王涛1张玲2申元英1、2(通讯作者)李丽娟2
（1大理学院基础医学院云南大理671000；2大理学院公共卫生学院云南大理671000）
【摘要】目的探讨松茸醇提取物的水溶液及脂溶液对小鼠免疫功能的影响。方法分别用松茸的水溶液及脂溶液给小鼠灌胃10d后，检测小鼠免疫器官重量、单核-腹腔巨噬细胞吞噬能力、淋巴细胞增殖转化及细胞因子的情况。结果胸腺指数测定和淋巴细胞转化试验阳性。结论松茸对正常小鼠有免疫增强
作用。
【关键词】松茸免疫活性小鼠
【中图分类号】R392【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）01-0237-02
松茸因含有肽、甾类以及多种酶类，被日本人成为“菇中之王”[1]。研究表明野生松茸可能增强机体免疫功能[2]。本研究拟通过采集云南野生松茸的水提剂和醇提剂为受试药物进行小鼠的免疫活性测定，检测其免疫功能及其可能的机制，现报道如下：
一、材料和方法
（一）材料
1.受试药品
由大理学院药学院药物研究所提供的松茸乙醇提取物，提取率为25%～32%之间，使用冷冻法干燥。
2.实验动物
由昆明医学院动物中心提供的昆明种小鼠，共计515只，其中雄性259只，雌性256只，4～6周龄，体重18～22g。实验动物许可证号：scxk(滇)2005-0008。
3.主要仪器和试剂
（1）主要仪器
连续波长酶标仪（PowerwaveXS,美国），CO2培养箱（SANYO,日本），恒温水浴箱（DKB-600B型，上海一恒科学仪器有限公司），电子天平（天-J42003，上海上平仪器公司），台式离心机（Mini-6K，杭州奥盛仪器有限公司），低速离心机（LC-4012，科大创新股份有限公司中佳分公司）。
（2）主要试剂
二甲基亚砜DMSO（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：070707），注射用环磷酰胺（山西普德药业有限公司，批号：20100307），乙醚（山西杨林工业开发区汕滇药业有限公司，批号：101030），小牛血清（北京奥博星生物技术责任有限公司，批号：20100303），RPMI-1640(Invitrogen公司，批号：1313945)，植物血凝素PHA(SolarbioLifesciences,批号：P8090)，四噻唑盐(MTT，又称四甲基偶氮唑盐)。MouseIL-2ELISA检测试剂盒（Quantikine，批号：281038），MouseTNFαELISA检测试剂盒（Quantikine，批号：282254）。
（二）方法
1.实验分组
松茸（SR）样品溶解时使用超纯水（ddH2O）和二甲基亚砜(DMSO)两种溶剂。140只小鼠分为14个小组，每组10只。分组情况为：SR水溶组（200mg/kg），SR脂溶组（200mg/kg），SR+CTX水溶组(200mg/kg+40mg/kg)，SR+CTX脂溶组(200mg/kg+40mg/kg)，每个大组根据性别分为雌雄两个小组，另设溶剂对照组DMSO（20ml/kg）和ddH20（20ml/kg）各有雌雄两个小组，环磷酰胺阳性对照组（CTX，40mg/kg)，雌雄两个小组。各组分别灌胃1次/d，连续10d后检查松茸提取物对小鼠免疫器官、巨噬细胞吞噬功能、淋巴细胞增殖情况、细胞因子（IL-2,TNFα）的影响。
2.检测方法
2.1脏器/体重比值测定：小鼠颈椎脱臼处死称重后，立即取出胸腺和脾脏，用滤纸吸干血液后称重，胸腺(脾)指数单位:胸腺(脾)质量/小鼠体质量(mg/10g)。
2.2吞噬功能：处死动物前3d，以5%的淀粉肉汤启动小鼠巨噬细胞，采用半体内法检测腹腔巨噬细胞吞噬功能，以100个巨噬细胞中吞噬酵母菌的巨噬细胞数(吞噬率)及每个巨噬细胞吞噬酵母菌的个数(吞噬指数)作为评价指标。
