导读:本文包含了纤维素酶基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:内切纤维素酶,异源表达,结合区,酶学性质
纤维素酶基因论文文献综述
还萍,李锐,李华南,江正兵,马向东[1]（2019）在《结合区部分缺失的纤维素酶基因的克隆与表达及酶学性质初步测定》一文中研究指出从梧桐腐枝上分离到一株可降解纤维素的细菌菌株,发现克隆于该菌株的内切纤维素酶基因(egt)结合区部分缺失(8 bp),导致移码并提前终止,全长1 146 bp,编码381个氨基酸,分子量为40. 06 k D.克隆含有完整结合区的基因(eg),通过酶学性质研究,表明两者均仅具有羧甲基纤维素钠活性,纤维素酶EGT和EG的最适反应温度分别为45℃和55℃,EGT更加耐高温.最适pH均为7. 0,都具有较好的pH稳定性.Mn~(2+)、Fe~(2+)对两者具有激活作用,Zn~(2+)、Ca~(2+)、K~+、NH_4~(2+)和Mn~(2+)对其都具有抑制作用.EGT的K_m=3. 09 mg/mL,比酶活为98. 4 U/mg; EG的K_m=8. 654 mg/mL,比酶活为53. 53 U/mg. EGT结合区的部分缺失导致酶与底物的亲和能力更好,同时比酶活提高183%,水解能力更强.(本文来源于《湖北大学学报(自然科学版)》期刊2019年05期）
温学鹏[2]（2019）在《枯草芽孢杆菌降解纤维素的作用及纤维素酶基因过表达载体的构建》一文中研究指出纤维素是一种天然高聚体多糖物质,天然环境中的含纤维素的物质仅有很少一部分得到分解利用。微生物所产的纤维素酶在通常条件下便可以降解纤维素,因而微生物处理是纤维素利用研究的一大热点。但是,不同种类微生物特点各异,综合降解能力往往偏低,且降解机制与过程的研究尚有很多不清楚的地方,因而目前尚难以提升微生物在降解纤维素中的利用价值。蛋氨酸、赖氨酸和亮氨酸这叁种氨基酸在动植物蛋白中普遍含量不高,却在畜牧业中具有重要的作用。在畜牧饲料应用中,这叁种氨基酸的需求量很大,但工业合成这叁种氨基酸不仅成本高,而且还有产物分子结构手性的问题,不适合将其直接添加使用。益生菌是一类可以有效改善动物机体内微生物菌群组成,在互利共生的代谢过程中可以产生有利于寄主的物质或作用的一大类微生物。枯草芽孢杆菌是益生菌的一种,其益生作用在国内外相关的文献报道很多,不仅被我国农业部列入安全饲料微生物添加剂名单之中,也被美国FDA认定为可安全用于食品与医药的微生物之一。在畜牧饲料中添加枯草芽孢杆菌,能够显着提升饲养畜禽的免疫力,改善菌群平衡与机体消化能力,提高饲料的吸收率,进而提升畜禽品质。而且枯草芽孢杆菌也是一种优秀的产酶微生物,能够分泌包括纤维素酶在内的各类降解酶。本研究首先从益生菌制品中分离纯化得到了一株枯草芽孢杆菌,并使用PCR法进行了鉴定。研究分析了分离出的枯草芽孢杆菌对含纤维素类物质的降解作用,包括其降解纤维素、半纤维素和木质素能力的检测,相应的酶活力的检测,总蛋白的变化及Met、Lys和Leu的含量变化检测。然后利用基因工程方法,获取了枯草芽孢杆菌内切-β-1,4-葡聚糖苷酶基因(endo-beta-1,4-glucanase,CE)。将此基因与表达载体pHT43酶切重组,构建了pHT43-CE内源过表达载体。之后,使用自然感受态法制作载体菌感受态,成功构建过表达载体后设计了试验验证了目的基因在目的菌中的表达。最后检测了枯草芽孢杆菌重组菌降解纤维素能力的提升情况以及纤维素酶活力的提升情况。试验结果表明,枯草芽孢杆菌在试验中表现出较明显的降解纤维素的效果,不具有降解半纤维素和木质素的效果;发酵产物的总蛋白质含量相对于未添加富含纤维素试验样品底物的对照组相比提升了9.4%;发酵产物中的Met、Lys和Leu含量分别提升了31.4%、42.2%和4.9%。分析表明,枯草芽孢杆菌利用纤维素底物合成更多的蛋白质和限制性必需氨基酸。对转入pHT43-CE的枯草芽胞杆菌进行了验证,试验结果表明成功将pHT43-CE转入枯草芽孢杆菌中,成功构建了转纤维素酶基因枯草芽孢杆菌工程菌。重组菌经IPTG诱导后,与未转化枯草芽孢杆菌及未经IPTG诱导的转化菌相比,目的基因的mRNA和蛋白表达水平有显着提升。对转入pHT43-CE的重组菌降解纤维素能力进行了检测,与未转化枯草芽孢杆菌及未经IPTG诱导的转化菌相比,经IPTG诱导的重组菌的降解能力有显着提升。本研究结果为该重组菌作为饲料添加剂的进一步应用提供了理论和技术基础。(本文来源于《东北农业大学》期刊2019-06-01）
