导读:本文包含了独特区论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:VPlu基因,稳定转染,细胞凋亡,Caspase3
独特区论文文献综述
迟明,迟海峰,许波,晁玉瑾,郑楠[1]（2014）在《B19病毒XA株VP1独特区蛋白对Hela细胞凋亡的影响》一文中研究指出目的:构建B19病毒XA株VPlu基因的真核表达载体和稳定转染细胞系,探讨B19病毒XA株VPl独特区蛋白对Hela细胞凋亡的影响。方法:采用本课题组前期构建的真核表达载体plRES2-EGFP-Vplu及plRES2-EGFP对照质粒,将其稳定转染至Hela细胞,通过流式细胞术检测EGFP阳性细胞的比例以确定稳定转染的细胞系是否成功构建;提取稳定转染的Hela细胞的总蛋白,通过Western blot检测细胞内凋亡相关基因Caspase3的表达;转染plRES2-EGFP-Vplu及plRES2-EGFP的Hela细胞经过Annexin V和PI的染色后,通过流式细胞术检测其凋亡率。结果:本实验成功构建了plRES2-EGFP-VPlu稳定转染的Hela细胞系,plRES2-EGFP-Vplu稳定转染的Hela细胞中Caspase3的表达较转染对照质粒的Hela细胞明显增加,细胞凋亡率亦显着升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:B19病毒XA株VP1独特区蛋白能够显着促进Hela细胞的凋亡。(本文来源于《现代生物医学进展》期刊2014年33期）
聂晓晶[2]（2012）在《人细小病毒B19 VP1独特区蛋白对心肌细胞的影响及机制》一文中研究指出【背景】人细小病毒B19(Human parvovirus B19，简称B19病毒)是一种单链线状小DNA病毒，能导致多系统疾病，如自然流产、胎儿畸形、再生障碍性贫血危象、肾小球肾炎、关节炎等，严重者可致死。本实验室首次报道心脏发育畸形的胎儿心脏尸检标本及先天性心脏病(CHD)心肌组织标本中有较高的B19病毒DNA检测阳性率，提示B19病毒感染可能与部分CHD发病相关，接着国外研究还提示B19病毒感染可引起心肌炎、川崎病、冠状动脉病变等心血管疾病。值得重视的是，由于B19病毒不能常规培养分离和不能感染实验动物如鼠、狗和猪等，因此其感染导致上述疾病的机理尚未阐明。B19病毒基因编码的结构蛋白VP2蛋白包含在VP1蛋白中，VP1蛋白N末端的227个氨基酸叫做VP1独特区蛋白(VP1u蛋白)。既往研究将VP1u蛋白作为亚单位疫苗研究的候选分子，本实验室发现VP1u蛋白可导致BALB/c小鼠心脏病变，包括心肌纤维间隙增宽、肌丝崩解、线粒体空泡化等。这一结果提示须重新审视B19病毒VP1u蛋白的功能，并回答下列相关问题：B19病毒VP1u蛋白引起心脏病变的机制是什么？是病毒蛋白直接毒性作用造成组织损伤，还是其刺激机体产生的抗体导致心脏损害？其通过什么信号通路导致心肌损伤？其引起心肌病变与B19病毒致胎儿心脏水肿、流产、心脏畸形有无相关性？它是否强烈地告知B19病毒VP1u蛋白用于疫苗研究的不可能性？为此，本项目将用纯化的B19病毒VP1u蛋白和单克隆抗体(mAb)作用离体心肌细胞和鼠(包括孕鼠)，用光镜、电镜、免疫组织化学、流式细胞仪和信号通路分析等方法，研究心肌细胞结构、凋亡、细胞表面标志物、细胞因子、细胞粘附分子和信号通路变化。这将有助于揭示B19病毒感染的发病机制，也有助于对病毒蛋白毒性和免疫损伤机制的认识或致病相关通路的新发现，并进一步促进B19病毒致病机理及预防疫苗的研究。【目的】1.获得B19病毒VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb，为后续研究奠定基础。2.研究B19病毒VP1u蛋白对离体和整体动物心肌细胞结构、凋亡、相关细胞因子、细胞表面标志物和信号通路的影响，从病毒蛋白毒性、免疫损伤、信号通路改变方面探讨B19病毒VP1u蛋白致心肌病变的机制。3.研究B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏重量、结构、凋亡、细胞表面标志物、信号通路及胎鼠流产的影响，探讨B19病毒VP1u蛋白与心脏发育和胎鼠流产的关系。【方法】1. B19病毒VP1u蛋白纯化及mAb制备⑴根据已经构建的VP1u蛋白表达纯化体系获得B19病毒VP1u蛋白。⑵用B19病毒VP1u蛋白免疫小鼠，免疫后脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得鼠源性mAb。2. B19病毒VP1u蛋白对离体培养心肌细胞作用的研究⑴采用酶消化、差速贴壁和5-溴脱氧尿苷(5-Brdu)抑制法获得高纯度离体培养心肌细胞。⑵给予B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预离体心肌细胞，首先计算VP1u蛋白入心肌细胞率，然后，通过光镜和电镜观察心肌细胞结构，干化学分析法检测心肌酶谱和ELISA法定量检测细胞因子变化。⑶TUNEL免疫荧光法、流式细胞仪检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预离体心肌细胞导致心肌细胞凋亡情况。⑷免疫细胞化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预心肌细胞后细胞粘附分子ICAM-1(CD54)、VCAM-1(CD106)和E-selectin(CD62E)变化。⑸Western blot检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后离体心肌细胞NF-κB信号通路和p38MAPK信号通路变化。3. B19病毒VP1u蛋白致正常鼠心脏病变的研究⑴用B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射BALB/c小鼠，光镜和电镜观察心脏组织结构变化，干化学分析法检测心肌酶谱变化，ELISA法定量检测细胞因子变化。⑵TUNEL免疫荧光法、免疫组织化学法和流式细胞仪检测VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预鼠心脏中心肌细胞凋亡情况。⑶免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预鼠心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin变化。