一、组织工程技术构建角膜组织研究进展（论文文献综述）
延亚云[1]（2021）在《基于光交联水凝胶的体外角膜再生研究》文中研究说明角膜盲是第二大致盲眼病,绝大多数患者可通过移植健康的供体角膜来治愈,更严重的情况下,通过植入没有生物活性的人工角膜来治疗。然而供体角膜严重短缺以及人工角膜具有并发症的风险,基于此,使用角膜组织工程技术手段构建可行的角膜替代物是很有前景的角膜盲治疗方法。选择合适的生物支架材料和种子细胞是角膜组织工程迫切需要解决的两个关键问题。本论文首先通过甲基丙烯酸酐（MA）对明胶进行改性,改善其热稳定性,制备了四种不同浓度（7%、10%、15%和30%）的甲基丙烯酸酯化明胶（GelMA）水凝胶,并对其理化、光学性质以及生物相容性进行了表征。结果表明,GelMA浓度越低,水凝胶的杨氏模量越小,亲水性和光学性能越好。同时通过MTT检测、活/死染色、细胞形态学观察实验,研究在不同浓度GelMA水凝胶上培养的大鼠骨髓间充质干细胞（rBMMSCs）的细胞粘附性、活力和增值情况。此外,通过免疫荧光染色和角膜基质细胞标志基因的表达来表征rBM-MSCs分化为角膜基质样细胞的能力,其中标志物包括Keratocan、Lumican、ALDH1A1、α-SMA。体外实验的研究结果表明,7%浓度的GelMA水凝胶更有利于rBM-MSCs的生长和增殖,然而30%GelMA水凝胶为rBM-MSCs分化为角膜基质样细胞提供了更好的动态微环境。其次,同样通过MA对透明质酸进行改性,合成甲基丙烯酸酯化透明质酸（HAMA）水凝胶。将GelMA（10%w/v）和HAMA（0.5%w/v）混合以制备GelMA/HAMA双网络（DN）水凝胶。通过机械性能、光学性能、亲水性、体外原位降解等表征实验,研究GelMA、HAMA和DN水凝胶的理化性能差异,发现DN水凝胶在可见光区域是光学透明的,拥有超越GelMA和HAMA单网络水凝胶的良好机械性能,且亲水性与人体正常角膜相似。最后,对DN水凝胶进行生物学性能测试。体外兔角膜上皮细胞（CEp Cs）培养结果显示,在DN水凝胶上培养CEp Cs增值效果明显,表明该水凝胶具有良好的细胞粘附性和优异的生物相容性。通过免疫荧光染色来表征体外培养的CEp Cs中特异性标志物角蛋白3（CK3）的表达。实验结果表明,与GelMA、HAMA单网络水凝胶相比,DN水凝胶更有利于维持CEp Cs在体外对CK3的表达。所有实验结果都表明,GelMA/HAMA DN水凝胶具有作为角膜上皮组织工程生物支架的潜力。
贾艳妮[2]（2019）在《人胚胎干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究》文中提出研究目的外伤、手术、眼内炎等多种因素均可造成角膜内皮细胞的损伤或丧失,由于人角膜内皮细胞不能再生,内皮细胞的缺失超过其临界值时,将会导致角膜内皮功能失代偿,出现角膜水肿、视物模糊和眼部刺激等症状,严重者继发角膜溃疡。目前临床治疗主要依赖角膜移植,但角膜供体的缺乏严重限制了手术开展和患者复明。随着组织工程和细胞工程技术的不断发展,组织工程角膜的研究也取得一定进展,组织工程角膜内皮是当前研究的热点。人胚胎干细胞是组织工程角膜内皮种子细胞的理想来源,但目前存在诱导时间长、效率低、移植手术要求高、体内功能差、细胞存活期短等问题。