杜娇[3]（2019）在《白蚁和共生细菌由来木质纤维素降解酶基因的异源表达》一文中研究指出木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质。天然的木质纤维素材料含有纤维素、半纤维素和木质素等,纤维素在木质纤维素中为最简单的成分,半纤维素和木质素包裹在纤维素的外面,形成了一种天然屏障,这层天然屏障在保护植物的同时,使得人工进行生物降解转化的效率很低,无法适应大规模工业化的要求。自然界中存在一些降解木质纤维素材料的生物系统,白蚁也为一种,白蚁和共生细菌由来木质纤维素酶具有较高的酶活和良好的耐碱性。本文以白蚁和共生细菌为对象,探究了几种木质纤维素酶的协同作用,同时对实验室前期分离得到的厌氧菌Dysgonomonas macrotermitis开展了相关研究,该属为黄翅大白蚁(Macrotermes barneyi)肠道第二优势菌群,具有纤维素活性,为了得到酶学性质较好的木质纤维素酶,进而加快其在工业领域的应用,我们进行了如下研究:M barneyi后肠D.macrotermiD.木聚糖酶的异源表达。通过基因组测序、blast比对分析和分子生物学方法,找到5个木聚糖酶基因,并在E.coli JM109中克隆表达,发现只有DysxynB(orf-00078)和DysxynE(orf-03642)具有木聚糖酶活,蛋白分子量为40kDa和33kDa,分别属于GH10、GH11家族。通过酶学活性分析,酶比活分别为:259.5 U/mg和151.2 U/mg,最适温度和pH均为45℃和7.0,有较强的耐碱性,在pH5.0-9.0环境下处理仍能保持50%以上的酶活。通过TLC分析,发现DysxynB和DysxynE均不具有β-木糖苷酶的活性。M barneyi后肠D.macrotermitis β-1,4-内切葡聚糖酶的异源表达。通过基因组测序、blast 比对分析和分子生物学方法,找到6个β-1,4-内切葡聚糖酶。并在E.coll JM109中克隆表达,只有DysengE(orf-01678)具有EG酶活,其分子量为20 kDa,属于GH5家族。通过酶学活性分析,该EG酶的酶比活为0.58 U/mg,最适温度和pH分别为40℃和8.0,耐碱性强,在pH4.5-9.0之间仍能保持90%以上的活力。对其进行生物信息学分析,发现是目前为数不多的白蚁肠道共生菌来源的GH5家族EG酶。同时,本文采用多质粒(pETDuet-1和pRSFDuet-1)策略,在大肠杆菌中共表达白蚁及其肠道微生物来源的β-葡萄糖苷酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、漆酶和木聚糖酶共4种木质纤维素酶,经过SDS-PAGE分析得到与理论值一致的蛋白条带,且均具有酶活性。以磷酸处理的微晶纤维素(PASC)为底物,测定了共表达酶粗酶液与单独表达酶混合液的协同作用因子,从还原糖的产量上经计算共表达的粗酶液比单独表达酶的混合液对PASC的降解协同作用提高44%;以滤纸和磷酸处理的玉米芯为底物,测定降解协同作用,分别提高34%和20%。结果表明,共表达酶的降解效率要高于混合的单组分酶液降解效率的总和。M Barneyi后肠类芽孢杆菌来源的木聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达。木聚糖酶有较广的工业应用范围,酵母细胞有较强的分泌能力和后加工能力,分泌表达能够降低生产成本。本文使用pPICZα-A质粒对木聚糖酶Xy1Mb1,进行了分泌表达。在GS115中表达的XylMb1,其蛋白分子量的大小比理论值(20kDa)偏大,为35kDa。总之,本文克隆表达了D.macrotermitis来源的木聚糖酶和EG酶,对其酶学性质分析研究;同时对白蚁和共生菌来源的木质纤维素酶进行了共表达,并测定了其对一些天然底物的降解协同作用。同时为了加快木质纤维素酶在工业领域的应用,在毕赤酵母系统中实现了木聚糖酶Xy1Mb1的分泌表达。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-30）