⑷原位分子杂交技术检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预鼠心肌细胞中NF-κB、PKC-α及PDGF-β变化。⑸根据实验结果提出B19病毒VP1u蛋白引起心肌病变的信号通路。4. B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏的影响⑴用B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射BALB/c孕鼠，观察流产情况，采集胎鼠心脏组织，称重，光镜和电镜观察心脏组织结构。⑵TUNEL免疫荧光法和免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心脏中心肌细胞凋亡情况。⑶免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin变化。⑷原位分子杂交技术检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心肌细胞中NF-κB、PKC-α及PDGF-β变化。【结果】1. B19病毒VP1u蛋白纯化及mAb制备⑴获得分子量22kDa、浓度1.2mg/mL、纯度96.7%的B19病毒VP1u蛋白，并获得两株分泌抗B19病毒VP1u蛋白mAb的细胞株，分别命名4-H-5和5-B-9，两株mAb细胞株分泌抗体均为IgG2a，抗体稀释倍数为1:16000时检测结果仍为阳性，4-H-5抗体的效价高于5-B-9，纯化后抗VP1u蛋白mAb浓度分别是900μg/mL(4-H-5)和1110μg/mL(5-B-9)。2. B19病毒VP1u蛋白对离体培养心肌细胞作用的研究⑴通过酶消化法、差速贴壁法和5-Brdu抑制法得到离体培养心肌细胞，6~8h心肌细胞贴壁，12~16h出现不规律搏动，自发搏动频率40~80次/min。贴壁心肌细胞呈梭形，中心可见细胞核，每个细胞向外伸出数个突起，心肌细胞存活率82%。5~6d形成菊花状功能小体，此时搏动较规律，52.6±18.6次/min。⑵离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb共同干预组、抗VP1u蛋白mAb干预组电镜下发现细胞自噬。⑶离体心肌细胞实验中，BCA法检测细胞培养液中VP1u蛋白量，进入心肌细胞的VP1u蛋白量是0.036~0.468μg，统计学处理，P>0.05，各剂量组在不同时间点差别无统计学意义；P>0.05，各剂量组组间差别无统计学意义。ELISA法直接检测心肌细胞匀浆中VP1u蛋白量，进入心肌细胞VP1u蛋白量0.012~0.076μg，统计学处理，P>0.05，各剂量组在不同时间点差别无统计学意义；P>0.05，各剂量组组间差别无统计学意义。⑷离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞培养液中心肌酶谱与对照组比较，P>0.05，差别无统计学意义。⑸离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞培养液中IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β1与对照组比较，P>0.05，差别无统计学意义。⑹离体心肌细胞实验中，通过TUNEL免疫荧光和流式细胞分析技术，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞发生细胞凋亡。B19病毒VP1u蛋白干预组细胞凋亡率5.4%，B19病毒VP1u蛋白和抗B19病毒VP1u蛋白mAb共同干预组细胞凋亡率7.7%，抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞凋亡率15.5%。⑺离体心肌细胞实验中，免疫组织化学提示B19病毒VP1u蛋白刺激心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达增强。⑻离体心肌细胞实验中，PKC/p38MAPK信号通路和NF-κB信号通路参与B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞凋亡。3. B19病毒VP1u蛋白致正常鼠心脏病变的研究⑴整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组光镜下均发现心肌细胞间隙增宽，细胞核肿胀，核浆比例增高；电镜下均可见心肌细胞中线粒体聚集，细胞核稍缩小，核染色质致密并边集于核膜处。⑵整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组AST、CK、CK-MB、LDH和α-HBDB值行LSD-t检验，组间两两比较，P<0.05，干预组与对照组间差别有统计学意义。⑶整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β1值行LSD-t检验，组间两两比较，P<0.05，干预组与对照组间差别有统计学意义。⑷整体动物实验中，通过TUNEL免疫荧光、免疫组织化学和流式细胞分析技术，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞发生细胞凋亡。抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射组，细胞凋亡率最高(15.9%)。该凋亡过程中伴有抑制凋亡分子Bcl-2出现。⑸整体动物实验中，免疫组织化学提示B19病毒VP1u蛋白刺激心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达增强。⑹整体动物实验中，通过原位分子杂交技术在B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组检出NF-κB、PKC-α及PDGF-β。4. B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏的影响⑴对胎鼠心脏影响研究中，实验期间有23只小鼠怀孕，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组均未见胎鼠流产。各组产仔数量进行组间方差分析，P>0.05，差别无统计学意义；各组胎鼠心脏重量进行组间方差分析，P>0.05，差别无统计学意义。⑵对胎鼠心脏影响研究中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb注射组光镜下均可见心肌细胞间隙增宽，胞质透明淡染，部分心肌细胞脂肪变性。