖性的Ca2+变化参与介导了TRPV4-NO信号通路。背景神经性性疼痛是由神经系统原发性或继发性损害或功能障碍所引起的疼痛。背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)持续受压(chronic compression of DRG, CCD)导致大鼠出现受压侧的自发性疼痛、痛觉过敏和异常疼痛,同时伴随神经元的兴奋性增加,表现为自发性放电增加和电流阈值降低,与临床上腰椎间盘突出症等疾病所导致的症状相似。在初级传入神经元中,炎性介质如PGE2,5-HT、肾上腺素和神经生长因子(NGF),通过激活细胞内的第二信使环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)-依赖性的蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和环磷鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)-依赖性的蛋白激酶G (protein kinase G, PKG),介导CCD大鼠的痛觉过敏。瞬时感受器电位离子通道-香草素亚型4(Transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)参与DRG神经元介导的疼痛信号传导过程。TRPV4是非选择性阳离子通道,对钙离子具有较高的通透性,细胞内外钙离子浓度可以调节TRPV4的功能。钙离子通道通过调节钙离子内流,在神经系统的很多过程中都发挥重要的作用,如递质在突触部位的释放、神经元兴奋性的调节以及突触可塑性和基因转录等。胞内钙离子浓度的升高胞内Ca2+浓度增高活化腺苷环化酶(AC),使cAMP合成增加,由此可以激活cAMP依赖性的PKA。T型钙通道是唯一的低电压激活钙通道,膜电位去极化至-60 mV即可观察到T型钙电流,可直接或间接的影响多种生理过程如激发神经动作电位形成、增加突触兴奋性和促进神经递质释放等,对调节神经元的兴奋性加剧疼痛进展,发挥重要作用。在糖尿病性神经痛和CCI动物模型中,T型钙离子通道的密度显着增加。目前研究已知,T型钙通道与糖尿病性神经痛、化疗引起的神经痛有密切关系,且选择性敲除鼠CaV3.2基因可以对抗神经性和炎性疼痛。一氧化氮(nitric oxide, NO)是具有生物活性的气体分子,是细胞内重要的第二信使,在神经病理性疼痛及痛觉过敏的发生和持续过程中发挥重大作用。其作用的具体过程是：神经元突触前膜去极化使谷氨酸(Glu)等释放到突触间隙与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)等受体结合,受体通道开放,Ca2+内流与钙调蛋白(CaM)偶联,在还原型辅酶O(NAD2PH)的协助下激活一氧化氮合酶(NOS),催化L-精氨酸(L-Arg),生成NO,激活可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase, sGC),促进环鸟苷酸(cyclic guanoslin monophosphate, cGMP)合成,作用于cGMP门控离子通道,cGMP调节的磷酸二酯酶(PDE), cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)等效应靶分子,参与神经系统伤害性刺激信息传递。动物实验研究证明,使用NO或cGMP合成酶抑制剂能够减轻炎性痛和神经病理性疼痛。NF-κB是基因转录的调控因子,当受到细胞因子、氧化应急、一些化学和疼痛性伤害时,NF-κB被激活,参与众多基因的诱导表达。研究者发现,在脊髓和背根神经节中NF-κB参与伤害性感觉信息的传递。我们前期的研究发现,TRPV4-NO-cGMP-PKG信号通路在CCD大鼠痛觉过敏中发挥重要的作用,而NF-κB参与介导了TRPV4-NO信号通路。然而,到目前为止,在CCD大鼠痛觉过敏中TRPV4与NO之间,TRPV4与NF-κB之间的具体的机制尚不清楚。Ca2+是线粒体NOS(mtNOS)活化的最有效的刺激物。Shirato发现,COS细胞的裂解物中转染了豚鼠iNOS(inducible nitric oxide synthase,诱导型NOS)后,NOS活性显着增加,而阻断钙通道后,NOS的活性下降79%。因此,我们推测TRPV4依赖性的钙离子浓度变化可能参与了CCD大鼠后痛觉过敏的分子机制。目的1.研究TRPV4 siRNA对CCD模型DRG中NF-κB活性和NO含量的影响：2.研究钙通道阻断剂mibefradil dihydrochloride(米拉贝尔)对CCD模型DRG中NF-κB活性和NO含量的影响；3.研究TRPV4依赖性的钙离子变化在CCD后热痛敏TRPV4-NO通路中的作用。方法1.大鼠蛛网膜下腔置管(鞘内置管)及CCD模型的制备将大鼠随机分为CCD组和假手术组。大鼠先用戊巴比妥钠(50 mg/kg,腹腔注射)麻醉后,沿L4-S1棘突作后正中偏右切口,显示L4与S1棘突间隙,将PE-10聚乙烯导管插入蛛网膜下腔并固定,生理盐水填满并加热封闭末端。暴露右侧L4及L5椎间外孔,将“U”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,另一端位于椎管壁外。使之挤压大鼠L4、L5的背根神经节。术后局部生理盐水冲洗,间断缝合肌肉、腰背筋膜、皮下组织以及皮肤。用金属保护罩保护导管远端。腹腔注射青霉素预防感染。术毕将大鼠放入鼠笼,于温暖、安静环境自由喂养。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组。手术由同一人操作以保证一致性。术后大鼠没有发生自残现象,也没有表现出感觉完全缺失2.鞘内注射TRPV4 siRNA大鼠被随机分为假手术组(sham)和CCD组。每个组又分为对照组、TRPV4慢病毒干扰组(CCD+LV-TRPV4)和TRPV4'慢病毒阴性对照组(CCD+LV-NC)叁个亚组。假手术组中未接受任何处理的大鼠作为对照,CCD组中只接受CCD手术的大鼠作为对照。TRPV4 siRNA通过鞘内置管注射,注射时间不少于10min, 10μl/d,每天一次,共3天。3.腹腔注射钙通道阻断剂大鼠被随机分为假手术组(sham)、mibefradil处理组、生理盐水处理组。其中,：mibefradil处理组又分为mibefradil (20mg/kg)组、mibefradil (10mg/kg)组、mibefradil (5mg/kg)叁个亚组。Mibefradil溶于0.9%的生理盐水中,总体积为0.1 ml/kg。4.组织免疫荧光将DRG组织进行快速冰冻切片后用4%多聚甲醛室温固定10min,,加入5%BSA室温封闭1h,然后加入GFP一抗(1：400)4℃孵育过夜。PBS冲洗3次后,加入带有绿色荧光标记的GFP二抗室温避光孵育2h。使用DAPI细胞核染色后,封片,激光共聚焦显微镜下观察拍照。5. Western blotting测量TRPV4通道蛋白表达的变化鞘内注射TRPV4-SiRNA后第7天,从各组大鼠手术侧L4-L5DRG中提取蛋白质,经过提取蛋白,凝胶电泳,转膜,标记一抗和二抗,曝光等步骤观察目的蛋白的表达。6.实时定量PCR测量TRPV4 mRNA表达的变化鞘内注射TRPV4-SiRNA后第7天,从各组大鼠手术侧L4-L5 DRG中提取RNA,通过逆转录和RT-PCR的方法检测TRPV4 mRNA表达的变化。7.成年大鼠DRG神经元的培养取出CCD术后第7天手术侧L4-L5的DRG和正常大鼠同侧L4-L5的DRG,Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶分别消化1h和30min后,应用Neurobasal+1%N2+20ng/ml NGF+1%谷氨酰胺+100U/ml青链霉素培养,培养第4天的DRG神经元用于后续实验。