王磊[4]（2019）在《Cyc8-Tup1转录调控复合物在里氏木霉纤维素酶基因表达过程中的作用机制研究》一文中研究指出木质纤维素类生物质资源是地球上最为丰富的可再生资源,在大宗生物基产品的生产中有广阔的应用前景。有效利用生物质资源不仅可以解决人类社会面临的日益严重的能源危机,还可以变废为宝解决由于焚烧秸秆带来的环境污染问题。我国作为农业大国,提高生物质能源在新能源领域的占有率,既符合可持续发展的战略要求,也是生态文明建设的迫切需求。里氏木霉是降解生物质的模式真菌,也是纤维素酶的主要工业生产菌株。近几十年来,人们通过对纤维素酶理化性质的研究,初步解析了里氏木霉纤维素酶系在降解纤维素过程中的协同作用机制,并通过合理优化里氏木霉酶系组成大幅提升了纤维素的水解效率。进一步提高里氏木霉纤维素酶的生产能力,从而降低纤维素酶使用成本是推动生物燃料乙醇及其他大宗生物基化学品工业化生产的前提。近些年的研究表明,里氏木霉纤维素酶基因的表达受到光信号和胞外营养信号的调控,深入解析这些信号通路机制并对其加以有效整合是提高其纤维素酶生产能力的关键。虽然人们已经鉴定到多种参与里氏木霉纤维素酶基因表达的转录调控因子,但这些因子调控纤维素酶基因表达的精确机制目前还不是十分清楚。因此,系统阐述里氏木霉纤维素酶表达调控的分子网络机制,并在此基础上提出有效的菌株遗传改造策略可为实现上述目标提供新的思路。本论文中我们在里氏木霉基因组中鉴定了转录调控复合物Cyc8-Tup1(又名Ssn6-Tup1),并围绕该复合物在里氏木霉纤维素酶基因表达调控过程中的功能展开研究。主要研究成果如下:1建立了响应外源铜离子的RNAi系统,并利用该系统对里氏木霉多个基因的生理功能进行了表征。通过同源重组介导的基因敲除对靶基因功能进行表征是里氏木霉中通用的遗传操作手段,但实际操作过程中,某些对菌体基本生长或者生孢过程极为重要的基因敲除效率低下甚至不能被敲除。因此,我们实验室开发了一套依赖于可控启动子tcu1的遗传操作系统:响应铜离子的启动子替换系统(copper-responsive promoter replacement system)。在启动子替换系统中,添加铜离子可以抑制靶基因的表达实现基因敲低。在不添加铜离子的情况下可以过表达靶基因。为避免靶基因过表达对菌体遗传操作可能带来的不利影响,我们进一步构建了响应铜离子的RNA干扰(RNA interference,RNAi)系统(copper-controlled RNA interference system)。该体系在不添加外源铜离子时,可以借助内源性的RNAi机制降低靶基因的表达,而在添加铜离子的情况下可以关闭RNAi过程,从而模拟基因回补。这两套系统均依赖于铜离子对tcu1启动子表达能力的严谨控制。为了验证响应铜离子的RNAi系统的有效性,我们对里氏木霉组成型表达的基因pyr4,诱导型表达的基因cel7a和xyr1,以及利用同源重组难以敲除的基因fab1均进行了基因敲低,更重要的是整合该体系的菌株在添加铜离子后相关表型得到显着恢复,进而也可排除因发卡RNA(hairpin RNA,hpRNA)表达盒随机整合进入基因组而带来的负面影响。这充分说明响应铜离子的RNAi系统在表征里氏木霉靶基因功能时的实用性和可行性。2 Cyc8-Tup1复合物与转录激活因子Xyr1以互相依赖的方式介导里氏木霉纤维素酶基因的诱导表达。蛋白免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CoIP)实验表明,里氏木霉Cyc8和Tup1在体内可以形成稳定存在的复合物。我们采用响应铜离子的启动子替换系统和RNAi系统分别对里氏木霉tup1和cyc8基因进行基因敲低。结果发现,Cyc8或Tup1的表达下调严重影响了里氏木霉纤维素酶基因的诱导表达,这与Cyc8-Tup1复合物大多参与基因转录抑制截然相反,从而暗示里氏木霉Cyc8-Tup1复合物可能在纤维素酶基因表达过程中发挥重要的激活功能。另外该复合物在里氏木霉分生孢子形成过程中也发挥了至关重要的作用。染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验表明,Cyc8-Tup1 可以被募集到纤维素酶基因启动子上,从而直接调控纤维素酶基因的转录,并且该复合物在启动子上的募集依赖于转录激活因子Xyr1(xylanase regulator 1)。此外,cyc8和tup1基因敲低也会导致诱导条件下纤维素酶基因启动子区核小体解聚受阻,从而可能抑制转录起始复合物PIC(Preinitiation complex)的组装形成。过表达Xyr1并不能恢复cyc8或者tup1敲低菌株纤维素酶表达能力低下的表型,且Xyr1在纤维素酶基因启动上的结合也依赖于Cyc8-Tup1的存在。而同时过表达Xyr1和Tup1后可以大幅度提高纤维素酶的产量,进一步说明了 Xyr1和Tup1之间存在协同调控机制。