电镜下VP1u蛋白注射组可见心肌细胞间隙增宽，细胞膜下空泡，可见次级溶酶体；VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb共同注射组、抗VP1u蛋白mAb注射组均可见线粒体聚集在增宽的心肌细胞间隙中，线粒体有空泡化。⑶对胎鼠心脏影响研究中，通过TUNEL免疫荧光和免疫组织化学，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导胎鼠心肌细胞发生细胞凋亡。⑷对胎鼠心脏影响研究中，免疫组织化学法在VP1u蛋白注射组和或抗VP1u蛋白mAb注射组心脏组织中检出微弱棕色信号提示有少量ICAM-1、VCAM-1和E-selectin。⑸对胎鼠心脏影响研究中，通过原位分子杂交技术在VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组检出NF-κB、PKC-α及PDGF-β。【结论】⑴获得B19病毒VP1u蛋白和两株分泌抗B19病毒VP1u蛋白mAb的细胞株，为后续B19病毒VP1u蛋白相关研究奠定了基础。⑵通过ELISA法检测心肌细胞匀浆中VP1u蛋白量和BCA法检测细胞培养液中VP1u蛋白量，结果提示VP1u蛋白没有进入心肌细胞内。⑶离体心肌细胞培养时，干预组心肌酶谱没有升高，而整体动物研究时，干预组心肌酶谱升高，提示VP1u蛋白并非直接破坏心肌细胞膜，可能与VP1u蛋白依赖分子拟态刺激机体产生自身抗体引起免疫性心肌损伤有关。⑷首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞凋亡。⑸心肌细胞发生凋亡过程中，伴有ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和Bcl-2等抑制细胞凋亡分子升高，提示抑制凋亡与促进凋亡的对抗随着时间变化而变化，为了阐明两者的相互关系，将进一步研究不同时间点相关分析。⑹首次揭示B19病毒VP1u蛋白致心肌细胞凋亡过程中包含有NF-κB信号通路和p38MAPK信号通路，需要相应信号通路抑制剂来进一步证实上述信号通路是否为主要信号通路。⑺本研究结果揭示B19病毒VP1u蛋白能引起胎鼠心脏水肿，但没有引起胎鼠死亡、流产和心脏发育畸形。(本文来源于《第四军医大学》期刊2012-05-01）
迟明,迟海峰,许东亮,王楠,聂晓晶[3]（2010）在《B19病毒XA株VP1独特区真核表达系统的建立及鉴定》一文中研究指出目的:克隆B19病毒XA株VP1u基因,构建真核重组表达载体。方法:从已构建好的B19病毒XA株原核表达载体中获得VP1u基因,将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,经酶切鉴定并测序验证后,获得真核表达载体pIRES2-EGFP-VP1u。将其转染至HeLa细胞,提取细胞总蛋白,用Western blot技术检测VP1u蛋白的表达。结果:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-VP1u,荧光显微镜下可见pIRES2-EGFP-VP1u转染HeLa细胞后表达EGFP蛋白而发出绿色荧光,Western blot证明VP1u蛋白在HeLa细胞中表达。结论:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-VP1u并在HeLa细胞中正确表达,为今后B19病毒VP1u基因疫苗的研究奠定基础。(本文来源于《现代生物医学进展》期刊2010年23期）
菅新艳[4]（2010）在《人细小病毒B19结构蛋白VP1独特区多克隆抗体的制备及其磷脂酶A2活性的研究》一文中研究指出人类细小病毒B19于1975年由Cossart首次发现于英国献血人员血清中。它是目前仅有的两种可以感染人的细小病毒之一,在全世界广泛分布。B19病毒基因组全长约5.6kb,编码一个非结构蛋白NS1,以及两个组成病毒衣壳的结构蛋白：VP1(84kDa)和VP2 (58kDa),两种结构蛋白基因是典型的重迭基因,VP1的N-末端有一个由227个氨基酸组成的VP1独特区。最近对大约34种不同细小病毒的研究发现,其VP1蛋白的N-末端独特区有一个保守的结构模型(HDXXY及YXGXG),已有研究证明细小病毒的VP1独特区具有磷脂酶A2活性,该活性对于病毒的复制感染是必须的,因此该区域已成为抗体药物设计的一个潜在靶标。目前国内对该方面的研究较少,对细小病毒B19独特区的研究具有重要意义。本实验通过定点突变技术对B19结构蛋白VP1独特区的关键氨基酸进行突变,检测突变后该区域磷脂酶A2活性的变化,从而更加深入的研究该病毒独特区的功能。首先,根据B19病毒VP1独特区序列设计引物,扩增得到该基因连接到表达载体pMAL-c2x中,得到重组质粒pMal-VPlu。测序正确后应用pMALTM原核表达系统,在大肠杆菌中成功诱导表达带有MBP-tag的重组融合蛋白,Amylose亲和层析柱纯化融合蛋白,利用pMal-c2x载体在多克隆位点处含有的Factor Xa酶切位点,将融合蛋白中标签蛋白MBP切除后,免疫新西兰大白兔制备得到VPlu多克隆抗体。其次,以本实验室已构建完成的重组质粒PUC-VP1u作为模板,利用定点突变技术,PCR扩增得到突变体克隆,测序正确后,再将含有突变位点的独特区片段构建到表达载体pMal-c2x中,获得重组克隆pMal-mVP1u。运用此方法,分别得到133,175,195位关键氨基酸突变的pMal-mVP1u。同样的,应用pMALTM原核表达系统纯化得到融合蛋白,测定蛋白浓度后经Factor Xa酶切除标签蛋白,体外测得磷脂酶A2活性。结果显示,同细小病毒科其他病毒一样,B19VPlu具有磷脂酶A2活性,经抗体孵育处理后,该酶活性受到明显抑制。133,175位关键氨基酸突变后VP1u基本失去磷脂酶A2活性,而195位关键氨基酸突变的B19VPlu仍具有磷脂酶A2活性。本实验结果为继续深入研究和阐明磷脂酶A2在病毒复制感染过程中的作用机制及该病毒感染的发病机理奠定了理论基础。(本文来源于《华中师范大学》期刊2010-05-01）