8.Ca2+成像实验1mmol/L Fluo-3/AM从-20℃冰箱中取出,室温下复温,应用含有0.02%pluronic F127的等渗溶液将其配制成终浓度5μmol/l。DRG神经元PBS冲洗1次后加入Fluo-3/AM,室温下负载30分钟,负载过程中可轻轻摇晃促进染色,然后PBS冲洗3次。将孵育完的DRG神经元放在LCSM的载物台上,488nm激光激发Fluo-3,观察细胞内Ca2+荧光强度的变化。试验在室温下(<24℃)进行。实验应在室温下(<24℃)进行,且在给予药物刺激之前,应先测量细胞内Ca2+荧光强度至少30秒作为基础值。然后应用4α-PDD(10μmol/l)刺激3分钟,观察施加药物前后荧光强度变化。9. EMSA检测NF-κB活性电泳迁移率改变法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)测定核因子KB结合活性。(1)核蛋白的提取与浓度测定：按照核蛋白提取成套kit操作收获核蛋白。标准BCA法于酶标仪测定蛋白浓度,并置于液氮中保存。(2)Biotin标记探针与纯化：NF-κB结合序列：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'此为一系列复杂制备过程,包括寡核苷酸合成,Biotin标记,HPLC柱式纯化,NT质谱检测,退火制备双链,探针比活性测定及倍比稀释得到合适的探针工作液浓度用于后续EMSA检测实验；(3)按照EMSA成套试剂的操作手册建立结合反应体系：在消毒离心管中混合10X缓冲液、核蛋白5-10ug、Bio-NF-κB探针,poly (di:dc) (di:dc)和去离子水。将结合反应产物加入上样缓冲液,上样至6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶,以恒电压180 V,于0.5X TBE进行电泳分离。当指示剂溴酚蓝行至凝胶下缘时,终止电泳,移开玻璃块,用3 M的Whatman滤纸揭胶,并0.5X TBE中390MA电转40min,后续经过紫外交联10min,经Blocking, washing等操作加上显色底物并用MPIAS型多媒体图像分析系统进行成像系统扫描。10.亚硝酸盐产物(NO)测量亚硝酸盐水平间接反应DRG内NO产物的含量,按照亚硝酸盐检测试剂盒进行操作。11.统计分析所得数据用means ± SEM表示。根据需要使用two-way repeated measures analysis of variance (RM ANOVA)或者one-way ANOVA,选择Bonferroni t-test, Student-Newman-Keuls Method (SNK)或Tukey Test作为post hoc检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.免疫荧光检测TRPV4 siRNA转染效率鞘内注射表达GFP绿色荧光蛋白的TRPV4siRNA 7天后处死大鼠取出L3-L4 DRGs。图2-1显示,在sham组和CCD组中,鞘注LV-TRPV4组和LV-NC组可以看到明显的绿色荧光。说明TRPV4 siRNA成功转染到DRG神经元内。2. Western blotting示鞘内注射TRPV4 siRNA对大鼠DRG中TRPV4蛋白表达的影响图2-3(A、B)显示,与LV-NC组相比,正常大鼠DRG细胞转染TRPV4 siRNA后TRPV4通道蛋白表达明显降低(n=6.*P<0.05)。图2-3(C、D)显示,与sham组相比,CCD大鼠DRG中TRPV4蛋白表达明显升高,(n=6.*P<0.05)。鞘注TRPV4 siRNA后,与CCD+LV-NC组相比,CCD+TRPV4-LV组大鼠DRG中TRPV4蛋白表达明显降低,(n=6.#P<0.05)；与sham+LV-NC组相比,sham+TRPV4-LV组大鼠DRG中TRPV4蛋白表达明显降低(n=6.& P<0.05)3. RT-PCR示鞘内注射TRPV4 siRNA对大鼠DRG中TRPV4 mRNA表达的影响图2-3(E)显示,与sham组相比,CCD大鼠DRG中TRPV4mRNA表达明显升高, (n=6.*P<0.05)。鞘注TRPV4 siRNA后,与CCD+LV-NC组相比,CCD+TRPV4-LV组大鼠DRG中TRPV4mRNA表达明显降低,(n=6.#P<0.05)；与sham+LV-NC组相比,sham+TRPV4-LV组大鼠DRG中TRPV4mRNA表达明显降低(n=6.& P<0.05)。4.鞘内注射TRPV4 siRNA对DRG神经元TRPV4介导的Ca2+内流的影响图2-4显示,与sham组相比,CCD可引起4α-PDD介导的DRG神经元内Ca2+浓度升高(*P<0.05,n=30),去除细胞外液中的钙以及钌红(RR)可以抑制该反应。与阴性对照组相比,TRPV4siRNA明显抑制CCD后大鼠DRG神经元内Ca2+浓度的升高(#P<0.05,n=30)。5.鞘内注射TRPV4 siRNA对大鼠DRG中NF-κB活性的影响为了测量TRPV4 siRNA对大鼠DRG中NF-κB活性的影响,鞘内注射TRPV4 siRNA 10μl/d,检测7天后大鼠DRG中NF-κB活性,图2-5显示,与sham组相比,CCD后NF-κB活性升高；鞘内注射TRPV4siRNA后,与LV-NC阴性对照组想比,NF-κB活性下降,接近正常水平。6.鞘内注射TRPV4 siRNA对大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度的影响为了检测TRPV4 siRNA对大鼠DRG中NF-κB活性的影响,鞘内注射TRPV4 siRNA 10μl/d,检测7天后大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度,图2-7显示,与sham组相比,CCD后大鼠DRG中NO含量升高(n=6,*P<0.05)；与CCD+LV-NC组相比,CCD+LV-TRPV4组大鼠DRG中NO含量降低(n=6,#P<0.05)。7.腹腔注射钙通道阻断剂mibefradil及TRPV4激动剂4 α-PDD预处理对大鼠DRG中NF-κB活性的影响为了检测钙通道阻断剂mibefradil对大鼠DRG中NF-κB活性的影响,腹腔注射钙通道阻断剂mibefradil (20mg/kg),30min后检测大鼠DRG中NF-κB活性。图2-6显示,与生理盐水处理组相比,腹腔注射mibefradil (20mg/kg)明显降低DRG中NF-κB活性。4a-PDD(100μmol/L)能够逆转mibefradil (20mg/kg)降低DRG中NF-κB活性。8.腹腔注射钙通道阻断剂mibefradil及TRPV4激动剂4 α-PDD预处理对大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度的影响为了检测钙通道阻断剂mibefradil对大鼠DRG中NO含量的影响,腹腔注射钙通道阻断剂mibefradil (20mg/kg),30min后检测大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度。图2-8显示,与生理盐水处理组相比,腹腔注射mibefradil (20mg/kg)明显降低DRG中NO含量(n=6,*P<0.05) 4α-PDD (100μmol/L)能够逆转mibefradil (20mg/kg)降低DRG中NO含量(n=6,#P<0.05)。结论TRPV4激活诱发钙离子内流,介导Ca2+依赖性的一氧化氮合酶(NOS)的产生,NOS进一步介导激活NF-κB从而参与大鼠CCD后痛觉过敏的TRPV4-NO通路(本文来源于《山东大学》期刊2015-05-10）