综上可以说明,Cyc8-Tup1复合物与转录因子Xyr1以互相依赖的方式介导里氏木霉纤维素酶基因的表达。3 Tup1是一个全局性的调控因子,在里氏木霉中敲低tup1不能解除碳代谢阻遏。我们采用RNA-Seq方法对里氏木霉基因组(10239个基因)中Tup1的调控靶点进行了全面的分析。总体来看,在葡萄糖条件下Tup1抑制里氏木霉基因组中2207(占整个基因组基因的21.6%)个基因,激活1641(16%)个基因。在纤维素诱导条件下,Tup1抑制里氏木霉基因组中1988(19.4%)个基因,激活1961(19.2%)个基因,这说明Tup1是一个全局性的调控因子。但与酿酒酵母中Tup1介导特定诱导型基因(如蔗糖酶)的碳代谢阻遏(carbon catabolite repression,CCR)过程不一样,里氏木霉中tup1的敲低并没有导致葡萄糖条件下大多(半)纤维素酶基因的大幅上调。这表明里氏木霉中Tup1与碳代谢阻遏无关或者除Tup1外仍有其他调控机制参与了里氏木霉的CCR。与葡萄糖条件下相比,在纤维素诱导条件下里氏木霉基因组中分别有1017个基因上调(Induction-up)和1993个基因下调(Induction-down),而tup1的敲低会导致诱导上调基因集中的408个基因下调(占Induction-up基因集的40%)和诱导下调基因集中的461(占Induction-down基因集的23%)的基因上调。这些诱导基因集中(包括Induction-up和Induction-down),约50%受Tup1调控的基因同时也会受到Xyr1的调控,而这其中包含了大部分与生物质降解相关的纤维素酶和半纤维素酶。由此可知在诱导条件下,Tup1与转录激活因子Xyr1的调控模式有一定程度的重迭。4在里氏木霉中鉴定了酿酒酵母Cti6的类似蛋白Clp1,证明了Clp1参与里氏木霉纤维素酶基因的表达调控和分生孢子形成。在酿酒酵母中,Cti6(Cyc8-Tup1 interacting protein 6)是一个包含PHD(plant homeodomain)结构域且能够与Cyc8发生直接相互作用的蛋白。我们通过生物信息学分析可知里氏木霉中有一个类Cti6蛋白Tr 27020,但它们之间的序列一致性较低,因此将其命名为Clp1(Cti6 like protein 1)。Clp1含有两个保守的结构域PHD和UIM(ubiquitin interacting motif),但是酿酒酵母Cti6只包含PHD结构域。敲除clp1后,里氏木霉分生孢子形成和纤维素酶基因的表达均严重受阻。在△clp1菌株中过表达Xyr1后可以在很大程度上拯救纤维素酶的表达,表达水平甚至高于对照菌株,说明Xyr1的过表达可以绕过Clp1而激活纤维素酶基因的表达。细胞定位分析表明,Clp1是一个细胞核蛋白,且其PHD和UIM结构域缺失均不影响Clp1的核定位,但是PHD突变会导致Clp1在细胞核内的定位形态异常。与UIM缺失不同,PHD突变株纤维素酶的表达能力和分生孢子形成能力均显着降低。这说明PHD结构域在Clp1参与纤维素酶基因表达和分生孢子形成过程中起到了至关重要的作用。ChIP实验表明Clp1也可以被募集到纤维素酶基因启动子上调控转录,并且这种募集是依赖于纤维素诱导条件的。5鉴定了调控xyr1表达的转录因子Rxe1,并证明Rxe1参与里氏木霉纤维素酶的表达和分生孢子形成过程。Cyc8-Tup1是真核生物中高度保守的基因转录调控复合物。研究表明该复合物参与多种细胞生理学过程。因此我们推测里氏木霉Cyc8-Tup1复合物除被募集到纤维素酶基因启动子上直接调控纤维素酶基因的转录外,也可能会通过其他途径参与纤维素酶基因的表达。我们通过比较分析野生型和tup1敲低菌株的RNA-Seq数据得知,里氏木霉C2H2类型转录因子Tr_108357在纤维素条件下的表达水平要远高于葡萄糖条件下的表达水平,且tup1敲低导致其在诱导条件下的表达水平显着下调。此外,我们在前期工作中,通过酵母单杂交实验发现该转录因子可以结合xyr1的启动子,遂将其命名为Rxel(Regulator 1 of xyr1 expression)。为了表征rxe1在里氏木霉中的生理功能,我们反复多次敲除rxe1基因却没有成功,因此我们使用响应铜离子的RNAi系统对rxe1基因进行了条件性敲低。结果表明,Rxe1敲低严重降低了xyr 和纤维素酶基因的表达,且基本消除了里氏木霉分生孢子的形成。在rxe1基因敲低菌株中进行Xyr1的组成型表达,纤维素酶基因的诱导表达可得以恢复至甚至超过对照菌株的产酶水平,但是Xyr1组成型表达不能恢复rxe1敲低菌孢子形成缺陷的表型。以上结果说明Rxe1可能通过调控xyr1的表达而进一步控制纤维素酶基因的表达。综上,我们在里氏木霉中鉴定了一个新的调控因子Rxe1,该转录因子不仅可以调控xyr1和纤维素酶基因的表达,而且还可以控制里氏木霉孢子形成过程。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-27）