邓雪锋[5]（2009）在《细小病毒B19独特区磷脂酶A2功能初步研究》一文中研究指出人类细小病毒B19于1975年由Cossart首次发现于英国献血员中。它是目前仅有的两种可以感染人的细小病毒,在全世界广泛分布。它可感染各个年龄段的人群,并引起多种不同症状。在世界众多地方,许多育龄妇女都是B19病毒的易感人群。如果怀孕期间感染该病毒,则可能会导致严重的贫血、NIFH、胎儿损伤、胎儿死亡等一系列症状。B19病毒的检测方法有电镜观察,B19抗原酶联免疫,血细胞凝集测定等,目前常用的是直接杂交和PCR法。本文中,我们运用比普通单轮PCR更灵敏的巢式PCR方法检测了共1700个血清样本的DNA,包括从湖北省妇幼保健院采集的900个妇女及孩童血液样本以及从武汉市第六医院采集的800例成年人(男女均有)血液样本。第一组(妇女组)的阳性检测率为8.33%,第二组(普通成人,包括男性和女性)为4.50%。结果显示,育龄妇女的B19感染率远高于普通人群,很有必要对孕妇进行诊断从而预防新生儿感染B19病毒。B19病毒基因组全长约5.6kb,编码一个非结构蛋白NS1,以及两个组成病毒衣壳的结构蛋白:VP1(84kDa)和VP2(58kDa),除了VP1的N-末端多了由227个氨基酸组成的VP1独特区外,其余部分两者完全一致。最近对大约30种不同的细小病毒研究发现,VP1蛋白的N-末端独特区有一个保守的结构模型(HDXXY),并且具有磷脂酶A2活性,同样的现象也在细小病毒B19中发现。磷脂酶A2已经成为抗体药物设计的一个潜在靶标。因此,对细小病毒B19独特区的研究具有重要意义,目前国内该方面的研究很少。本实验中,通过定点突变改变VP1蛋白独特区的关键氨基酸,检测其磷脂酶活性是否改变,从而研究该病毒独特区的功能。本文将独特区序列(VP1u)插入到PUC-18a载体中,重组质粒PUC-uVP1经PCR扩增得到突变体克隆,测序确认后,再将包含有突变位点的独特区构建到表达载体pMal-c2x中,获得重组克隆pMal-uVP1。运用此方法,顺利突变了其中的133,153,174这叁个关键氨基酸。然后在大肠杆菌中表达其蛋白,用WB检测,通过扩大培养诱导表达,并且过柱纯化,收集目的蛋白。下一步实验将进一步纯化、切割蛋白,测其磷脂酶活性。(本文来源于《华中师范大学》期刊2009-05-01）
聂晓晶[6]（2009）在《B19-XA株VP1独特区蛋白结构与免疫的初步研究》一文中研究指出人细小病毒B19(Human parvovirus B19,简称B19病毒)属于细小病毒科细小病毒属,我国人群有较高的感染率和发病率。自我们于1990年首次证实我国存在B19病毒感染以后,国内多个研究机构证明其是我国孕妇非免疫性流产、儿童急性再生障碍性贫血危象、急性血小板减少性紫癜等疾病的重要病因之一。B19病毒由一个二十面体衣壳蛋白包裹一条单链DNA(5596bp)组成,这条单链DNA编码一个非结构蛋白(NS1)、两个结构蛋白(VP1,VP2)和两个衣壳蛋白(7.5kDa和11kDa)。VP2蛋白(58kDa)包含在VP1蛋白(83kDa)中,两者的区别仅是VP1蛋白N末端的227个氨基酸,这227个氨基酸所组成的蛋白叫做VP1独特区蛋白(VP1 unique protein,VP1uprotein)。B19病毒核苷酸序列有着较大的变异,据此可分为叁个基因型:Ⅰ型(标准型)、Ⅱ型(类似A6型和类似LaLi型)、Ⅲ型(类似V9型),不同型别间核苷酸序列变异率为10%。我们在国家自然科学基金课题(39870021)的资助下,对B19病毒中国流行株(B19-XA株)进行基因变异的研究,发现B19-XA株存在较多变异。尤其是VPlu核苷酸存在的变异,将影响B19-XA株独特的免疫学特性,这是因为VPlu蛋白大部分暴露在病毒表面,能刺激机体产生中和性抗体,且近期研究发现VPlu蛋白有磷酸脂酶A_2(phospholipase A_2,PLA_2)活性。PLA_2具有水解脂肪酸和磷脂的能力,在很多疾病的发生和发展中扮演重要角色。鉴于B19病毒有多个基因型,不同的蛋白抗原位点对研制诊断试剂及疫苗有很大影响,以及VPlu蛋白在B19病毒致病过程中起着重要作用,故有必要研究B19-XA株VPlu蛋白的结构对免疫的影响,这将有助于我国人群B19病毒感染的防治,能促进B19病毒致病机理及预防疫苗的研究。研究目的:本实验目的是表达纯化VPlu蛋白,通过软件分析及圆二色谱仪测定VPlu蛋白一、二级结构;同时用VPlu蛋白免疫动物,测定抗VPlu蛋白抗体滴度,并行免疫后小鼠心、肝、肺、肠、关节滑膜组织病理检查;体外观察VPlu蛋白对T淋巴细胞应答功能的影响;以及将VPlu蛋白用于建立酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),判断其检测B19病毒感染的可行性。以初步揭示B19-XA株VPlu蛋白的免疫原性,部分揭示B19病毒感染的致病机理,促进B19病毒感染的防治。实验方法:1.测序证实pQE30-VPlu质粒中含有VPlu片段将我科构建并保存的pQE30-VPlu质粒送生物技术公司测序证实包含VPlu基因片段。2.原核表达并纯化B19-XA株VPlu蛋白将含有pQE30-VPlu质粒的E.coli M15菌发酵,低温条件下IPTG诱导表达VPlu融合蛋白,通过离子交换、分子筛纯化重组蛋白,SDS-PAGE鉴定VPlu蛋白及纯度情况。3.B19-XA株VPlu蛋白结构分析与测定通过AnthePro 5.0软件分析VPlu蛋白一级结构,Hierarchical Neural NetWork method软件分析VPlu蛋白二级结构,圆二色谱仪测定VPlu蛋白二级结构。4.B19-XA株VPlu蛋白免疫学特性研究体外观察VPlu蛋白对BALB/c小鼠淋巴细胞应答功能的影响;体内实验通过VPlu蛋白免疫BALB/c小鼠,然后测定抗VPlu蛋白抗体滴度,判断VPlu蛋白抗原性,并对免疫后小鼠心、肝、肺、肠、关节滑膜行光镜和电镜检查。5.构建ELISA检测B19病毒抗体体系采用B19-XA株VPlu蛋白包被酶标板,优化该检测B19病毒IgG、IgM体系,与聚合酶链反应(PCR)、德国B19病毒抗体检测试剂盒进行比较,评价其一致性。实验结果:1.通过Hierarchical Neural Network method分析和圆二色谱仪测定B19-XA株VPlu蛋白二级结构,无规线团所占比例均较大,分别为60.00%和46.10%。2.用ELISA法检测B19-XA株VPlu蛋白免疫BABL/c小鼠产生的抗B19-XA株VPlu蛋白抗体效价,抗原包被量为20ng～50ng间为最佳包被量,小鼠血清稀释达1∶16000时为阳性(OD值2.04),提示B19-XA株VPlu蛋白免疫原性和反应原性好。3.经B19-XA株VPlu蛋白免疫的BABL/c小鼠的心脏、肝脏、关节滑膜存在明显病理改变。心脏病理改变为:光镜提示心肌肌纤维间隙增宽、血管扩张;电镜提示心肌肌纤维溶解、肌纤维间隙大、炎性细胞浸润、肌丝间隙增宽、线粒体水肿及空泡化。肝脏病理改变为:光镜提示有坏死区、血窦扩张;电镜提示肝细胞有突起,微绒毛肿胀及质地变实、电子密度增高。关节滑膜病理改变为:光镜提示慢性炎症改变;电镜提示滑膜细胞增多、胶原成分增多。