魏慧^[7]（2013）在《细胞骨架对大鼠背根神经节持续受压后痛觉过敏的调控及机制研究》一文中研究指出神经性疼痛是由神经系统原发性或继发性损害或功能障碍所引起的疼痛。背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)持续受压(chronic compression of DRG,CCD)导致大鼠出现受压侧的自发性疼痛、痛觉过敏和异常疼痛,同时伴随神经元的兴奋性增加,表现为自发性放电增加和电流阈值降低,与临床上腰椎间盘突出症等疾病所导致的症状相似。本课题组的前期研究表明,CCD手术后,大鼠出现手术同侧后肢的机械痛觉过敏和热痛觉过敏,但痛觉过敏的具体机制尚未明确。微管与微丝是细胞骨架的主要组成部分,参与维持细胞形态、保持细胞内部结构的有序性、转运细胞内物质等生理功能。微管是细胞骨架纤维中最粗的纤维,是由微管蛋白组成的直径约为25nm的中空圆柱状纤维。微管蛋白主要包括α-微管蛋白(a-tubulin, TUBA)、β-微管蛋白(p-tubulin, TUBB)和γ-微管蛋白(γ-tubulin,TUBG)。TUBA和TUBB以非共价键的形式连接形成异二聚体,异二聚体首尾相连则形成微管蛋白原纤维。哺乳动物中,13条微管蛋白原纤维构成1个中空的微管。紫杉醇是微管的稳定剂,稳定微管的聚合状态,抑制微管解聚。秋水仙碱是一种微管解聚剂,抑制微管聚合并促进微管解聚。微丝是细胞骨架结构中最细的纤维,直径7nm左右,主要由肌动蛋白螺旋状聚合形成,包含游离球状肌动蛋白(G-actin)和聚合纤维状肌动蛋白(F-actin)两种形式,只有后者具有生物学作用。细胞松弛素是微丝的解聚剂,可抑制微丝聚合并促进微丝解聚。鬼笔环肽是一种微丝稳定剂,具有稳定聚合微丝、抑制微丝解聚的作用。微管与微丝处于不断的解聚与聚合的动态平衡状态,这种动态平衡是完成生理功能的必要条件。研究证实,微管和微丝的解聚可降低炎性疼痛。炎性疼痛中,炎症细胞和炎症介质在趋化因子的作用下迁移到病变处发挥作用,其迁移是在微管的作用下完成的,低浓度(10-8mol/L)短时间(30-120分钟)应用微管解聚剂秋水仙碱可抑制炎性细胞的迁移,控制炎症。肾上腺素(epinephrine, EPI)及其下游产物可提高感觉神经元对疼痛的敏感性,而单独应用微管解聚剂或微丝解聚剂均可抑制肾上腺素诱导的痛觉过敏。微管也能够介导神经性疼痛。坐骨神经慢性压迫(sciatic chronic constriction injury, CCI)后,大鼠出现后肢的热痛觉过敏,注射秋水仙碱可缓解CCI所致的热痛觉过敏。因此,我们推测微管、微丝可能介导CCD大鼠机械痛觉过敏和热痛觉过敏,因此,本课题拟利用微管和微丝的解聚剂及聚合剂研究二者在CCD大鼠机械痛敏和热痛敏中的作用。持续受压后,大鼠的痛觉过敏和DRG神经元的高兴奋性与多种离子通道有关,如电压门控性Na+通道和K+通道、超极化激活性阳离子通道和瞬时感受器电位离子通道(transient receptor potential, TRP)通道等。瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4(transient receptor potential vanilloid subtype4, TRPV4)是TRP超家族成员之一,是一种Ca2+通透性较高的阳离子通道。DRG神经元的细胞膜、细胞浆和细胞核上均可检测到TRPV4,细胞膜上表达的TRPV4通道是介导痛觉过敏的主要部分。实验证据支持DRG中表达的TRPV4参与介导多种神经性疼痛和炎性疼痛。前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)可增强低渗或中度高渗溶液刺激引起的异常疼痛和痛觉过敏,TRPV4反义寡核苷酸干扰和基因敲除后,大鼠和小鼠的异常疼痛和痛觉过敏缓解。TRPV4反义寡核苷酸干扰后,微管稳定剂紫杉醇引起的机械痛觉过敏降低。本课题组的前期研究证实,TRPV4通道参与介导CCD大鼠的机械痛觉过敏和热痛觉过敏。微管、微丝与TRPV4直接相连并可调节TRPV4通道的功能。如微丝解聚后,TRPV4通道介导的内向电流和低渗休克导致的TRPV4通道的Ca2+内流受到抑制,TRPV4与肌动蛋白的共表达减少。结合TRPV4在CCD大鼠痛敏中的作用,我们推测,TRPV4可能参与微管、微丝对CCD大鼠痛敏的调节过程。因此,本课题中,我们拟观察微管、微丝对CCD大鼠痛敏的影响,并研究微管、微丝对CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道功能、表达和定位的影响,为微管、微丝对CCD大鼠痛敏的调节提供可能的作用机制。目的1.研究微管解聚剂秋水仙碱对CCD大鼠机械痛觉过敏和热痛觉过敏的影响。2.研究秋水仙碱对TRPV4通道功能和表达的影响,探讨微管解聚影响CCD大鼠痛觉过敏的机制。材料与方法1.CCD模型的制备应用戊巴比妥钠(50mg/kg)行腹腔注射麻醉后,沿L4-S1棘突作后正中偏右切口,暴露横突的根部及L4-L5椎间外孔后,将每侧长4mm,直径0.63mm的“L”形不锈钢棒沿L4-L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,另一端位于椎管壁外。通过控制“L”形棒椎管壁外侧端使其椎管内端沿椎骨内壁缓慢下滑至椎管中部,恒定地压迫DRG及邻近神经根。术后用生理盐水冲洗切口,依次缝合肌肉、腰背筋膜和皮肤,腹腔注射青霉素40万单位预防感染,术后密切观察大鼠生命体征变化。2.神经行为学的测定对CCD大鼠的手术侧及正常大鼠的同侧后肢进行行为学检测,时间为：术前,术后第4、6、7、14、28天；药物对行为学影响检测时间为：药物处理前测量,排除痛觉表现不明显者(<5%)；药物处理后0.5、1、2、4、8小时分别测量。大鼠的机械痛觉过敏采用机械缩足反射阈值(Mechanical withdrawal threshold, MWT)测量,使用BME-403型、Von Frey Fibers机械痛刺激仪进行。将不同强度的Von Frey纤维由低到高依次地刺激CCD大鼠手术侧或正常大鼠同侧后肢足底中部并维持5秒,阳性反应为出现快速缩足或舔足现象。每个强度的纤维刺激5次,机械缩足反射阈值为至少能够引发3次缩足反应的纤维强度。大鼠热痛觉过敏通过热辐射刺激缩爪反应潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)来确定,采用BME-410C型热痛刺激仪测量。大鼠安静后,将光源焦距对准CCD大鼠手术侧或正常大鼠同侧后肢足底中心。从开始照射到引起后肢回缩反应所需的时间,即为当次热辐射刺激缩爪反应潜伏期。每肢照射5次,测量结果的均值即为此大鼠的热辐射刺激缩爪反应潜伏期。3.成年大鼠DRG神经元的培养取出CCD术后第7天手术侧L4-L5的DRG和正常大鼠同侧L4-L5的DRG,Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶分别消化1小时和30分钟后,应用Neurobasal+1%N2+20ng/mlNGF+1%谷氨酰胺+100U/ml青链霉素培养,培养第4天的DRG神经元用于全细胞膜片钳技术、细胞活性测定及免疫细胞化学检测等后续实验。4.HEK293细胞的培养和转染HEK293细胞培养于10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中,3-4天传代一次,传代后24小时转染。Lipofectamine2000脂质体和(?)TRPV4-GFP质粒先各自加入一定量的缓冲液OPTI-MEM中,混匀后静置5分钟。将两者再混匀,室温放置20-30分钟。将质粒脂质体混合物加入HEK293细胞培养液中孵育4-6小时,然后将培养液更换为包含血清和抗生素的DMEM培养液。转染后24-48小时进行电生理实验或细胞活性检测。5.细胞活性检测将成年大鼠DRG神经元和HEK293-TRPV4细胞以1×104／孔的密度接种于96孔培养板,在不同浓度秋水仙碱培养基中培养2小时后,吸去原培养液,每孔加入80μl培养液和20μl5mg/ml的四甲基偶氮唑(3-[4,5-dimethylthiazol-2-y1]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)。经37℃孵箱孵育4小时后,将上清液吸去后应用PBS冲洗后,每孔加入150μl甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide, DMSO)溶剂。将孔板放置在摇床上,通过10分钟的低速震荡即可充分溶解结晶。应用酶标检测仪测定波长490nm处的吸光度OD值,各组均以正正常培养基培养的成年大鼠DRG神经元的吸光度作为100%,其他情况下的吸光度数值需与之相比较。6.全细胞膜片钳记录TRPV4通道的电流采用常规高阻抗封接的全细胞记录方式,检测DRG神经元及HEK293-TRPV4细胞中TRPV4通道介导的内向电流。电极内液(mmol/L):140CsCl,2NaCl,3MgCl2,10Hepes,5EGTA (290mOsm),用CsOH调节pH至7.25,用针头式滤器(孔径0.22μm)过滤后分装,-20℃保存。电极入水电阻为3-6MΩ。电极外液(mmol/L):124NaCl,5KC1,1.2KH2PO4,1.3MgCl2,2.4CaCl2,26NaHCO3(310mOsm),用NaOH调节pH至7.35,4℃保存。7.实时定量RT-PCR检测CCD术后第7天,鞘内注射不同浓度秋水仙碱0.5-8小时后,从各组大鼠手术侧L4-L5DRG中提取RNA,实时定量RT-PCR检测TRPV4mRNA表达的变化。8. Western blotting检测CCD术后第7天,鞘内注射不同浓度秋水仙碱0.5-8小时后,从各组大鼠手术侧L4-L5DRG中提取蛋白质,Western blotting检测TRPV4蛋白表达的变化。