导读:本文包含了病毒基因组复制论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:土贝母苷甲(TBMS1),单纯疱疹病毒(HSV)1型和2型,细胞病变效应(CPE),空班形成抑制试验
病毒基因组复制论文文献综述
王巧利,于立坚,王一飞,马润娣,李风[1]（2019）在《土贝母苷甲对单纯疱疹病毒1型和2型的增殖和基因组复制的抑制效应》一文中研究指出土贝母苷甲(Tubeimoside 1,TBMS1),简称苷甲,是一种独特的,由贝咢苷元和4种单糖(葡萄糖、鼠李糖、木糖和阿拉伯糖)组成的五环叁萜皂苷。以前的研究证实,苷甲具有抗人免疫缺陷病毒的活性。本文研究苷甲对单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)1型和2型增殖和基因组复制的影响。从土贝母块茎中提取、分离苷甲(在本实验中使用的纯度大于95%),以空斑法测定病毒滴度,通过观察致细胞病变效应和空班形成抑制试验来检测苷甲的抗病毒活性,用实时定量PCR技术检测苷甲对HSV-1和HSV-2基因组复制的影响。结果显示,苷甲显着抑制HSV-1和HSV-2毒株的增殖,显着抑制HSV-1和HSV-2的UL27、UL52和UL54叁个基因的拷贝数,且其抑制作用呈明显量效依赖关系。无毒高浓度(0.39μg/mL～0.78μg/mL)的苷甲对阿昔洛韦(acyclovir,ACV)耐药毒株HSV-1/106的增殖也显示抑制活性。本研究结果揭示苷甲具有显着抑制HSV-1和HSV-2增殖及基因组复制的活性,无毒高浓度苷甲对HSV-1/106耐药毒株的增殖也显示抑制活性。(本文来源于《病毒学报》期刊2019年04期）
肖榕[2]（2019）在《利用猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛选猪流感病毒复制必需宿主基因》一文中研究指出猪流感(Swine influenza,SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的猪的一种呼吸道传染病,其发病率可高达100%。猪流感常常继发于猪繁殖与呼吸综合征、支原体肺炎、圆环病等,之后会引起免疫损伤,进而延长呼吸道疾病的病程,提高死亡率。因此,在规模化养猪场中,猪流感普遍存在且难以根除,对生猪养殖产业具有重大威胁。A型流感是一种重要的人畜共患病,而猪又是禽、猪、人流感病毒共同的易感宿主,是流感病毒基因重组或重配的“混合器”以及产生流感病毒新流行毒株的“孵育器”,因此猪感染流感病毒后使病毒极易发生跨种传播。基于猪流感在我国乃至世界范围内对生猪健康高效养殖以及公共卫生产生的重大威胁,预防和控制猪流感病毒的流行具有至关重要的意义。本研究利用已有的猪肾细胞CRISPR/Cas9全基因组敲除文库(PK-15-GeCKO)筛选当前较为流行的欧亚禽系猪流感病毒复制必需的宿主基因。并在稳定表达Cas9蛋白的PK-15细胞系(PK-15-Cas9)上单个敲低筛选到的某些基因的表达,初步验证敲低该基因后抗流感病毒效果。同时为了更接近自然感染状态,选择新生猪气管上皮(newborn pig trachea epithelial,NPTr)细胞系为细胞模型构建全基因组敲除文库,因此本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的NPTr细胞系(NPTr-Cas9-Blast)。本研究为筛选SIV复制必需宿主基因奠定基础,为培育抗SIV感染的基因编辑猪提供理论依据。主要研究内容如下:1 SIV感染PK-15-GeCKO筛选病毒复制必需宿主基因在感染SIV 96 h后,对照组细胞(PK-15-Cas9)全部死亡,测定对照组和实验组(PK-15-GeCKO)病毒血凝价,将存活细胞扩大后进行下一轮感染。