4.用B19-XA株VPlu蛋白构建的B19病毒抗体检测ELISA体系与腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒抗体阳性血清无交叉反应。最佳包被量为25ng/孔,标本血清最佳稀释倍数为1∶200。其检测B19IgM敏感性为88.37%,特异性为96.15%,与PCR方法一致性好,kappa值＞0.75;与Parvovirus B19 IgM ELISA Kit符合性好(符合率=96.8%)。与Parvovirus B19 IgG ELISA Kit比较kappa值＞0.75,两种检测方法一致性好。结论:1.本研究首次发现B19-XA株VPlu蛋白二级结构可变区所占比例大。揭示其能因此刺激机体产生多种抗体(包括自身抗体),从而引起机体多系统多器官的病变,可能与B19病毒感染临床表现复杂有关。2.B19-XA株VPlu蛋白免疫BALB/c小鼠后能产生特异性抗体,且经ELISA检测提示血清稀释度达1∶16000时仍为阳性,说明B19-XA株VPlu蛋白抗原性好。3.B19-XA株VPlu蛋白免疫后的BABL/c小鼠的心脏、肝脏、关节滑膜存在明显病理改变,提示VPlu蛋白在B19病毒致病谱广中起重要作用,这可能与VPlu蛋白具有PLA_2活性有关。4.用VPlu蛋白构建的B19病毒抗体检测ELISA体系具有灵敏度高、特异性强、经济、方便等优点。(本文来源于《第四军医大学》期刊2009-04-01）
孙乐栋,曾抗,王茜,周再高,刘凤岩[7]（2007）在《单纯疱疹病毒2型gG-2“独特区”基因的原核表达及其血清学诊断价值》一文中研究指出目的在大肠杆菌中表达HSV-2的gG-2"独特区"基因(gG-2T)并对其免疫学特性进行初步研究。方法克隆HSV-2的gG-2T,并在大肠杆菌中表达gG-2T融合蛋白。通过Western blot和间接ELISA鉴定融合蛋白的活性。结果通过原核系统表达的gG-2T融合蛋白可以与GST多克隆抗体结合并在46 ku附近出现特异性结合条带。并且能够与确诊的HSV-2患者血清反应,而不与HSV-1患者血清和正常人血清反应。结论获得了HSV-2 gG-2T融合蛋白,它可以与GST多克隆抗体特异性结合并且可以同HSV-2型患者血清特异性反应;获得的gG-2T蛋白为研究以gG-2蛋白作为靶区域的诊断试剂盒和疫苗研发打下实验基础。(本文来源于《西安交通大学学报(医学版)》期刊2007年04期）
李志宏,张国成,许东亮,李小青,孙新[8]（2007）在《人微小病毒B19VP1独特区蛋白的表达及纯化》一文中研究指出目的利用原核表达系统表达人微小病毒B19的VP1独特区蛋白,大量发酵培养细菌后纯化蛋白,为制备VP1蛋白的mAb奠定基础。方法构建重组质粒VP1-PQE30,转化大肠杆菌M15,测序正确后发酵培养、IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot分析表达产物,表达蛋白经AKTA explorer 100快速纯化系统纯化。结果成功地构建原核表达系统VP1-PQE30-M15,经IPTG诱导发酵培养细菌可大量表达VP1蛋白,纯化后蛋白纯度达95%以上。结论重组表达质粒可表达VP1独特区蛋白,高纯度蛋白对制备VP1mAb及疫苗具有重要意义。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2007年04期）
孙乐栋,王茜,曾抗,周再高,刘凤岩[9]（2006）在《单纯疱疹病毒2型gG-2“独特区”基因的原核表达及其免疫学特征初步研究》一文中研究指出目的在大肠杆菌中表达HSV-2的gG-2“独特区”基因(HVS2-gG2-T)并对其免疫学特性进行初步研究。方法克隆HSV-2的gG-2“独特区”基因,并在大肠杆菌中表达GST-gG2-T融合蛋白。通过Westem blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定表达GST-gG2-T融合蛋白的活性。结果通过原核系统表达的GST-S2融合蛋白(本文来源于《中华医学会第十二次全国皮肤性病学术会议论文集》期刊2006-06-30）
王茜[10]（2006）在《单纯疱疹病毒2型gG2“独特区”基因的克隆表达及其血清学诊断的价值初探》一文中研究指出一、研究意义和目的单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒颗粒大小约180纳米。根据抗原性的差别目前把该病毒分为1型和2型。人群中HSV感染较为普遍，人是疱疹病毒的自然宿主。HSV-2型主要与外生殖器感染及新生儿感染有关，可引起生殖器疱疹、新生儿疱疹。通过医学界近年来多方面的研究表明HSV-2与宫颈癌发生有关，并且增加了AIDS的感染机会。据1992年统计，美国每年有1200多万STD新患者，生殖器疱疹病毒感染近20年增加15倍，累计人数超过2000万，跃升为最流行的STD之一。从STD发展趋势看，病毒和衣原体感染引起的STD比传统的性病显得更为重要，称为第二代STD。如果说以前对传统的性病易于治疗的话，那么对日益剧增的第二代STD病原体，尤其是病毒性STD，其危害性不仅表现在诊断、治疗上困难增大，而且并发症和后遗症也更为严重，直接威胁人类的生命健康。生殖器疱疹的临床表现多种多样，可表现为典型的水疱和糜烂，但不典型和亚临床感染者更为多见，后者易被人们所忽视，成为重要的感染源。目前对于单纯疱疹病毒感染的检测手段有限，血清学方法标准的补体结合技术不能鉴别HSV-1和HSV-2，传统的病毒培养法费时费力。我们旨在建立基于HSV型特异的糖蛋白G(gG)的检测HSV血清抗体的蛋白印迹试验疫吸附试验，为临床中单纯疱疹病毒的感染提供更快、更有效及明确的诊断方法。大量研究表明，HSV病毒颗粒中有至少12种胞膜糖蛋白(glycoprotein g)，gB、gC、gD、gE／gI、gG、gH／gL、gK、gM／gN、gJ。其中gG携带有HSV型特异抗原决定簇，gG-2在单纯疱疹2型病毒诊断、分型、疫苗研究中有举足轻重的地位。gG-2由US4编码，基因片段长度为2100bp，可以编码699个氨基酸的蛋白质。本研究分析了单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白G-1和单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白G-2的B细胞抗原表位，并用信息学软件比较了两者之间的基因差异。研究发现HSV-2的gG-2基因全长中包括一个与HSV-1的gG-1基因高度同源的区域和一个“独特区”。