本研究改良了角膜内皮细胞的移植方法,通过制备迷你植片进行前房注射;采用小分子维甲酸（retinoic acid,RA）、Y-27632和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）体外诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESC）分化为角膜内皮样细胞,建立了hESC来源的角膜内皮样细胞定向分化体系;利用新西兰大白兔和食蟹猴角膜内皮失代偿动物模型,结合迷你植片前房注射移植方法,验证hESC来源的角膜内皮样细胞体内功能,为临床治疗角膜内皮功能失代偿提供新的策略和方法。研究方法1.角膜内皮迷你植片的制备和移植通过单细胞前房注射法与角膜后弹力层剥除内皮移植术（Descemet’s Stripping Endothelial Keratoplasty,DSEK）行兔原代角膜内皮细胞（Rabbit Corneal Endothelial Cells,RCECs）移植,通过裂隙灯显微镜观察对比术后效果;利用不同的细胞消化酶（Accutase、胰蛋白酶-EDTA或Dispase）处理原代培养的兔角膜内皮细胞,通过对比植片大小、细胞存活率优化迷你植片制备条件;对比迷你植片与单细胞的贴附能力、细胞链接形成能力以及术后角膜透明度和厚度恢复情况。2.体外诱导hESC分化为角膜内皮样细胞hESC在mTeSRTM1培养基中培养传代,采用添加RA+bFGF的UM培养液诱导hESC向神经嵴细胞分化,通过免疫荧光染色和流式细胞仪检测,对hESC来源神经嵴细胞进行鉴定;采用添加Y-27632的DP培养液诱导分化为角膜内皮细胞,通过免疫荧光染色、流式细胞仪检测和PCR检测,对hESC来源的角膜内皮样细胞进行鉴定;通过NOD/SCID免疫缺陷鼠接种评估hESC来源的角膜内皮样细胞的安全性。3.hESC来源的角膜内皮样细胞移植功能鉴定将诱导的角膜内皮样细胞制备成迷你植片,通过前房注射法移植于新西兰大白兔右眼,以单纯刮除角膜内皮细胞的实验兔作为对照组。术后采用裂隙灯显微镜和超声测厚仪观察角膜及测量角膜厚度,比较两组角膜透明度和角膜厚度的恢复情况。使用活体共焦角膜显微镜扫描角膜中央区观察不同时间点移植细胞的形态。细胞移植术后不同时间点取材,通过免疫荧光染色观察移植细胞的紧密链接情况及内皮泵功能,利用地高辛标记细胞观察移植细胞的存活情况。同时采用迷你植片前房注射法移植于角膜内皮功能失代偿的食蟹猴模型,术后通过裂隙灯显微镜观察角膜透明度的恢复情况,采用超声测厚仪观察角膜厚度的变化情况,活体共焦角膜显微镜扫描角膜中央区观察移植内皮细胞的形态。诱导的角膜内皮样细胞移植术后取材行免疫荧光染色观察移植细胞在后弹力层的贴附存活情况及细胞紧密链接和内皮泵功能。研究结果1.角膜内皮细胞移植方法比较（1）单细胞前房注射法与DSEK法移植细胞的结果对比单细胞前房注射法与DSEK法行培养的兔原代角膜细胞移植术后角膜水肿消退的速度无明显差异。单细胞前房注射后角膜水肿逐渐消退,角膜恢复透明并维持稳定。DSEK法移植的角膜植片在术后早期有贴附不良现象,可见少量层间积液,角膜水肿消退后,植片可见部分混浊。（2）不同消化酶对兔原代角膜内皮细胞的影响Dispase消化能力过弱,细胞主要解离成大片状细胞植片。胰蛋白酶-EDTA消化能力过强,细胞迅速解离成单细胞。Accutase消化能力适中,细胞主要解离成含有4-10个细胞的细胞植片,并且随着消化时间的延长,植片形态变化不大。