四轮感染筛选后,实验组细胞几乎全部存活,且病毒几乎不再增殖。对二、叁、四轮筛选后的存活细胞进行高通量测序,对筛选到的基因进行基因本体论(Gene Ontology,GO)分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析等生物信息学分析,表明在猪全基因组范围内筛选到了SIV感染猪所必需宿主基因的候选基因,且这些基因表达的蛋白涉及多个生物学过程、细胞组分和分子功能等。2初步验证候选基因的对病毒增殖的影响根据筛选结果选择其中富集程度较高的5个基因的sgRNA,通过慢病毒感染的方式将sgRNA分别整合至PK-15-Cas9中,对获得的多克隆基因敲除细胞系的抗病毒效应进行初步验证,在多克隆基因敲除细胞系上感染SIV,分别于12、24和36 h收取上清测定病毒滴度。为了确定这些基因的敲低是否特异地影响了猪流感病毒的增殖,在基因敲除细胞系上感染了人源流感病毒,于36 h取上清测定病毒滴度,发现SLC、R6、GG和AD等4个基因的敲低对猪流感和人流感病毒在猪的细胞上具有不同程度的抑制作用,可进行进一步的功能验证。3构建稳定表达Cas9蛋白的NPTr细胞系考虑到流感病毒首先攻击的是呼吸道器官,因此选择NPTr细胞为模型进行二次筛选。在本研究中构建了稳定表达Cas9蛋白的NPTr细胞系(NPTr-Cas9-Blast):首先摸索了合适的慢病毒包装条件以及慢病毒感染条件,在293T细胞上包装了携带Cas9蛋白的慢病毒,并感染至野生型NPTr细胞中,利用有限稀释法纯化细胞系,之后将已知具有敲除活性的靶向内源性基因ANPEP的sgRNA通过慢病毒感染的方式整合至候选细胞系中,根据T7E1酶切检测和测序结果选择Cas9敲除活性最高的细胞系确定为用于构建全基因组敲除文库的NPTr-Cas9-Blast。(本文来源于《华中农业大学》期刊2019-06-01）
郭瑞[3]（2019）在《艾滋病感染早期病毒基因组突变对其复制适应性的影响研究》一文中研究指出人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)是引起艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)的病原体。在HIV-1感染人体后,在宿主免疫系统的选择压力下,病毒基因组会产生逃逸突变,致使病毒的复制能力降低,即造成适应性(fitness)损伤,但是这种损伤有时可以被补偿性突变修复。最近一些研究表明,在艾滋病感染早期,T细胞免疫逃逸位点会使病毒的复制适应性下降,由此可导致血浆病毒载量从峰值降低到调定点(set point)水平,进而使艾滋病病人的致病性和传染能力降低。因此,研究感染早期的病毒在宿主免疫选择压力下产生的突变对病毒适应性的影响,将有助于深入理解病毒适应性与感染进程之间的关系,并为研制艾滋病疫苗提供理论依据。在以往的研究中,研究者通常采用异源性病毒基因组来确定免疫逃逸突变对病毒适应性的影响,即在完全不相关病毒基因组中检测。但由于在异源性病毒基因组中可能会存在不同的补偿性突变,这样的检测系统无法准确地阐明突变对病毒适应性的影响。因此,从根本上讲,这种研究方法仅能检测免疫逃逸相关突变对异源性病毒的适应性影响。随着人们对于HIV感染机制的认知和技术手段的成熟,目前多通过获得建立初始感染的奠基病毒(transmitted/founder virus,T/F)的感染性克隆(infectious molecular clone,IMC),研究在免疫选择压力下产生的逃逸突变对其原始野毒型奠基病毒的真实适应性影响。在检测体系上,采用普遍接受的竞争感染培养法,但是需要插入远离待测突变位点的报告基因来区别体系中的病毒基因组,而由于HIV-1基因组的高重组特性,无法排除待测突变位点和报告基因间的重组情况对适应性检测准确性的影响。因此本篇论文采用的是PCR和测序的方法,在竞争性感染的培养物上清中,确定体系中每个突变位点所占的比例来准确地判定其对病毒适应性的影响。