gG-1基因和gG-2基因在“独特区”中的同源性非常低。对gG-2蛋白的B细胞抗原表位预测发现，在gG-2蛋白中存在7段抗原指数以及表面可能性强的肽段相对集中区域。另有研究者发现，HSV-2的gG-2基因序列抗原区域极少突变，即使出现了点突变也不会削弱gG-2的血清学活性。该报告进一步证实gG-2基因可以作为型特异性抗原，同时指出gG-2基因的保守性是作为HSV-2特异疫苗成分的先决条件。因此，本研究将靶蛋白抗原锁定为gG-2的“独特区”(gG-2_T)。对单纯疱疹病毒gG-2_T进行扩增、克隆。在原核系统中表达，并对表达蛋白的蛋白进行纯化，对其抗原活性进行初步研究。二、研究方法和内容1、从临床确诊病人水疱部位取材、分离病毒并在Vero细胞中培养。2、根据GenBank提供的单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白G-2的基因组序列，设计扩增引物，上游的引物序列是“5′GAATTCatggcacgacccacggaagacg-3′”；下游的引物序列是5′-CTCGAG cggggttgcgggtccgg-3′。以Vero细胞病毒培养液上清提取的DNA为模板，扩增gG-2基因，构建克隆载体pGEM-T-G2，通过PCR鉴定。3、从GenBank中下载单纯疱疹病毒1型糖蛋白G-1序列，输入LaserGene软件包中的Editseq软件中，截取gG-1基因片段，翻译成氨基酸序列。利用Clustal X软件将扩增的gG-2基因与下载的gG-1基因片段核苷酸和氨基酸序列进行比较。利用Proetean和DNAMAN软件对单纯疱疹病毒1型和2型的糖蛋白G进行抗原表位、α螺旋中心以及疏水区域进行预测，并比较它们之间的差异4、根据序列分析结果，选定gG-2_T为目的序列。根据单纯疱疹病毒333株gG-2基因序列设计引物，在引物两端加上EcoRⅠ／XhoⅠ限制性内切酶位点。以pGEM-T-G2质粒为模板扩增gG-2_T，得到pGEM-T-gG-2_T重组克隆载体。5、将pGEX-4T-1载体与pGEM-T-gG-2_T分别经过EcoRⅠ／XhoⅠ双酶切后连接，构建融合表达载体pGEX-4T-1-gG-2_T，转化宿主菌BL21，通过双酶切，PCR方法鉴定后测序。6、利用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳及Western-blot分析对表达蛋白进行初步鉴定。7、优化表达条件。将目的蛋白于上清表达，并使用GST亲和纯化试剂盒进行表达蛋白的纯化。8、利用纯化蛋白与单纯疱疹病毒1型、2型病人血清以及正常人血清进行Western blotting、间接EHSA反应。叁、研究结果1、Vero细胞变性，病毒成功地在Vero细胞中扩增。2、提取病毒DNA，扩增单纯疱疹病毒2型gG-2基因，gG-2基因全长2100bp，与单纯疱疹病毒2型333株gG-2基因同源性为99.5％。以gG-2基因为模板，扩增并克隆gG-2_T区，gG-2_T区序列大小为591bp，编码197个氨基酸。3、利用生物信息学软件对Poly-Kyte-Doolittl亲水性、Polt-Emini表面可能性、Jameson-Wolf抗原指数叁参数综合预测，结果显示，HSV-2-G2蛋白C端的抗原指数较强。4、通过优化表达条件，pGEX-4T-1-gG-2_T可在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白，分子量约为46KD。通过超声裂解，表达的融合蛋白以上清的形式溶解在裂解液中。融合蛋白含有GST标签，可以通过GST亲和纯化柱进行纯化。5、通过调整优化条件，获得纯度较高的重组表达蛋白gG-2_T。蛋白的纯化纯度大于95％。6、纯化的目的蛋白能与GST多克隆抗体发生反应，能与单纯疱疹病毒2型病人血清反应，而不与单纯疱疹病毒1型病人血清发应。故通过实验得到我们需要的目的蛋白。四、研究结论鉴于预防、检测和治疗HSV感染的重要性，研制新型特异性诊断试剂盒以及开发疫苗是目前诊断和预防单纯疱疹病毒感染的最可行有效的方法。前者能快速准确诊断、鉴别初次感染和再次感染、用于大规模HSV感染的流行病筛查，后者能使机体在抗HSV感染免疫中，发挥体液免疫和细胞免疫功能来消除HSV感染。HSV-2包膜糖蛋白gG-2基因全长为2100bp，由US4基因编码699个密码子，包括一个与HSV-1包膜糖蛋白gG-1基因高度同源的区域和一个“独特区”。通过对gG-1蛋白和gG-2蛋白的比对以及B细胞抗原表位的预测我们发现，gG-1基因和gG-2基因在“独特区”中的同源性非常低。Grabowsk等人利用噬菌体展示技术发现两个位于gG-2“独特区”内的免疫显位在氨基酸残基的351-427、525-587内，并通过试验证明这两段氨基酸残基只与HSV-2型单纯疱疹病毒反应而不予HSV-1型单纯疱疹病毒反应。Ikoma等利用杆状病毒表达系统表达gG-2(281aa～594aa)，检测HSV-2型感染病人血清特异性抗体，特异性和敏感性达到95.5％。由此说明这两段区域的肽段适合用作临床抗体检测，尤其适合用作HSV-2分型诊断。研究发现，HSV-2的gG-2基因序列抗原区域极少突变，即使出现了点突变也不会削弱gG-2的血清学活性。该报告进一步证实gG-2基因可以作为型特异性抗原，同时指出gG-2基因的保守性是作为HSV-2特异疫苗成分的先决条件。本文采用分子克隆及基因重组技术成功构建出HSV-2型gG-2_T(285～482aa)基因片段，利用原核表达载体表达出含有gG-2_T的融合蛋白，通过Western-Blot免疫印迹检测表达蛋白能与GST多克隆抗体特异性结合。纯化的蛋白即为我们需要的目的蛋白。间接ELISA证明表达的蛋白能够与HSV-2阳性病人反应而不与正常人血清和HSV-1病人血清反应，表明原核表达的蛋白具有一定的免疫学活性。以上研究为单纯疱疹病毒2型感染的型特异性诊断试剂盒的研发，生殖器疱疹筛查、型特异性疫苗研究寻找更好的靶位点提供参考。(本文来源于《第一军医大学》期刊2006-04-01）
独特区论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