9.组织免疫荧光及免疫细胞化学检测TRPV4的定位将DRG组织切片及培养的DRG神经元用冷丙酮固定10分钟后(-20℃),加入2%BSA室温封闭1小时,然后加入TRPV4一抗4℃孵育过夜。PBS冲洗3次后,加入带有绿色荧光标记的TRPV4二抗室温孵育1小时。使用DAPI细胞核染色后,封片,荧光显微镜下观察TRPV4在DRG神经元的定位区域。结果1.鞘内注射微管解聚剂秋水仙碱可缓解CCD大鼠的痛觉过敏CCD术后,大鼠手术侧机械和热痛觉阈值降低(P＜0.05)。术后7天时,手术侧机械痛觉阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期降至最低(P＜0.01),此后逐渐升高。625μg/kg-1250μg/kg的秋水仙碱可部分抑制CCD后大鼠的机械痛敏和热痛敏,此抑制作用(P＜0.05)呈剂量依赖性升高。此抑制作用于鞘注秋水仙碱后30分钟可测得,2小时作用达到最大,此抑制作用可持续至8小时,而312.5μg/kg秋水仙碱则无抑制作用(P＞0.05)。2.微管解聚剂秋水仙碱对DRG神经元以及HEK293-TRPV4细胞活性的影响0.1μg/ml秋水仙碱对DRG神经元和HEK293-TRPV4细胞的活性无影响。其中,0.1μg/ml秋水仙碱分别孵育DRG神经元和HEK293-TRPV4细胞0.5小时和2小时,细胞活性均未受影响(P＞0.05)3.微管解聚剂秋水仙碱对正常大鼠DRG神经元TRPV4通道功能的影响秋水仙碱孵育后,正常大鼠DRG神经元TRPV4的电流降低。秋水仙碱0.01μ/ml,0.05μg/ml和O.1μg/ml孵育DRG神经元2小时后,TRPV4的内向电流分别为201.62±4.72pA、165.25±7.44pA和128.41±±3.75pA。因此,秋水仙碱对DRG神经元TRPV4电流的抑制呈剂量依赖性,且0.1μg/ml秋水仙碱对TRPV4电流的影响最大(P<0.05)。因此,在本课题中,将0.1μg/ml秋水仙碱作为最适浓度。4.微管解聚剂秋水仙碱对CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道功能的影响与正常大鼠DRG神经元TRPV4电流相比,CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道介导的内向电流峰值增加(CCD大鼠电流峰值为310.19±9.17pA,正常大鼠为230.55±17.23pA,P<0.05)。CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道的电流峰值延迟(CCD大鼠为243.6s,正常大鼠为172.4s,P＜0.05)。0.1μg/ml秋水仙碱孵育2小时后,CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道电流峰值降低,且峰值时间延迟(230.10±12.10pA,199.1s,P＜0.05)5.微管解聚剂秋水仙碱对HEK293-TRPV4细胞TRPV4通道功能的影响0.1μg/ml秋水仙碱孵育2小时后,HEK293-TRPV4细胞的TRPV4通道电流峰值降低,且峰值时间延迟(正常HEK293-TRPV4细胞为412.50±27.15pA,131.6s;秋水仙碱组为219.53±5.24pA和42.7s,P＜0.05)。孵育秋水仙碱后,HEK293-TRPV4细胞的内向电流表现出典型的TRPV4通道的外向整流特性,但逆转电位更倾向于正相电位。6.微管解聚剂秋水仙碱对TRPV4通道表达的影响鞘内注射625μg/kg-1250μg/kg秋水仙碱时,TRPV4通道的基因表达明显降低,其中,鞘内注射1250μg/kg秋水仙碱2小时,TRPV4通道的基因表达下降最明显(P＜0.05)。当鞘内注射625μg/kg-1250μg/kg秋水仙碱时,TRPV4通道的蛋白表达显着降低,其中,鞘内注射1250μg/kg秋水仙碱2小时和4小时,TRPV4通道的蛋白表达下降最明显(P＜0.05)7.微管解聚剂秋水仙碱对TRPV4定位的影响组织免疫荧光的结果提示,鞘内注射1250μg/kg秋水仙碱未影响CCD大鼠背根神经节TRPV4的定位。DRG神经元的免疫细胞化学结果示,DRG神经元上胞膜表达的TRPV4多于胞浆内表达的TRPV4,并且秋水仙碱并未影响TRPV4的定位。结论1.微管解聚剂秋水仙碱缓解CCD大鼠的机械痛敏和热痛敏。2.秋水仙碱可抑带(?)TRPV4的表达,降低TRPV4通道的电流峰值,因此,TRPV4介导了秋水仙碱对CCD大鼠痛敏的缓解作用。目的1.研究微丝在CCD大鼠痛觉过敏中的作用。2.研究微丝对CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道功能和定位的影响,探讨微丝调控CCD大鼠痛觉过敏的机制。方法1.CCD模型的制备大鼠被随机分为CCD组和假手术组。戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后,沿L4-S1棘突作后正中偏右切口,暴露右侧L4-L5椎间外孔后,将每侧长4mm,外径0.63mm的中空的“L”形不锈钢棒沿L4-L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,恒定地压迫DRG及其邻近的神经根。不锈钢棒外套有内径0.51mm,30-40mm长的硅胶管,硅胶管的外端置于椎管壁外,内端随中空钢棒一起插入椎管内,硅胶管内充满肝素。硅胶管的外端是封闭的,只有注射药物时打开。术后用生理盐水冲洗切口,依次用4-0丝线缝合肌肉、筋膜和皮肤,并注射青霉素40万单位以预防感染。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组。术后大鼠没有发生伤侧肢体自噬现象。2.神经行为学的测定分别于手术后7天注射化学药物前及注射药物后1、2、4、6、8、24小时测量,排除痛觉表现不明显者(<5%)；所有的测量在一个安静的环境内进行,室温保持在26±0.5℃,且均使用单盲法。药物通过与压迫DRG的中空不锈钢管相连的硅胶管直接注射。大鼠机械缩足反射阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期的测量方法同第一部分。3.成年大鼠DRG神经元的培养CCD术后7天,取出手术侧L4-L5的DRG。细胞培养方法同第一部分。4.细胞活性检测成年大鼠DRG神经元在细胞松弛素B或鬼笔环肽培养基中培养2小时后,用于检测DRG神经元的活性,检测方法同第一部分。5.全细胞膜片钳记录TRPV4通道的电流同第一部分。6.免疫细胞化学同第一部分。结果1.微丝对CCD大鼠痛觉过敏的影响所有实验大鼠在手术前后及给药处理前后步态均正正常,足无畸形,评分均为1分,损伤前、后各组间无显着性差异。微丝解聚剂细胞松弛素B和细胞松弛素D皆可缓解CCD大鼠的机械痛敏和热痛敏(n=9,P＜0.01)。细胞松弛素B(200μg-300μg)可部分抑制CCD大鼠的痛敏,且此抑制作用呈剂量依赖性表现,然而,100μg细胞松弛素B无此抑制作用(P＞0.05,n=9)。CCD大鼠痛敏的缓解在注射细胞松弛素B后1小时出现,2小时达到高峰,持续少于24小时。微丝聚合剂鬼笔环肽单独注射对CCD大鼠的机械和热痛敏的影响无统计学意义(P＞0.05,n=9)。细胞松弛素B注射前1小时注射鬼笔环肽可以抑制细胞松弛素B对CCD大鼠痛敏的缓解作用(n=9)。2.微丝对CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道功能的影响CCD组TRPV4的电流峰值远高于假手术组(CCD组n=12,假手术组n=10,P＜0.05)。细胞松弛素B和细胞松弛素D均可显着抑制(?)TRPV4的电流峰值(CCD组为310.19±9.17pA,细胞松弛素B组为245.48±12.12pA,细胞松弛素D组为237.81±10.17pA,各组中n=12,P＜0.05)。这与二者对CCD大鼠痛敏的影响一致。经微丝解聚剂孵育后,DRG神经元的I/V曲线表现出典型的TRPV4外向整流的特性,然而,逆转电位更倾向于正相电位,这与微丝对TRPV4(?)降值电流的抑制相一致。CCD大鼠DRG神经元的峰值时间延迟(CCD组为243.60±20.00s,假手术组为200.37±15.40s,P＜0.05)。经微丝解聚剂孵育后,CCD大鼠DRG神经元TRPV4电流峰值时间提前(细胞松弛素B组为123.44±10.10s,细胞松弛素D组为193.76±12.40s,P＜0.05)。微丝稳定剂鬼笔环肽(10-SM)可导致TRPV4电流的峰值降低和延迟(80.87±5.42pA,311.72±14.56s,n=12,P＜0.01),这与鬼笔环肽对CCD大鼠痛敏的影响不一致。与鬼笔环肽对TRPV4电流影响一致的是,DRG神经元I/V曲线更倾向于正相电位。MTT实验结果表明,微丝的解聚剂和稳定剂对于DRG神经元的活性无影响(P＞0.05)。3.微丝对CCD大鼠DRG神经元TRPV4定位的影响CCD大鼠DRG神经元细胞膜上表达的TRPV4多于细胞浆中表达的TRPV4。经细胞松弛素B(10-4M)孵育2小时后,DRG神经元细胞膜上TRPV4的表达量明显降低(CCD组为83.62±2.14%,细胞松弛素B组为69.63±3.41%,P＜0.05)。此外,鬼笔环肽(10-SM)也导致DRG神经元细胞膜上TRPV4的表达量降低(54.24±2.44%,P＜0.05)结论1.微丝解聚缓解CCD大鼠的痛觉过敏,微丝稳定剂可消除微丝解聚剂的镇痛作用。2.微丝解聚抑伟TRPV4通道的电流峰值,降低神经元细胞膜上TRPV4的表达,因此,微丝通过TRPV4通道调节CCD大鼠的痛觉过敏。(本文来源于《山东大学》期刊2013-05-07）