为了重现病人体内病毒的进化过程,本课题组在前期研究中,以来自同一宿主的病毒为研究对象,通过对HIV-1感染者CH0185纵向血浆样本中的病毒全基因组进行测序,推测并合成了T/F病毒和感染后6个月(6-mo)病毒的IMC,发现经过这一时期,病毒产生的积累性突变使病毒适应性下降。为了阐明在这些积累性突变中有哪些突变会对病毒适应性造成影响,本论文将通过分子克隆技术将不同单点突变构建到同源T/F病毒的IMC中,并对病毒进行感染力测定,随后通过平行性感染实验评价病毒的复制能力,再通过竞争性感染实验比较奠基病毒和突变体病毒所占比例的变化情况来评价突变体病毒的相对适应性。我们首先将同源突变体的IMC质粒转染到HEK293T细胞中,制备得到了CH0185病人的T/F病毒(CH0185-T/F)及其7种同源突变体病毒。通过验证病毒蛋白的表达情况并对病毒进行p24定量,确认了病毒能够正常包装且具有正常的感染力。为了评价同源突变体病毒在宿主细胞中的适应性,我们在健康人的PBMC细胞中进行了平行性感染实验和竞争性感染实验。结果显示病毒均能够正常复制;在竞争感染体系中,CH0185-T/F的复制能力明显高于Gag_(S66P)、Gag_(Y79H)和Gag_(Q182G)突变体病毒,表明这3个在艾滋病感染早期产生的突变位点会使病毒的适应性降低;其余4种突变体病毒Gag_(V118E)、Gag_(G374R)、Rev_(P67S)、Nef_(G63E)与CH0185-T/F的复制适应性没有明显差异。Y79H突变发生在CTL反应特异性识别的位于Gag上的表位(GTEELRSLY)。而Q182G突变位于Gag上的TL9表位(TPQDLNTML)。而且这两个表位已被证明与免疫逃逸突变相关,推测可能会引起病毒适应性的损伤。我们通过竞争性感染实验证明了Gag_(Y79H)和Gag_(Q182G)可以对病毒的适应性造成损伤。综上所述,本论文在前期工作的基础上,建立了更为合理的利用IMC质粒在PBMC细胞中评价HIV-1病毒突变对适应性影响的方法和体系,并且对CH0185病人的7种同源突变体病毒对于病毒适应性的影响进行了初步的评价。在后续的研究中我们将通过更多病人T/F病毒及其突变的研究,系统阐明艾滋病感染早期病毒基因组中产生的突变对病毒适应性的影响,这些结果将有助于进一步理解病毒与宿主免疫系统间的相互作用。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）
魏宁[4]（2019）在《新城疫病毒微型基因组的构建及M、V、W蛋白对病毒复制与转录调控的研究》一文中研究指出新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)为单股负链不分节段的RNA病毒,由于其基因组较大,约15 kb,直接在全长基因组中进行分子操作存在技术困难,对NDV复制转录的机制及相关蛋白功能的研究会产生巨大障碍。故采用微型基因组(Minigenome)技术,即用报告基因替代病毒编码区,只保留与病毒基因复制和转录相关的基本调控序列。NDV基因组的复制和转录依赖于RNP复合物的NP、P和L叁种蛋白,其它的病毒蛋白可能会与RNP复合物发生相互作用,而其是否参与调控病毒复制和转录所知甚少。本研究设计了四种微型基因组方案,通过对不同方案进行验证,明确了微型基因组构建过程所需要的序列信息及插入方式,同时比较了在不同启动子下表达效率的差异。此外,对基础微型基因组平台进行特殊改造,创建了复制缺陷型微型基因组,并对M、V及W蛋白对病毒复制与转录过程的影响进行了初步研究。主要的研究结果如下:1.四种NDV微型基因组的构建。