【背景】人细小病毒B19(Human parvovirus B19，简称B19病毒)是一种单链线状小DNA病毒，能导致多系统疾病，如自然流产、胎儿畸形、再生障碍性贫血危象、肾小球肾炎、关节炎等，严重者可致死。本实验室首次报道心脏发育畸形的胎儿心脏尸检标本及先天性心脏病(CHD)心肌组织标本中有较高的B19病毒DNA检测阳性率，提示B19病毒感染可能与部分CHD发病相关，接着国外研究还提示B19病毒感染可引起心肌炎、川崎病、冠状动脉病变等心血管疾病。值得重视的是，由于B19病毒不能常规培养分离和不能感染实验动物如鼠、狗和猪等，因此其感染导致上述疾病的机理尚未阐明。B19病毒基因编码的结构蛋白VP2蛋白包含在VP1蛋白中，VP1蛋白N末端的227个氨基酸叫做VP1独特区蛋白(VP1u蛋白)。既往研究将VP1u蛋白作为亚单位疫苗研究的候选分子，本实验室发现VP1u蛋白可导致BALB/c小鼠心脏病变，包括心肌纤维间隙增宽、肌丝崩解、线粒体空泡化等。这一结果提示须重新审视B19病毒VP1u蛋白的功能，并回答下列相关问题：B19病毒VP1u蛋白引起心脏病变的机制是什么？是病毒蛋白直接毒性作用造成组织损伤，还是其刺激机体产生的抗体导致心脏损害？其通过什么信号通路导致心肌损伤？其引起心肌病变与B19病毒致胎儿心脏水肿、流产、心脏畸形有无相关性？它是否强烈地告知B19病毒VP1u蛋白用于疫苗研究的不可能性？为此，本项目将用纯化的B19病毒VP1u蛋白和单克隆抗体(mAb)作用离体心肌细胞和鼠(包括孕鼠)，用光镜、电镜、免疫组织化学、流式细胞仪和信号通路分析等方法，研究心肌细胞结构、凋亡、细胞表面标志物、细胞因子、细胞粘附分子和信号通路变化。这将有助于揭示B19病毒感染的发病机制，也有助于对病毒蛋白毒性和免疫损伤机制的认识或致病相关通路的新发现，并进一步促进B19病毒致病机理及预防疫苗的研究。【目的】1.获得B19病毒VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb，为后续研究奠定基础。2.研究B19病毒VP1u蛋白对离体和整体动物心肌细胞结构、凋亡、相关细胞因子、细胞表面标志物和信号通路的影响，从病毒蛋白毒性、免疫损伤、信号通路改变方面探讨B19病毒VP1u蛋白致心肌病变的机制。3.研究B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏重量、结构、凋亡、细胞表面标志物、信号通路及胎鼠流产的影响，探讨B19病毒VP1u蛋白与心脏发育和胎鼠流产的关系。【方法】1. B19病毒VP1u蛋白纯化及mAb制备⑴根据已经构建的VP1u蛋白表达纯化体系获得B19病毒VP1u蛋白。⑵用B19病毒VP1u蛋白免疫小鼠，免疫后脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得鼠源性mAb。2. B19病毒VP1u蛋白对离体培养心肌细胞作用的研究⑴采用酶消化、差速贴壁和5-溴脱氧尿苷(5-Brdu)抑制法获得高纯度离体培养心肌细胞。⑵给予B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预离体心肌细胞，首先计算VP1u蛋白入心肌细胞率，然后，通过光镜和电镜观察心肌细胞结构，干化学分析法检测心肌酶谱和ELISA法定量检测细胞因子变化。⑶TUNEL免疫荧光法、流式细胞仪检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预离体心肌细胞导致心肌细胞凋亡情况。⑷免疫细胞化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预心肌细胞后细胞粘附分子ICAM-1(CD54)、VCAM-1(CD106)和E-selectin(CD62E)变化。⑸Western blot检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后离体心肌细胞NF-κB信号通路和p38MAPK信号通路变化。3. B19病毒VP1u蛋白致正常鼠心脏病变的研究⑴用B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射BALB/c小鼠，光镜和电镜观察心脏组织结构变化，干化学分析法检测心肌酶谱变化，ELISA法定量检测细胞因子变化。⑵TUNEL免疫荧光法、免疫组织化学法和流式细胞仪检测VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预鼠心脏中心肌细胞凋亡情况。⑶免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预鼠心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin变化。⑷原位分子杂交技术检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预鼠心肌细胞中NF-κB、PKC-α及PDGF-β变化。⑸根据实验结果提出B19病毒VP1u蛋白引起心肌病变的信号通路。4. B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏的影响⑴用B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射BALB/c孕鼠，观察流产情况，采集胎鼠心脏组织，称重，光镜和电镜观察心脏组织结构。⑵TUNEL免疫荧光法和免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心脏中心肌细胞凋亡情况。⑶免疫组织化学法检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin变化。⑷原位分子杂交技术检测B19病毒VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预后胎鼠心肌细胞中NF-κB、PKC-α及PDGF-β变化。【结果】1. B19病毒VP1u蛋白纯化及mAb制备⑴获得分子量22kDa、浓度1.2mg/mL、纯度96.7%的B19病毒VP1u蛋白，并获得两株分泌抗B19病毒VP1u蛋白mAb的细胞株，分别命名4-H-5和5-B-9，两株mAb细胞株分泌抗体均为IgG2a，抗体稀释倍数为1:16000时检测结果仍为阳性，4-H-5抗体的效价高于5-B-9，纯化后抗VP1u蛋白mAb浓度分别是900μg/mL(4-H-5)和1110μg/mL(5-B-9)。2. B19病毒VP1u蛋白对离体培养心肌细胞作用的研究⑴通过酶消化法、差速贴壁法和5-Brdu抑制法得到离体培养心肌细胞，6~8h心肌细胞贴壁，12~16h出现不规律搏动，自发搏动频率40~80次/min。贴壁心肌细胞呈梭形，中心可见细胞核，每个细胞向外伸出数个突起，心肌细胞存活率82%。5~6d形成菊花状功能小体，此时搏动较规律，52.6±18.6次/min。⑵离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb共同干预组、抗VP1u蛋白mAb干预组电镜下发现细胞自噬。