10分钟内Acutase或胰蛋白酶-EDTA对离体细胞消化损伤较小,细胞活力接近或超过90%,15分钟后两种消化酶解离的细胞存活率显着下降。（3）迷你植片移植动物实验迷你植片和单细胞悬液体外1小时及移植6小时后贴壁情况对比可见迷你植片组贴壁的细胞数目明显高于单细胞组。前房注射后48小时取材免疫荧光染色显示迷你植片组紧密链接蛋白ZO-1和内皮泵Na+/K+-ATPase表达量高于单细胞组。术后活体共焦角膜显微镜扫描显示迷你植片组术后7天角膜内皮细胞可见明显的六边形细胞形态,细胞之间链接紧密,而单细胞组术后7-21天之间细胞形态不规则,细胞之间未见正常的结构链接。迷你植片组比单细胞组具有更高的细胞密度。裂隙灯显微镜观察显示迷你植片组角膜透明度在术后7天迅速恢复,而单细胞组在术后14天逐渐恢复。术后角膜厚度测量结果显示迷你植片组术后7天角膜厚度迅速下降并保持稳定,而单细胞组术后14天角膜厚度逐渐下降至近正常水平。2.建立hESC来源的角膜内皮样细胞定向分化的方法（1）体外诱导人胚胎干细胞分化为神经嵴细胞hESC经诱导后形态逐渐发生变化,表现为干细胞克隆内细胞体积变大,核质比变小,细胞形态逐渐变为多角形。免疫荧光染色显示诱导的细胞表达神经嵴细胞标志基因（HNK-1、P75、SOX10、PITX2和AP-2α）;流式细胞仪检测P75和HNK-1显示阳性细胞比率达到84.733%和72.993%。（2）体外诱导神经嵴细胞分化为角膜内皮样细胞在分化培养基中的神经嵴细胞形态发生变化,细胞呈多边形,排列紧密成铺路石样形态。免疫荧光染色显示该细胞表达角膜内皮细胞标志性基因（ZO-1、Na+/K+-ATPase和N-cadherin）,不表达血管内皮细胞相关标志物（vWF和CD31）。流式细胞仪检测Na+/K+-ATPase显示阳性细胞比率达到98.090%。（3）分化细胞的致瘤性胚胎干细胞接种NOD/SCID免疫缺陷鼠5到6周后可见皮下包块形成,取材行石蜡切片染色可见多胚层组织细胞形态。诱导的角膜内皮样细胞接种免疫缺陷鼠观察8月后仍未见肿物形成。3.hESC来源的角膜内皮样细胞动物体内治疗效果（1）hESC来源的角膜内皮样细胞在新西兰大白兔模型的移植治疗效果裂隙灯显微镜观察显示移植细胞组兔角膜透明度在术后7天开始逐渐恢复,术后2周角膜基本恢复透明。术后观察4到8周角膜透明度维持稳定未见反复。对照组角膜术后混浊明显,至术后8周角膜仍未恢复透明。移植细胞组术后7天角膜厚度逐渐下降并在2-3周内恢复至正常厚度,而对照组术后角膜厚度下降不明显,长期保持在1000μm左右。活体共焦角膜显微镜扫描显示术后2周移植细胞组角膜中央区后弹力层贴附细胞直径明显小于正常角膜内皮细胞,细胞密度高,细胞六边形形态不典型,细胞之间未见明显链接形成。术后5周扫描显示细胞直径与正常角膜内皮细胞相比略大,部分细胞可见类似六边形形态,细胞之间可见链接形成。术后8周扫描显示细胞形态及大小与术后5周基本类似,细胞形态维持稳定。术后1周免疫荧光染色可见后弹力层贴附细胞抗人抗体染色阳性,移植细胞可见明显ZO-1及Na+/K+-ATPase的表达。术后4周取材移植地高辛标记细胞的角膜行荧光显微镜观察可见角膜中央区域大量红色荧光的移植细胞。（2）hESC来源的角膜内皮样细胞在食蟹猴模型的移植治疗效果裂隙灯显微镜观察显示角膜透明度在细胞移植术后7天逐渐恢复,可见清晰的瞳孔轮廓。术后2周角膜基本恢复透明,虹膜纹理清晰可见。角膜厚度测量显示细胞移植术后14天内角膜厚度逐渐下降至基本正常。