设计方案:(1)按照模拟病毒基因组的方式,将报告基因EGFP反向插入,两侧分别为5’Trailer与3’Leader的调控序列,命名为Mini;(2)在Mini基础上,缺失相应的GE、GS及UTR序列,命名为Mini2;(3)按照构建感染性克隆的方式,将EGFP正向插入,两侧分别为5’Leader与3’Trailer的调控序列,命名为MG;(4)在MG基础上,缺失相应的GE、GS及UTR序列,命名为MG2。四种微型基因组分别克隆在含T7启动子的pUC19载体中,与NP、P、L及T7 RNA聚合酶表达质粒共转染BHK-21细胞分析EGFP的表达,发现仅Mini具有功能性。结果表明报告基因只能反向插入,GE-5’UTR、3’UTR-GS是微型基因组必不可少的基因元件。2.两种启动子对微型基因组表达效率的影响。将Mini微型基因组分别克隆到含T7启动子与鸡β-actin启动子的载体中,分别为pUC19-Mini-EGFP与pCAGGS-Mini-EGFP。通过对表达效率的分析,结果发现T7启动子远高于鸡β-actin启动子。3.复制缺陷型微型基因组的构建。为了独立研究病毒的复制与转录两个过程,将微型基因组5’端Trailer序列缺失,导致病毒基因组(vRNA)复制产生3’端缺失Trailer(ΔT)的cRNA,ΔT cRNA将不能启动复制产生vRNA,以此可以区分基因的复制与转录过程,命名为pUC19-Mini-ΔT。4.M、V和W蛋白对病毒复制和转录调控的作用。为了定量报分析报告基因的表达,在正常(复制敏感型)与复制缺陷型的两种微型基因组中采用萤火虫荧光素酶报告基因,分别命名为pUC19-Mini-Lu和pUC19-Mini-ΔT-Luc。将M、V和W表达质粒与两个系统分别共转染细胞,分析萤火虫荧光素酶活性,结果显示仅V蛋白对病毒基因组的转录有抑制的作用,而M和W蛋白没有影响。综上所述,明确了微型基因组的构建方式,并对微型基因组的表达进行了的优化。同时利用正常与复制缺陷型的两种微型基因组,确定了V蛋白对病毒的转录有影响。本研究为了解NDV基因组的复制与转录及相关蛋白的作用奠定了基础。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-04-01）
邱华,毛德文,龙富立,刘雪梅,王明刚[5]（2018）在《白花香莲解毒颗粒对HBV全基因组1.3倍体细胞模型病毒复制与表达的影响》一文中研究指出目的:观察白花香莲解毒颗粒对HBV全基因组1. 3倍体Hep G2细胞模型(HBV 1. 3P)病毒复制与表达的影响。方法:按照白花香莲解毒颗粒最优提取工艺制备稠膏,并使用无菌纯水配制为0. 1g稠膏/ml母液,滤纸及0. 45μM、0. 22μM孔径PVDF超滤膜依次过滤后,应用MEM完全培养基稀释为8个浓度梯度的细胞干预液。CCK-8法测定细胞干预液对HBV 1. 3P增殖的抑制率; q PCR法检测干预24h、48h后细胞上清液中HBV DNA水平;化学发光法检测细胞上清液中HBs Ag、HBeAg表达量;免疫荧光法测定细胞内HBs Ag表达强度。结果:(1)白花香莲解毒颗粒的去乙酰车叶草酸甲酯含量为1. 23mg/g。(2)CCK-8法的最佳检测时间是加入试剂后2h,适宜细胞数范围是2×103～1. 2×104个。在0. 04～0. 625mg/ml范围内白花香莲解毒颗粒对HBV 1. 3P增殖无明显抑制作用;在1. 25～5mg/ml范围内则会显着抑制HBV 1. 3P增殖。(3)0. 625mg/ml是白花香莲解毒颗粒的最佳药物浓度,其干预48h HBV DNA的抑制率达(41. 86±5. 35)%,并能显着降低细胞上清液及细胞内HBs Ag、HBeAg的表达。结论:白花香莲解毒颗粒体外具能较强地抑制HBV复制及HBs Ag、HBeAg表达的生物活性。(本文来源于《中西医结合肝病杂志》期刊2018年06期）