范真真^[8]（2013）在《瞬时感受器电位离子通道4在大鼠背根神经节持续受压后异位放电中的作用》一文中研究指出研究背景下腰痛是现代社会一个困扰人类健康的重要问题,它不仅给患者的工作和生活带来极大的痛苦,而且对社会生产力发展也造成了严重的负影响。背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)作为感觉传入的初级神经元,在下腰痛的发病过程中起重要作用。各种损伤因素导致背根神经节持续受压(chronic compression of dorsal root ganglion, CCD)产生的根性神经痛是下腰痛最常见的致病原因。CCD可以明显提高受损DRG神经元的兴奋性,进而产生自发性疼痛、机械性的异常疼痛和热痛觉过敏,而且伴随着神经元的自发性放电增加,动作电位和电流阂值降低。受压的DRG神经元成为异位放电的来源,即使无交感神经活动或者内源性化学激活物质,仍存在自发性放电。DRG神经元上存在多种可能参与机械刺激传导的离子通道,其中在DRG上广泛分布且高表达的TRPV4(transient receptor potential vanilloid receptor4)离子通道是一种多觉感受器,参与了渗透压和伤害性机械刺激信号的传导。本课题组前期研究发现,CCD可以明显上调受损DRG神经元上TRPV4基因和蛋白的表达,而且证实TRPV4参与CCD导致的机械痛阂和热痛阈。另有研究发现,TRPV4对钙离子和钠离子都有通透性,TRPV4受体激活后引起细胞内钠离子和钙离子浓度的增加,异位放电增加。综合以上研究我们推测,TRPV4可能与受损DRG神经元的异位放电有关。制备CCD模型,观察DRG神经元的持续受压对大鼠行为学的影响,以及随着压迫时间的变化受损DRG神经元组织形态学的改变；采用在体神经纤维电生理技术观察CCD后受损DRG神经元异位放电情况及钉红(ruthenium red, RR)和佛波醇(4α-PDD)对异位放电的影响,明确TRPV4是否参与了CCD后受损DRG神经元的异位放电。研究目的利用在体神经纤维电生理技术记录DRG神经元持续受压后的异位放电情况,明确TRPV4是否参与了CCD后受损DRG神经元的异位放电。研究方法1.异位放电的记录1.1CCD模型的制备采用45只成年健康雄性Wistar大鼠,随机分为正常组(n=5)、CCD组(n=10)、钌红组(n=10)、佛波醇组(n=20)。 CCD组是在大鼠麻醉后,将“U”形钢棒的一端沿L5椎间孔的前壁上方水平插入椎管内,使之挤压L5DRG。正常组不进行任何操作。1.2术后3-8天,利用在体神经纤维电生理技术分别记录大鼠正常组DRG及CCD组、钌红(RR)组、佛波醇(4α-PDD)组受损DRG神经元的异位放电情况。2.神经行为学的测量及DRG神经元形态学观察2.1CCD模型的制备健康雄性Wistar大鼠35只,随机分为空白对照组、手术7天组、手术14天组、手术28天组、假手术7天组、假手术14天组、假手术28天组,每组5只。手术组是在大鼠麻醉后,将“U”形钢棒的一端沿L4及L5椎间孔的前壁上方水平插入椎管内,使之挤压L4和L5DRG神经元。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组,空白对照组不进行任何操作。分别于术后7天,14天和28天处死动物。2.2神经行为学的测量分别于术前1天及术后不同时期(2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天及28天)测量2.2.1动物运动功能(motor function)观察动物自然状态下随意行走的步态,采用记分制：1分=正常步态、足无畸形；2分=正常步态伴明显足畸形；3分=轻度步态障碍伴足下垂；4分=严重步态障碍伴肌无力。2.2.2机械刺痛阈值(Mechanical withdrawal threshold, MWT)和热辐射刺激缩爪反应潜伏期(Thermal withdrawal latency, TWL)的测量MWT的测量使用VonFrey Monofilaments机械痛刺激仪(BME-403型)。将大鼠放进铺有金属网格的透明玻璃箱里,使用各种强度的Von Frey针丝,由低到高刺激动物手术侧足底,缩爪或舔足为阳性反应。每根针丝测量5次,至少能够引发3次缩爪反应的针丝强度即为机械痛阈值。TWL的测量使用热痛刺激仪(BME-410A型),将大鼠放进铺有6mm厚的有机玻璃板的透明玻璃箱里,将热痛刺激仪放在有机玻璃板下方,使光源焦距照射动物后肢足底掌心,电子秒表记录从照射开始到引起后肢回缩反应时的潜伏期作为热痛觉观测指标。2.3DRG神经元组织形态学观察造模后7天、14天、28天取材,HE染色,光镜下观察背根神经节的组织形态学改变。结果1.CCD组可以记录到受损DRG神经元的异位放电,放电率约为67%,而正常组DRG神经元的异位放电率仅为4.5%,两者比较有统计学意义；2.以TRP家族阻断剂RR100μm (?)阵育受损DRG神经元,孵育5-10分钟后,受损DRG神经元的放电开始下降；孵育30分钟后,神经元的放电几乎被完全阻断。较CCD组受损DRG神经元异位放电的频率和波幅均明显下降(n=10,p＜0.05)；3.以TRPV4特异激动剂佛波醇(4a-phobol12,13-didecanoate,4a-PDD)1nm、1μm、10μm的剂量孵育受损DRG。孵育20-30分钟后,与CCD组受损DRG神经元异位放电相比,1nm、1μm4α-PDD组受损DRG神经元异位放电未出现明显变化(both p>0.05);10μm4α-PDD组受损DRG神经元放电频率和波幅均明显增加(n=10,p＜0.05)。4.神经行为学4.1运动功能所有动物在损伤前后步态均正常,足无畸形,评分均为1分,损伤前、后各组间无显着性意义；4.2机械痛阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期手术前,各组大鼠的机械缩爪阈基础值无差别。持续压迫明显降低大鼠损伤侧的机械痛阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期,手术组各时间段大鼠右后肢机械痛阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期的改变具有显着性差异(P＜0.05),空白对照组及各假手术组各时间段的两痛阈值无明显改变；5.HE染色结果显示：术后7天时受损的DRG神经元细胞出现明显组织水肿,间质血管充血,可见炎性细胞浸润；术后14天时受损的DRG神经元的神经外膜和神经纤维水肿明显,间质仍充血,神经元空泡样变性,核固缩,局部大量炎细胞浸润；术后28天时受损DRG神经元的神经外膜水肿减轻,神经内膜增厚,神经元细胞周围纤维结缔组织包绕,少许炎性细胞浸润。而空白对照组及各假手术组背根神经节病理改变不明显。结论CCD明显增加受损DRG神经元的异位放电,TRPV4参与介导了CCD后受损DRG神经元的异位放电。(本文来源于《山东大学》期刊2013-04-20）