廖续中,熊亚茹,王九祥,赵帅,冯家勋[5]（2019）在《草酸青霉纤维素酶基因和木聚糖酶基因的调控基因POX05145的鉴定》一文中研究指出草酸青霉能产生完整的纤维素酶和木聚糖酶酶系,其纤维素酶基因的表达主要受转录因子的调控。前期工作中,通过对草酸青霉菌株HP7-1在不同碳源培养基培养条件下转录组的比较分析,获得了调控纤维素酶和木聚糖酶产量的候选调控基因集。本研究以草酸青霉ΔPoxKu70为出发菌株,通过同源重组法,构建并获得了其中一个候选调控基因POX05145的缺失突变株ΔPOX05145。在微结晶纤维素Avicel诱导培养条件下,与出发菌株ΔPoxKu70相比,ΔPOX05145的纤维素酶产量和木聚糖酶产量发生了显着改变。其中,在诱导第2天时,ΔPOX05145对硝基苯-β-D-纤维二糖苷酶产量和木聚糖酶产量分别上升43.4%和164.7%,对硝基苯-β-D-半乳糖吡喃葡萄糖苷酶产量下降92.8%,但是,滤纸酶产量和羧甲基纤维素酶产量没有显着变化。然而,在诱导第4天时,所有纤维素酶产量和木聚糖酶产量上升100.4%～294.0%。实时荧光定量PCR检测表明POX05145在不同的时间不同程度的调控主要的纤维素酶基因和木聚糖酶基因的表达。序列分析表明POX05145含有一个GAL4类锌指结构的DNA结合功能域和一个保守的真菌特有的转录因子结构域(Fungal_TF_MHR)。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2019年05期）
王伟,王永花[6]（2019）在《纤维素酶基因的研究进展》一文中研究指出纤维素酶作为重要的糖苷水解酶,对纤维素有较好的水解作用。目前已知的天然纤维素酶已广泛应用于各方面,但其产量难以达到生产需求,造成了大量资源的浪费。为了充分利用纤维素资源,获得高产的纤维素酶菌株,目前国内外对纤维素酶基因工程的研究已成为热点。本文对纤维素酶基因及其表达系统进行综述,总结近几年来纤维素酶基因工程的研究进展,为后续研究提(本文来源于《山东畜牧兽医》期刊2019年02期）
孟庆山[7]（2019）在《里氏木霉纤维素酶基因转录调控因子鉴定及纤维素酶高产菌株构建》一文中研究指出作为可再生资源,木质纤维素类生物质分布广泛,储量丰富。这类生物质主要组分是纤维素、半纤维素和木质素,其中纤维素的含量最高。利用微生物发酵生产的纤维素酶将纤维素组分降解为葡萄糖作为微生物细胞培养和发酵的基础原料,生产生物燃料和生物基化学品,不仅能减轻对石油等不可再生资源的依赖,而且生物燃料和生物基化学品还具有环境友好的特点,是经济和社会可持续发展的重大需求。然而,纤维素酶生产成本高导致水解糖的成本高,限制了木质纤维素类生物质资源的开发利用。丝状真菌是自然界中降解木质纤维素的主要微生物,其中里氏木霉(Trichodermareesei)最具有代表性,很多纤维素酶高产菌株都来自里氏木霉。目前对里氏木霉产纤维素酶的研究主要集中在两个方面:一方面是从机理上阐明里氏木霉产酶调控机制,为菌株遗传改造育种提供理论支持;另一方面是对里氏木霉酶系组分及性能进行优化,提高酶系各组分水解纤维素的协同效果。T.reesei Rut-C30曾是纤维素酶生产工业菌株,也是研究最广泛的产纤维素酶模式菌株及目前工业菌株选育的出发菌株。本文研究工作从里氏木霉人工锌指蛋白转录因子突变体文库中筛选获得了高产纤维素酶突变株T.reeseiM1和M2;以孢子接种方式进行摇瓶发酵,突变株M1和M2的纤维素酶活较出发菌株分别提高100.8%和53.2%,且M1突变株外泌蛋白量提高69.1%,M2内切纤维素酶活提高64.2%;对突变株中人工锌指蛋白转录因子序列进行分析,发现人工锌指蛋白转录因子基因片段在染色体中整合位点位于Scaffold 1:TrireRUTC30:4597和TrireRUTC30:67627两个基因间隔区,且与上述两基因启动子或终止子距离较远;RT-qPCR分析结果显示,突变株M1和M2中主要纤维素酶基因转录均上调,且纤维素酶主要正调控转录因子基因xyr1在M1突变株中有明显上调,而纤维素酶抑制转录因子基因ace1在两株突变株中都明显下调。