殷利眷[6]（2018）在《利用CRISPR-Cas基因编辑技术设计靶向HIV-1基因组抑制病毒复制研究》一文中研究指出人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染导致的获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)仍是一项全球主要公共卫生问题。目前主要的治疗手段是多种药物联合使用的抗反转录病毒治疗,但是该治疗手段只能抑制患者体内病毒复制,降低病毒载量。而彻底治愈HIV感染需要能够完全清除、破坏潜伏感染细胞中的病毒基因组,或者清除潜伏感染的细胞。基因编辑技术的突破为通过基因治疗删除潜伏感染细胞中的HIV基因组燃起希望。成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced palindromic repeats(CRISPR))/相关的核酸酶 9(associated nuclease 9,Cas9)系统是一种新兴的基因编辑技术,由一段guideRNA(gRNA)指导靶向双链DNA切割,具有清除、扰乱病毒潜藏库中整合的HIV基因组或者HIV感染的细胞,抑制病毒感染与复制,彻底治愈HIV的潜力。CRISPR/Cas13a是RNA编辑系统,由一段crRNA指导靶向单链RNA切割。目前研究主要利用CRISPR/Cas9靶向切割整合的HIV基因组,导致DNA双链断裂,断裂的双链DNA在非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复下导致插入或者缺失突变,失活病毒基因组。那么CRISPR/Cas9能否靶向切割整合前的HIV DNA,抑制病毒感染与复制?CRISPR/Cas9在HIV-1复制周期中具体靶向作用阶段有哪些?另外,能否利用CRISPR/Cas13a编辑HIV-1 RNA抑制病毒复制,乃至清除病毒感染的细胞,将是一个非常重要的研究方向。基于以上科学问题,本研究首先设计sgRNA靶向HIV-1基因组,验证了CRISPR/Cas9可编辑显着抑制HIV-1复制,通过基因测序验证了 Cas9/sgRNA编辑导致病毒双链DNA断裂,并发生非同源末端连接修复,导致病毒基因组发生插入或者缺失突变。进一步研究CRISPR/Cas9在HIV-1复制周期中的作用。本实验利用HIV-1复制阶段特异的引物,进行实时荧光定量PCR,检测HIV-1复制周期中反转录早期、反转录晚期以及整合的HIV基因组拷贝数。研究结果发现在Cas9/sgRNA作用下,反转录晚期以及整合的病毒基因组拷贝数均显着降低;揭示除非同源末端连接修复断裂的dsDNA,引入插入或者缺失突变,失活病毒基因组外,Cas9/sgRNA处理也可直接降低病毒基因组拷贝数抑制病毒复制,推断是Cas9切割HIV DNA后,断裂的双链DNA没有被及时修复而发生降解。HIV-1反转录发生并完成于细胞质中。为明确Cas9可否在细胞质中编辑反转录形成的HIVDNA,抑制HIV-1复制。本研究利用无核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)的细胞质分布的 Cas9(Cas9-delNLS),发现 Cas9-delNLS/sgRNA同样可以显着抑制新感染的HIV-1的复制,而对细胞核整合的潜伏感染的HIV-1没有抑制效果,确证了 Cas9能够在细胞质中靶向编辑新感染的HIV-1。另外,除了对HIV DNA进行基因编辑外,本研究利用具有RNase活性的Leptotrichia buccalis(Lbu)Cas13a,研究Cas13a-crRNA在真核细胞中编辑HIV-1 RNA,抑制HIV-1复制情况。首先本研究设计了靶向GFP的crRNA,利用GFP荧光报告系统,检测CRISPR/Cas13a在真核细胞内的编辑效率;之后,依据LbuCas13a CRIPSR RNA(crRNA)设计原则以及HIV-1基因功能,设计了靶向HIV-1 TLR R区域,tat,rev,gag等编码基因的crRNA。