范真真,曲玉娟,魏慧,王永慧,马剑锋^[9]（2013）在《瞬时感受器电位离子通道4在大鼠背根神经节持续受压后异位放电中的作用》一文中研究指出目的:利用在体神经纤维电生理技术记录大鼠背根神经节(DRG)持续受压(CCD)后的异位放电情况,明确瞬时感受器电位离子通道4(TRPV4)是否参与了CCD后受损DRG的异位放电。方法:共采用35只Wistar大鼠。制备大鼠DRG的CCD模型,分别于术前和术后测量损伤侧的机械痛阈和热辐射刺激缩爪反应潜伏期。利用在体神经纤维电生理技术分别记录正常组大鼠DRG及CCD组、CCD+钌红(RR)组、CCD+佛波醇(4α-PDD)组受损DRG神经元的异位放电情况。结果:持续压迫明显降低大鼠损伤侧的机械痛阈和热辐射刺激缩爪反应潜伏期(n=30,P<0.05);CCD组可以记录到受损DRG神经元的异位放电,放电率约为67%,而正常组DRG的异位放电率约为4.5%;以TRP家族阻断剂钌红(RR)100μm孵育受损DRG,较CCD组受损DRG神经元异位放电的频率和波幅均明显下降(n=10,P<0.05);以TRPV4特异性激动剂佛波醇(4α-PDD)10μm孵育受损DRG,较CCD组受损DRG异位放电频率和波幅均明显增加(n=10,P<0.05)。结论:CCD后受损DRG可出现异位放电,TRPV4参与了CCD后受损DRG的异位放电。(本文来源于《中国康复医学杂志》期刊2013年03期）