⑶离体心肌细胞实验中，BCA法检测细胞培养液中VP1u蛋白量，进入心肌细胞的VP1u蛋白量是0.036~0.468μg，统计学处理，P>0.05，各剂量组在不同时间点差别无统计学意义；P>0.05，各剂量组组间差别无统计学意义。ELISA法直接检测心肌细胞匀浆中VP1u蛋白量，进入心肌细胞VP1u蛋白量0.012~0.076μg，统计学处理，P>0.05，各剂量组在不同时间点差别无统计学意义；P>0.05，各剂量组组间差别无统计学意义。⑷离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞培养液中心肌酶谱与对照组比较，P>0.05，差别无统计学意义。⑸离体心肌细胞实验中，B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞培养液中IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β1与对照组比较，P>0.05，差别无统计学意义。⑹离体心肌细胞实验中，通过TUNEL免疫荧光和流式细胞分析技术，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞发生细胞凋亡。B19病毒VP1u蛋白干预组细胞凋亡率5.4%，B19病毒VP1u蛋白和抗B19病毒VP1u蛋白mAb共同干预组细胞凋亡率7.7%，抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组细胞凋亡率15.5%。⑺离体心肌细胞实验中，免疫组织化学提示B19病毒VP1u蛋白刺激心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达增强。⑻离体心肌细胞实验中，PKC/p38MAPK信号通路和NF-κB信号通路参与B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞凋亡。3. B19病毒VP1u蛋白致正常鼠心脏病变的研究⑴整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组光镜下均发现心肌细胞间隙增宽，细胞核肿胀，核浆比例增高；电镜下均可见心肌细胞中线粒体聚集，细胞核稍缩小，核染色质致密并边集于核膜处。⑵整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组AST、CK、CK-MB、LDH和α-HBDB值行LSD-t检验，组间两两比较，P<0.05，干预组与对照组间差别有统计学意义。⑶整体动物实验中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β1值行LSD-t检验，组间两两比较，P<0.05，干预组与对照组间差别有统计学意义。⑷整体动物实验中，通过TUNEL免疫荧光、免疫组织化学和流式细胞分析技术，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞发生细胞凋亡。抗B19病毒VP1u蛋白mAb注射组，细胞凋亡率最高(15.9%)。该凋亡过程中伴有抑制凋亡分子Bcl-2出现。⑸整体动物实验中，免疫组织化学提示B19病毒VP1u蛋白刺激心肌细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达增强。⑹整体动物实验中，通过原位分子杂交技术在B19病毒VP1u蛋白和或抗B19病毒VP1u蛋白mAb干预组检出NF-κB、PKC-α及PDGF-β。4. B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏的影响⑴对胎鼠心脏影响研究中，实验期间有23只小鼠怀孕，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组与对照组均未见胎鼠流产。各组产仔数量进行组间方差分析，P>0.05，差别无统计学意义；各组胎鼠心脏重量进行组间方差分析，P>0.05，差别无统计学意义。⑵对胎鼠心脏影响研究中，VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb注射组光镜下均可见心肌细胞间隙增宽，胞质透明淡染，部分心肌细胞脂肪变性。电镜下VP1u蛋白注射组可见心肌细胞间隙增宽，细胞膜下空泡，可见次级溶酶体；VP1u蛋白和抗VP1u蛋白mAb共同注射组、抗VP1u蛋白mAb注射组均可见线粒体聚集在增宽的心肌细胞间隙中，线粒体有空泡化。⑶对胎鼠心脏影响研究中，通过TUNEL免疫荧光和免疫组织化学，首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导胎鼠心肌细胞发生细胞凋亡。⑷对胎鼠心脏影响研究中，免疫组织化学法在VP1u蛋白注射组和或抗VP1u蛋白mAb注射组心脏组织中检出微弱棕色信号提示有少量ICAM-1、VCAM-1和E-selectin。⑸对胎鼠心脏影响研究中，通过原位分子杂交技术在VP1u蛋白和或抗VP1u蛋白mAb干预组检出NF-κB、PKC-α及PDGF-β。【结论】⑴获得B19病毒VP1u蛋白和两株分泌抗B19病毒VP1u蛋白mAb的细胞株，为后续B19病毒VP1u蛋白相关研究奠定了基础。⑵通过ELISA法检测心肌细胞匀浆中VP1u蛋白量和BCA法检测细胞培养液中VP1u蛋白量，结果提示VP1u蛋白没有进入心肌细胞内。⑶离体心肌细胞培养时，干预组心肌酶谱没有升高，而整体动物研究时，干预组心肌酶谱升高，提示VP1u蛋白并非直接破坏心肌细胞膜，可能与VP1u蛋白依赖分子拟态刺激机体产生自身抗体引起免疫性心肌损伤有关。⑷首次发现B19病毒VP1u蛋白诱导心肌细胞凋亡。⑸心肌细胞发生凋亡过程中，伴有ICAM-1、VCAM-1、E-selectin和Bcl-2等抑制细胞凋亡分子升高，提示抑制凋亡与促进凋亡的对抗随着时间变化而变化，为了阐明两者的相互关系，将进一步研究不同时间点相关分析。⑹首次揭示B19病毒VP1u蛋白致心肌细胞凋亡过程中包含有NF-κB信号通路和p38MAPK信号通路，需要相应信号通路抑制剂来进一步证实上述信号通路是否为主要信号通路。⑺本研究结果揭示B19病毒VP1u蛋白能引起胎鼠心脏水肿，但没有引起胎鼠死亡、流产和心脏发育畸形。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
独特区论文参考文献
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