上述研究结果表明人工锌指蛋白对T.reesei Rut-C30纤维素酶活性的影响具有多样性。对突变株M2中人工锌指蛋白转录因子预测靶基因的转录分析发现,基因TrireRUTC30:10530(Trctf1)转录水平明显下调,而敲除基因Trctfl导致菌株在纤维素诱导条件下纤维素酶酶活较出发株提高了 43.8%,而使用组成型强启动子pdcl持续高效表达Trctf1后,突变株的纤维素酶生产受到明显抑制,转录组分析进一步发现敲除菌株中纤维素酶转录激活因子Vib1、Xyr1和Ace3的转录均明显上调,而转录抑制因子Rce1转录量则明显下调。推测转录因子Trctf1在T.resei Rut-C30中对纤维素酶合成起负调控作用。这一研究结果表明人工锌指蛋白转录因子技术可用于靶基因功能鉴定。纤维素酶高产菌M2中人工锌指蛋白转录因子由特异DNA结合域和酵母来源的Ga14激活域组成,而T.rresei中纤维素酶合成主要由与酵母Ga14相似的转录激活因子Xyr1调控。基于此,设计了一个新型人工嵌合转录因子AZFP-M2-Xyr1AD并研究其对T.reesei纤维素酶合成的影响。分别将菌株M2中人工锌指蛋白转录因子AZFP-M2-Gal4和嵌合转录因子AZFP-M2-Xyr1 AD定点插入到T.reesei TU-6菌株xyn3基因位点,构建菌株QS1和QS2。摇瓶发酵结果显示:QS1和QS2纤维素酶滤纸酶活分别较出发株提高39.4%和73.7%。转录分析发现QS1和QS2中编码主要纤维素酶和辅助蛋白的基因转录较出发株均明显上调,而编码主要纤维素酶调控因子基因的转录却有显着差异,揭示上述两个人工转录因子参与调控T.reesei纤维素酶合成的分子机制不同。此外,比较出发株TU-6、QS1和QS2菌株发酵获得的粗酶液对碱预处理后玉米秸秆和菊芋秸秆的酶解效果,发现QS2菌株粗酶液水解后葡萄糖释放量比TU-6粗酶液水解分别提高了97.9%和14.0%,比QS1粗酶液处理分别提高90.2%和8.2%。上述实验结果表明,利用T.reesei内源转录因子Xyr1的激活域所构建的人工转录因子AZFP-M2-Xyr1 AD比酵母来源Gal4激活域构建的人工锌指蛋白转录因子AZFP-M2-Gal4更能有效调控T.reesei纤维素酶生产。里氏木霉中纤维素酶系不全导致各酶比例不均衡,严重影响纤维素组分水解过程协同作用效果。之前更多研究偏向于对酶系进行体外复配,但这无疑造成了成本增加。通过基因工程手段对T.reesei纤维素酶系合成进行改造和优化,不仅可以降低产酶成本也可以减少纤维素降解所需酶量。因此,研究工作将主要内切酶基因egl1定点插入到纤维素酶转录抑制因子ace1基因位点,通过基因工程手段对T.reesei酶系进行优化,构建菌株QS305。实验结果表明:QS305在摇瓶发酵中总纤维素酶和内切酶酶活分别较出发株Rut-C30提高90.0%和132.7%;在5-L发酵罐中发酵108 h,QS305菌株纤维素酶产量可达10.7 FPU/mL,较出发株提高75.4%。此外,QS305所产粗酶液较出发株能有效对碱预处理后玉米秸秆和菊芋秸秆进行降解。本研究工作利用人工锌指蛋白技术对.T reesei Rut-C30中未知的纤维素酶调控因子进行挖掘,为深入理解T.reesei菌株纤维素酶调控机制提供了参考,并通过基因工程手段对酶系合成进行了调控,为进一步优化纤维素组分酶解性能奠定了基础。(本文来源于《大连理工大学》期刊2019-01-05）
贾定洪,李小林,周洁,彭卫红,谭伟[8]（2018）在《基于无缝克隆方法构建毛木耳多功能纤维素酶基因农杆菌转化载体》一文中研究指出【目的】构建毛木耳农杆菌介导转化双元表达载体,为毛木耳后续多功能纤维素酶基因Mfc转化研究奠定基础。【方法】通过EcoR I酶切p PK2质粒并回收大片段,应用实验设计引物分别对扩增毛木耳Gpd启动子、Mfcsg基因、intron、Hpt基因,通过无缝克隆方法,将p PK2质粒大片段与表达序列同源组装,分别构建农杆菌转化载体pAKMFC、pAKIMFC。【结果】测序验证发现各个元件都已在改造后的载体中进行了正确组装,符合实验预期。【结论】本实验通过毛木耳Gpd启动子、Mfcsg、Hpt潮霉素B抗性基因和终止子组装,构建形成了能够应用于毛木耳农杆菌介导转化的多功能纤维素酶基因双元表达质粒p AKMFC和p AKIMFC,为多功能纤维素酶Mfcsg基因转化增强毛木耳纤维素降解能力奠定了基础。(本文来源于《西南农业学报》期刊2018年11期）