研究结果表明,靶向HIV-1LTR启动子以及基因编码区,Cas13a/crRNA同样显着干扰HIV-1的复制。通过构建RNase活性缺陷的dCas13a,证实Cas13a干扰HIV复制依赖其RNase活性。综上所述,本论文全面深入研究了 CRISPR/Cas9在HIV-1复制周期中的具体作用,发现CRISPR/Cas9不仅可以靶向编辑整合的HIV-1基因组,也可以靶向编辑细胞质中的病毒基因组。同时,揭示了除NHEJ修复导致病毒基因组插入或者缺失突变外,CRISPR/Cas9编辑也可通过降低HIV-1基因组拷贝数,抑制病毒复制。另外,研究发现利用CRISPR/Cas13a编辑HIV-1 RNA,有效干扰HIV-1复制,有望联合利用Cas9和Cas13a交叉编辑HIV-1 DNA和RNA。这些研究结果为彻底清除HIV-1原病毒和阻止HIV-1感染提出新的思路,为HIV-1感染疾病的预防和治疗提供重要研究参考。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2018-05-18）
付梦姣[7]（2018）在《gga-miR-130b与gga-miR-454靶向作用于IBDV基因组和细胞SOCS5&6抑制病毒复制》一文中研究指出传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种危害雏鸡的急性和高度接触性传染病。IBDV能够造成靶细胞(B细胞前体细胞)的损伤,引起免疫抑制和疫苗免疫失败,从而增加机体对其他病原体的易感性。MicroRNAs(miRNAs)是一类约22个核苷酸大小的单链RNA分子,这类分子能够通过与靶基因的结合而调控基因转录后的翻译过程。目前已知,miRNAs参与多种细胞生命活动过程并且在宿主的抗病毒反应中扮演重要角色,然而在IBDV感染和致病过程中miRNA起何作用尚不十分清楚。在本研究中,利用IBDV感染DF-1细胞并检测IBDV感染前后宿主细胞内miRNAs表达的变化。根据获得的高通量测序结果,从中筛选出8条miRNAs作为进一步研究对象,通过检测miRNAs对IBDV病毒复制的影响,发现miR-130b和miR-454能够明显地抑制病毒蛋白的表达,进一步通过qRT-PCR、Western Blot、IFA、TCID50等方法,在蛋白水平、mRNA水平以及病毒复制水平证明miR-130b和miR-454能够抑制IBDV在DF-1细胞中复制。此外,I型干扰素作为重要的抗病毒分子,在宿主的抗病毒反应中扮演着重要的角色,利用qRT-PCR检测poly(I:C)刺激或IBDV感染后DF-1细胞中1型干扰素的表达水平发现,miR-130b和miR-454能够明显增强DF-1细胞中IFN-β和转录因子IRF3以及p65的mRNA水平。然而抑制miR-130b或miR-454后,IFN-β、IRF3和p65的mRNA水平又明显下降。实验结果证明miR-130b和miR-454能够抑制IBDV复制并且增强宿主Ⅰ型干扰素的表达。为了探究miRNAs发挥作用的机理,利用多个生物信息学软件对miRNAs在IBDV基因组和宿主细胞内的靶点进行了预测,结果发现IBDV基因组上存在能与miR-130b和miR-454的种子区互补结合的区域。为了验证miRNAs对其靶基因的作用,利用qRT-PCR、Western Blot以及双荧光素酶报告系统检测靶基因表达情况,结果证实miRNAs能够抑制靶基因的mRNA及蛋白表达。进一步研究表明,宿主细胞内的细胞因子信号转导抑制因子5(SOCS5)以及细胞因子信号转导抑制因子6(SOCS6)分别为miR-130b与miR-454的靶基因,并且miR-130b和miR-454能够抑制靶基因的转录及翻译。SOCS家族蛋白是JAK-STAT通路信号转导的抑制因子,通过检测miRNAs对STATs的表达及STAT1磷酸化的影响发现,miR-130b和miR-454能够明显提高STATs基因转录水平以及STAT1在701位酪氨酸的磷酸化水平。然而抑制miRNA表达后,STAT1磷酸化水平有明显的下降。综上所述,本研究发现miR-130b和miR-454通过直接靶向作用于IBDV基因组抑制病毒复制,同时还可以通过抑制宿主细胞内靶基因SOCS的表达上.调IFN-β的表达水平,增强宿主抗病毒应答。这些结果说明miR-130b和miR-454在宿主抵抗IBDV感染的过程中发挥重要作用。(本文来源于《中国农业大学》期刊2018-05-01）