张杨,王永慧,丁欣利,王艳琴,王荣^[10]（2010）在《TRPV4在介导大鼠背根神经节持续受压后机械和热痛敏中的作用》一文中研究指出目的:观察持续机械压迫(CCD)对瞬时感受器电位离子通道4(TRPV4)基因、蛋白表达及功能的影响,明确TRPV4是否参与CCD导致的机械和热痛敏。方法:建立CCD模型后,分别于手术前及手术后第7天、第14天及第28天取材前测量运动功能、机械刺激缩爪反应阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期。为了测量TRPV4反义核苷酸干扰对机械和热痛阈值的影响,在蛛网膜下腔内注入TRPV4寡脱氧核苷酸(ODN)40μg/d,每天1次,第7天后测量大鼠行为学变化。使用实时定量RT-PCR检测TRPV4基因表达的变化,Western blot检测TRPV4蛋白质表达量的变化,激光共聚焦检测低渗溶液和佛波醇(4α-PDD)刺激背根神经节(DRG)神经元后细胞内钙离子浓度的变化。结果:所有动物在损伤前后步态均正常,持续压迫明显降低大鼠的机械和热痛阈,TRPV4干扰可部分逆转该痛敏。持续机械压迫可以明显增加TRPV4基因和蛋白的表达,手术后第7天,第14天和第28天,TRPV4mRNA的表达分别为假手术组大鼠的4.29倍、2.95倍和2.48倍,蛋白表达量分别为假手术组大鼠的4.34倍,3.88倍和2.47倍。持续机械压迫后,对低渗溶液和4α-PDD产生反应的DRG神经元的比例数增加,细胞内钙的峰值增高。这种反应被TRPV4反义ODN所抑制。结论:CCD可以上调TRPV4的基因、蛋白表达,敏化通道的功能;TRPV4参与介导CCD导致的机械和热痛敏。(本文来源于《中国康复医学杂志》期刊2010年12期）