活体共焦角膜显微镜扫描结果显示,术后11天角膜中央区后弹力层贴附的细胞直径明显小于正常角膜内皮细胞,细胞未见明显六边形形态,细胞之间未见明显链接形成。术后25天细胞形态与术后11天基本相似,但细胞形态逐渐趋向于规则。术后43天可见细胞大小与正常角膜内皮细胞相近,部分细胞可见类似六边形形态,细胞之间可见链接形成。术后60天扫描可见细胞形态及大小与术后43天类似,细胞形态维持稳定。术后3天取材行免疫荧光染色可见抗人抗体染色阳性的细胞贴附于角膜后弹力层,部分细胞表达Na+/K+-ATPase及SLC4A11。研究结论1.采用Accutase细胞消化液制备角膜内皮迷你植片,通过前房注射法进行移植能够促进移植细胞快速贴壁,加速移植细胞紧密链接的形成,从而发挥其屏障功能和泵水功能。2.采用小分子RA、Y-27632和细胞因子bFGF分两步将hESC诱导分化为神经嵴细胞,再进一步分化为角膜内皮样细胞,模拟了角膜内皮细胞的体内发育过程;3.hESC来源角膜内皮样细胞移植于角膜内皮功能失代偿新西兰大白兔和食蟹猴动物模型中,能够促进角膜水肿消退和角膜透明度恢复,移植细胞能够在体内长期存活并发挥内皮泵功能。创新和意义1.结合传统角膜内皮移植术和前房细胞注射法的优点,制备迷你植片前房注射移植角膜内皮细胞,促进移植细胞贴壁及发挥功能,改良了角膜内皮细胞移植的手术方式。2.首次采用小分子RA、Y-27632和细胞因子bFGF,模拟角膜内皮细胞的体内发育过程,快速有效地诱导hESC分化为神经嵴细胞和角膜内皮样细胞,为获取组织工程角膜内皮细胞提供了新的方法。3.首次将hESC诱导的角膜内皮样细胞在大动物食蟹猴模型中验证其角膜内皮细胞功能,为临床治疗角膜内皮功能失代偿提供新的方案。
张璐[3]（2019）在《兔角膜基质细胞及脱细胞猪角膜基质构建组织工程角膜移植的研究》文中研究表明[目 的]通过体外培养原代兔CSCs,以APCM为支架材料构建组织工程角膜基质,探讨植入CSCs后的APCM在兔角膜深板层移植中的生长情况,为后期组织角膜工程的研究提供实验基础。[方 法]（1）体外分离培养原代兔CSCs并鉴定;（2）用经慢病毒（LV Lentivirus）转染的EFGP标记兔CSCs,通过倒置荧光显微镜、流式细胞仪确定最佳感染时间及M0I值;（3）以APCM为支架材料,行兔角膜深板层移植,取新西兰大白兔24只,分为3组。实验组:APCM+兔CSCs;对照组A:APCM组;对照组B:兔角膜原位缝合组;（4）各组术后1-4周、8周眼前段照相及荧光素染色;（5）术后1周、1个月、2个月前段OCT测角膜厚度;（6）术后2个月各组取材做冰冻切片免疫荧光及HE染色、GFP免疫组化检测。[结 果]（1）成功分离培养出兔角膜基质细胞;（2）经LV-EGFP转染的兔CSCs倒置荧光显微镜下观察,吸出病毒液24h后即可观察到绿色荧光,随着时间的延长荧光强度逐渐增强,72h为最佳转染时间;流式细胞仪检测在MOI=400时,LV-EGFP对兔CSCs的存活率无影响;（3）动物实验造模后8周中,实验组角膜8点方位新生血管长入角膜约2mm,角膜透明,未见明显瘢痕,荧光素染色示植片中央区域有着色;对照组A角膜2点方位新生血管长入角膜约3mm,植片中央区域荧光素着色;对照组B角膜7点方位新生血管长入角膜约1mm,角膜透明,荧光素染色示角膜点状着色;（4）眼前段OCT实验组角膜基质信号较均匀,植片与植床紧密融合生长;对照组A角膜基质层信号欠均匀,可见移植的APCM与原基质间有明显的界限,融合欠佳;对照组B基质层灰度均匀,可见清晰的的上皮层,基质层和内皮层;（5）术后测各组中央角膜厚度分别为:323μm、166μm、324μm;（6）冰冻切片免疫荧光检测实验组可见绿色荧光,对照组A/B均未见荧光;免疫组化实验组可见GFP表达阳性,对照组A/B均为阴性。