王智伟,周小敏,杨雨鑫,陈玉林[9]（2018）在《黑胸散白蚁体内产纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶基因的鉴定与原核表达》一文中研究指出白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食,体内存在纤维素酶产生菌。从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株,采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化,并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究;同时,依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因Ba G,之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验。结果表明:从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高,该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42℃、6.5,酶促反应的最适温度和pH分别是70℃、4.5,在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL。该菌株所产的纤维素酶在50℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳,使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料,结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21%、1.3%、3.24%和17.42%。基因克隆结果表明该菌株具有Ba G、Cbs 2个纤维素酶基因,且大肠杆菌表达结果显示Ba G基因的粗酶液pro Ba G无纤维素酶活性,而Cbs基因的粗酶液pro Cbs在60℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL,将Ba G和Cbs基因进行原核融合表达,产生的蛋白约35 k D,其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL,说明无纤维素酶活性的Ba G基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2018年08期）
林玲,梁雪莲,刘晓,姜伯乐[10]（2018）在《十字花科黑腐病菌中9个纤维素酶基因的研究》一文中研究指出十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)能够侵染几乎所有的十字花科植物引起黑腐病,而纤维素酶作为重要致病因子之一,在病原菌早期侵染中发挥重要作用。通过全基因组检索发现,已测序菌株Xcc 8004中有9个基因(XC_0026,XC_0027,XC_0028,XC_0625,XC_0639,XC_0783,XC_0784,XC_1727和XC_2483)注释为纤维素酶基因。本研究构建了9个纤维素酶基因的单基因缺失突变体和多基因缺失突变体。定性检测突变体纤维素酶活,发现D0639的CMC纤维素酶活力显着降低,其他8个单缺失突变体的CMC纤维素酶活力变化不明显,当9个基因同时缺失即D9,CMC纤维素酶活性完全丧失。在D9的背景进行单基因反式互补,通过定量和定性检测纤维素酶活力,XC_0639能基本上恢复野生型水平,XC_0026、XC_0783和XC_1727只能补回10%的酶活力,而其余几个基因完全不能补回酶活力。本研究首次发现了XC_0639是十字花科黑腐病菌的纤维素酶的主效基因。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2018年08期）
纤维素酶基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