2.3T淋巴细胞增殖测定(MTT法)：无菌取出脾脏，制成脾细胞悬液，用RPMI1640不完全营养液洗涤3次，1000r/min离心10min，然后用完全营养液配成1×107/ml。取100μl加入96孔细胞培养板内(每孔1×106个细胞，每个样品做3个复孔)。再加入240mg/L的PHA20μl(使终浓度为40mg/L，同时设不加PHA的对照孔)，置37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，每孔加入10μlMTT溶液(5g/L)，再继续培养4h，离心，弃上清液，然后加入30%DMSO100μl，充分振荡后静置20min，用酶标仪于波长570nm处测A值。
2.4细胞因子的检测将动物用乙醚麻醉以后，摘眼球取血。将血液静置离心后，获得血清，测IL-2,TNFα得指标，具体按试剂盒说明操作步骤进行。
3.统计学分析应用SPSS17.0软件对数据进行方差分析。显著性检验水准为α=0.05。
二、结果及讨论
据文献记载，松茸有抗肿瘤及抗炎的功效[2]。松茸主要的活性成分是多糖类，松茸多糖多为葡聚糖。葡聚糖有两种异构体：α-葡聚糖和β-葡聚糖。近年来，许多的研究机构都对β-葡聚糖的抗癌活性进行了深入的研究[1]。松茸的多糖成分通过间接提高机体免疫力和抑制肿瘤细胞增殖等方式，具有明显的抗癌活性[3]。松茸菌丝体水提液中的活性糖蛋白MTSGS1，在抗肿瘤试验中具有直接杀伤肿瘤细胞的作用[4]。松茸中的可挥发性物质具有抗氧化，免疫调变以及抗癌作用[1]。松茸中的维生素B1、B2、维生素C、等具有抗肿瘤与抗癌作用[5]。松茸还可提高因为注射环磷酰胺导致免疫功能低下小鼠的免疫功能,并使之使之保持正常[6]。
实验显示：松茸水溶和脂溶雄性组的胸腺指数的均数大于对应的溶剂（ddH2O、DMSO）对照组，松茸脂溶的雌性和雄性组的胸腺指数的均数大于对应的混合组（SR+CTX）；各组间小鼠的脾指数无统计学差异；各组的吞噬率和吞噬指数之间无统计学差异；松茸脂溶雌性组的淋巴细胞增值转化测定A值均数大于对应的混合组。
细胞因子检测中，各组的IL-2和TNFα浓度的差异无统计学意义。松茸水溶雄性的胸腺指数小于对应脂溶组的胸腺指数，松茸水溶剂对小鼠胸腺的增重作用大于脂溶剂的作用。
SR+CTX水溶雌性组的胸腺指数大于对应雄性组的胸腺指数，SR+CTX脂溶雌性组的A值大于对应雄性组的A值。松茸对雌性小鼠胸腺的增重作用大于雄性小鼠。
本实验表明松茸对正常小鼠均有免疫增强作用，其机理有待于进一步研究。根据免疫功能检验方法[7]的判定标准（胸腺指数和淋巴细胞转化试验阳性），说明松茸有免疫增强的作用。
参考文献
[1]陈霞,刘芹,丁侃.松茸的化学成分、活性及其药理作用研究进展[J].中国医疗前沿,2009,12:114-116.
[2]TidkeG，RaiM.Biotechnologicalpotentialofmushrooms:drugsanddyeproduction[J].InternationalJournalofMedicinalMushrooms,2006,(4):351-360.
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[5]胡尚勤,刘天贵.松茸发酵物中活性成分的提取与作用的研究[J].安徽农业大学学报,2006,33(4):499-501.
[6]廖丽娟,金光洙.松茸的化学成分及其药理作用的研究进展[J].中国野生植物资源,2010,29(1):12-14.
[7]李仪奎,金若敏,王钦茂.中药药理实验方法学（第二版），见：免疫药理实验方法[M].上海:上海科学技术出版社，2006.pp721-35.基金资助：云南省人才培养基金2006py1-057
王涛（1975--），女，实验师，主要从事医学微生物学及免疫学实验及研究。
通讯作者：申元英，女，教授.