背根神经节持续受压论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

目的:探讨大鼠背根神经节持续受压(chronic compression of the dorsal root ganglion,CCD)后瞬时感受器电位离子通道香草素亚族受体4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)在脊髓背角中的蛋白表达及分布规律。方法:选取清洁级雄性Wistar大鼠30只,按随机数字表法分组:空白对照组5只,手术组25只(术后4天、7天、14天、28天各5只;免疫荧光组5只)。制备大鼠背根神经节持续受压模型,于术后4天,7天,14天及28天,测量机械刺激缩爪反应痛阈,观察机械痛阈的变化;利用western blot技术检测空白对照组及术后4天,7天,14天及28天,手术侧及对侧脊髓背角TRPV4蛋白表达的变化;利用免疫荧光技术检测术后4天,手术侧与对侧脊髓背角TRPV4阳性细胞分布。结果:大鼠背根神经节持续受压后4—14天,机械痛阈值明显下降(P<0.001);术后4—7天,手术侧脊髓背角TRPV4表达升高(P<0.01),对侧无明显变化;手术侧脊髓背角内TRPV4阳性细胞数目高于对侧(P=0.0008)。结论:大鼠背根神经节持续受压后,机械痛阈下降的同时,手术侧脊髓背角内TRPV4蛋白表达上调及阳性数目增多,TRPV4可能参与CCD后病理性神经痛的中枢敏化机制。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

背根神经节持续受压论文参考文献

[1].贾磊.ERK-TRPV4通路在大鼠背根神经节持续受压致痛觉敏感中的作用机制研究[D].山东大学.2019

[2].曲玉娟,张晓,魏慧,怀娟,张杨.大鼠背根神经节持续受压后脊髓背角TRPV4蛋白表达及分布的变化[J].中国康复医学杂志.2017

[3].张晓,曲玉娟,贾磊,滕永波,岳寿伟.大鼠脊髓背角TRPV4在背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用[J].中国康复医学杂志.2017

[4].曲玉娟.TRPV4-MAPK通路在大鼠背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用机制研究[D].山东大学.2016

[5].张晓.大鼠脊髓背角TRPV4在背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用[D].山东大学.2016

[6].王洁.Ca~(2+)内流对大鼠背根神经节持续受压后痛觉过敏的调控及机制研究[D].山东大学.2015

[7].魏慧.细胞骨架对大鼠背根神经节持续受压后痛觉过敏的调控及机制研究[D].山东大学.2013

[8].范真真.瞬时感受器电位离子通道4在大鼠背根神经节持续受压后异位放电中的作用[D].山东大学.2013

[9].范真真,曲玉娟,魏慧,王永慧,马剑锋.瞬时感受器电位离子通道4在大鼠背根神经节持续受压后异位放电中的作用[J].中国康复医学杂志.2013

[10].张杨,王永慧,丁欣利,王艳琴,王荣.TRPV4在介导大鼠背根神经节持续受压后机械和热痛敏中的作用[J].中国康复医学杂志.2010

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