纤维素是一种天然高聚体多糖物质,天然环境中的含纤维素的物质仅有很少一部分得到分解利用。微生物所产的纤维素酶在通常条件下便可以降解纤维素,因而微生物处理是纤维素利用研究的一大热点。但是,不同种类微生物特点各异,综合降解能力往往偏低,且降解机制与过程的研究尚有很多不清楚的地方,因而目前尚难以提升微生物在降解纤维素中的利用价值。蛋氨酸、赖氨酸和亮氨酸这叁种氨基酸在动植物蛋白中普遍含量不高,却在畜牧业中具有重要的作用。在畜牧饲料应用中,这叁种氨基酸的需求量很大,但工业合成这叁种氨基酸不仅成本高,而且还有产物分子结构手性的问题,不适合将其直接添加使用。益生菌是一类可以有效改善动物机体内微生物菌群组成,在互利共生的代谢过程中可以产生有利于寄主的物质或作用的一大类微生物。枯草芽孢杆菌是益生菌的一种,其益生作用在国内外相关的文献报道很多,不仅被我国农业部列入安全饲料微生物添加剂名单之中,也被美国FDA认定为可安全用于食品与医药的微生物之一。在畜牧饲料中添加枯草芽孢杆菌,能够显着提升饲养畜禽的免疫力,改善菌群平衡与机体消化能力,提高饲料的吸收率,进而提升畜禽品质。而且枯草芽孢杆菌也是一种优秀的产酶微生物,能够分泌包括纤维素酶在内的各类降解酶。本研究首先从益生菌制品中分离纯化得到了一株枯草芽孢杆菌,并使用PCR法进行了鉴定。研究分析了分离出的枯草芽孢杆菌对含纤维素类物质的降解作用,包括其降解纤维素、半纤维素和木质素能力的检测,相应的酶活力的检测,总蛋白的变化及Met、Lys和Leu的含量变化检测。然后利用基因工程方法,获取了枯草芽孢杆菌内切-β-1,4-葡聚糖苷酶基因(endo-beta-1,4-glucanase,CE)。将此基因与表达载体pHT43酶切重组,构建了pHT43-CE内源过表达载体。之后,使用自然感受态法制作载体菌感受态,成功构建过表达载体后设计了试验验证了目的基因在目的菌中的表达。最后检测了枯草芽孢杆菌重组菌降解纤维素能力的提升情况以及纤维素酶活力的提升情况。试验结果表明,枯草芽孢杆菌在试验中表现出较明显的降解纤维素的效果,不具有降解半纤维素和木质素的效果;发酵产物的总蛋白质含量相对于未添加富含纤维素试验样品底物的对照组相比提升了9.4%;发酵产物中的Met、Lys和Leu含量分别提升了31.4%、42.2%和4.9%。分析表明,枯草芽孢杆菌利用纤维素底物合成更多的蛋白质和限制性必需氨基酸。对转入pHT43-CE的枯草芽胞杆菌进行了验证,试验结果表明成功将pHT43-CE转入枯草芽孢杆菌中,成功构建了转纤维素酶基因枯草芽孢杆菌工程菌。重组菌经IPTG诱导后,与未转化枯草芽孢杆菌及未经IPTG诱导的转化菌相比,目的基因的mRNA和蛋白表达水平有显着提升。对转入pHT43-CE的重组菌降解纤维素能力进行了检测,与未转化枯草芽孢杆菌及未经IPTG诱导的转化菌相比,经IPTG诱导的重组菌的降解能力有显着提升。本研究结果为该重组菌作为饲料添加剂的进一步应用提供了理论和技术基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
纤维素酶基因论文参考文献
[1].还萍,李锐,李华南,江正兵,马向东.结合区部分缺失的纤维素酶基因的克隆与表达及酶学性质初步测定[J].湖北大学学报(自然科学版).2019
[2].温学鹏.枯草芽孢杆菌降解纤维素的作用及纤维素酶基因过表达载体的构建[D].东北农业大学.2019
[3].杜娇.白蚁和共生细菌由来木质纤维素降解酶基因的异源表达[D].山东大学.2019
[4].王磊.Cyc8-Tup1转录调控复合物在里氏木霉纤维素酶基因表达过程中的作用机制研究[D].山东大学.2019
[5].廖续中,熊亚茹,王九祥,赵帅,冯家勋.草酸青霉纤维素酶基因和木聚糖酶基因的调控基因POX05145的鉴定[J].基因组学与应用生物学.2019
[6].王伟,王永花.纤维素酶基因的研究进展[J].山东畜牧兽医.2019
[7].孟庆山.里氏木霉纤维素酶基因转录调控因子鉴定及纤维素酶高产菌株构建[D].大连理工大学.2019
[8].贾定洪,李小林,周洁,彭卫红,谭伟.基于无缝克隆方法构建毛木耳多功能纤维素酶基因农杆菌转化载体[J].西南农业学报.2018
[9].王智伟,周小敏,杨雨鑫,陈玉林.黑胸散白蚁体内产纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶基因的鉴定与原核表达[J].农业生物技术学报.2018
[10].林玲,梁雪莲,刘晓,姜伯乐.十字花科黑腐病菌中9个纤维素酶基因的研究[J].基因组学与应用生物学.2018