胡玉珍,陈普成,丁蕾蕾,赵玉博,姜永萍[8]（2018）在《鸭瘟病毒疫苗株基因组复制非必需区的筛选》一文中研究指出为探寻鸭瘟病毒(DEV)基因组中的复制非必需区,本研究在已建立的DEV疫苗株5粘粒拯救系统的基础上,利用转座子随机插入技术,将含eGFP表达框架的基因片段随机插入DEV US区,救获两株表达绿色荧光蛋白的重组DEV(rDEV-us7eGFP、rDEV-us8us1eGFP)。将两株重组病毒在鸡胚成纤维细胞中连续传至20代后,通过PCR、荧光表达鉴定分析,结果显示gfp基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果表明,重组病毒在CEF中的增殖效率与DEV疫苗株无显着差异。攻毒保护实验结果表明,将rDEV-us7eGFP和rDEV-us8us1eGFP以10~5TCID_(50)的剂量免疫SPF鸭后,其对鸭瘟强毒攻击的保护效率与DEV疫苗株一致,均为100%。本研究成功筛选到DEV基因组中的两个可供外源基因插入的复制非必需区,分别位于us7基因内部及us8与us1基因之间,为以DEV为载体构建相关重组疫苗奠定了重要基础。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2018年10期）
杨搏,陈泽华,韩春燕,么帅,祁小乐[9]（2018）在《传染性法氏囊病病毒基因组A节段3'-UTR对病毒复制影响的研究》一文中研究指出为探究传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组A节段3'-UTR是否影响IBDV的复制,本实验应用融合PCR技术将IBDV弱毒Gt株A节段的3'-UTR替换为超强毒Gx株的相应区段,并利用反向遗传操作系统拯救嵌合病毒r Gt-Gx3'UTR,对拯救病毒进行鉴定。结果显示嵌合病毒拯救成功,Gt株的RNA依赖的RNA聚合酶既能识别Gt株的3'-UTR,也能识别超强毒Gx株的3'-UTR。通过比较嵌合病毒与亲本病毒的体外复制曲线,表明3'-UTR能够影响IBDV的复制。3'-UTR二级结构的预测结果表明其可能是以特定的二级结构而非一级序列发挥其功能。本研究为认识IBDV复制特点奠定了基础。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2018年03期）
付梦姣,王彬,王永强,李晓齐,曹红[10]（2017）在《gga-miR-130b通过靶向IBDV基因组和SOCS5并抑制病毒复制》一文中研究指出引言传染性法氏囊病(IBD)是一种主要危害雏鸡的急性高度传染性病毒病,其病原IBDV通过损伤靶细胞-B淋巴细胞导致机体免疫抑制,造成机体对其它病原易感和疫苗免疫失败~([1]),给养鸡业带来了巨大的经济损失。MicroRNA(miRNAs)是细胞产生的一类长度约21-24个核苷酸的小RNA分子,(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集》期刊2017-08-20）
病毒基因组复制论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
猪流感(Swine influenza,SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的猪的一种呼吸道传染病,其发病率可高达100%。猪流感常常继发于猪繁殖与呼吸综合征、支原体肺炎、圆环病等,之后会引起免疫损伤,进而延长呼吸道疾病的病程,提高死亡率。因此,在规模化养猪场中,猪流感普遍存在且难以根除,对生猪养殖产业具有重大威胁。A型流感是一种重要的人畜共患病,而猪又是禽、猪、人流感病毒共同的易感宿主,是流感病毒基因重组或重配的“混合器”以及产生流感病毒新流行毒株的“孵育器”,因此猪感染流感病毒后使病毒极易发生跨种传播。基于猪流感在我国乃至世界范围内对生猪健康高效养殖以及公共卫生产生的重大威胁,预防和控制猪流感病毒的流行具有至关重要的意义。本研究利用已有的猪肾细胞CRISPR/Cas9全基因组敲除文库(PK-15-GeCKO)筛选当前较为流行的欧亚禽系猪流感病毒复制必需的宿主基因。并在稳定表达Cas9蛋白的PK-15细胞系(PK-15-Cas9)上单个敲低筛选到的某些基因的表达,初步验证敲低该基因后抗流感病毒效果。同时为了更接近自然感染状态,选择新生猪气管上皮(newborn pig trachea epithelial,NPTr)细胞系为细胞模型构建全基因组敲除文库,因此本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的NPTr细胞系(NPTr-Cas9-Blast)。本研究为筛选SIV复制必需宿主基因奠定基础,为培育抗SIV感染的基因编辑猪提供理论依据。主要研究内容如下:1 SIV感染PK-15-GeCKO筛选病毒复制必需宿主基因在感染SIV 96 h后,对照组细胞(PK-15-Cas9)全部死亡,测定对照组和实验组(PK-15-GeCKO)病毒血凝价,将存活细胞扩大后进行下一轮感染。四轮感染筛选后,实验组细胞几乎全部存活,且病毒几乎不再增殖。对二、叁、四轮筛选后的存活细胞进行高通量测序,对筛选到的基因进行基因本体论(Gene Ontology,GO)分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析等生物信息学分析,表明在猪全基因组范围内筛选到了SIV感染猪所必需宿主基因的候选基因,且这些基因表达的蛋白涉及多个生物学过程、细胞组分和分子功能等。2初步验证候选基因的对病毒增殖的影响根据筛选结果选择其中富集程度较高的5个基因的sgRNA,通过慢病毒感染的方式将sgRNA分别整合至PK-15-Cas9中,对获得的多克隆基因敲除细胞系的抗病毒效应进行初步验证,在多克隆基因敲除细胞系上感染SIV,分别于12、24和36 h收取上清测定病毒滴度。为了确定这些基因的敲低是否特异地影响了猪流感病毒的增殖,在基因敲除细胞系上感染了人源流感病毒,于36 h取上清测定病毒滴度,发现SLC、R6、GG和AD等4个基因的敲低对猪流感和人流感病毒在猪的细胞上具有不同程度的抑制作用,可进行进一步的功能验证。3构建稳定表达Cas9蛋白的NPTr细胞系考虑到流感病毒首先攻击的是呼吸道器官,因此选择NPTr细胞为模型进行二次筛选。在本研究中构建了稳定表达Cas9蛋白的NPTr细胞系(NPTr-Cas9-Blast):首先摸索了合适的慢病毒包装条件以及慢病毒感染条件,在293T细胞上包装了携带Cas9蛋白的慢病毒,并感染至野生型NPTr细胞中,利用有限稀释法纯化细胞系,之后将已知具有敲除活性的靶向内源性基因ANPEP的sgRNA通过慢病毒感染的方式整合至候选细胞系中,根据T7E1酶切检测和测序结果选择Cas9敲除活性最高的细胞系确定为用于构建全基因组敲除文库的NPTr-Cas9-Blast。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
病毒基因组复制论文参考文献
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