[结 论]注射有兔CSCs的APCM,可作为支架材料,体外构建兔组织工程角膜,植片与原角膜植床融合生长良好,结构、功能更接近于兔自体角膜,可为临床研究角膜移植提供良好的原料。
申琳[4]（2018）在《人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究》文中进行了进一步梳理角膜是一层透明无血管的纤维膜,在组织学结构上角膜共分为5层,从外向内依次为:上皮细胞层,前弹力层,基质层,后弹力层和内皮细胞层。角膜内皮细胞为多边形单细胞层,是维持角膜相对脱水状态,保持角膜透明性和维持角膜厚度的重要因素。在人体内角膜内皮细胞难以再生,若被损伤只能依赖残存细胞形态的改变和移行来进行修复。当损伤超过一定限度造成内皮细胞的密度低于约500-800/mm2时,残存的内皮细胞便不能完全代偿损伤,会导致角膜内皮失代偿,表现为角膜水肿或大泡性角膜病变,严重时甚至失明。角膜移植是目前角膜内皮失代偿最常用也是最有效的治疗方法,然而每年我国角膜捐献的材料极为有限,得到有效救助的病人少之又少。若采取体外培养的方法获得更多的角膜内皮细胞,用于单纯内皮移植或组织工程角膜的构建,可为角膜内皮失代偿病人等多种角膜病变提供新的治疗方案。但是人角膜内皮细胞体外培养增殖传代能力相对有限,而且供体角膜材料仍然是不可缺少的一部分。因此,探求新的具有良好功能的角膜内皮细胞来源,成为急需解决的难题。干细胞诱导分化为角膜内皮细胞成为近年来研究的热点,例如利用胚胎干细胞、骨髓来源的内皮祖细胞、人角膜基质干细胞等。虽然多种干细胞可诱导为角膜内皮样细胞,然而这些研究均存在一定问题,如干细胞取材较困难、动物实验免疫排斥严重、缺乏高等动物实验验证等。皮肤是人体最大的器官,需要更新和修复来维持稳定,而皮肤干细胞则是主要的参与者,研究发现皮肤中包括多种多样的的成体干细胞群,例如表皮干细胞,毛囊干细胞,真皮干细胞等。不管在皮肤领域还是在非皮肤领域的应用中,皮肤中的各种干细胞几乎都具有较高的可塑性。Toma等人从人和啮齿动物的真皮中发现皮肤前体细胞（skin derived precursors,SKPs）,在不同诱导条件下这种细胞能向神经元、神经胶质细胞,骨、软骨细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞转化,是具有多向分化潜能的细胞。更重要的是SKPs被证明与胚胎时期的神经嵴细胞相关,且具有神经嵴细胞的特性,这与角膜内皮细胞的胚胎发育来源相一致。另外,皮肤来源广泛、取材方便,细胞提取方法也不复杂。因此,SKPs是角膜内皮细胞理想的种子细胞来源。角膜移植术是角膜内皮失代偿等多种严重角膜病变的主要治疗方法,主要包括穿透性角膜移植术和角膜内皮移植术。在临床上,穿透性角膜移植术（PKP）是一种重要的手术方式,然而并发症居多,而且免疫排斥率较高。角膜内皮移植术经过角膜瓣下后板层角膜移植术（PLK）,深板层角膜内皮移植术（DLEK）,后弹力层撕除角膜内皮移植术（DSEK）和后弹力层撕除自动刀内皮移植术（DSAEK）,角膜后弹力层内皮移植术（DMEK）几个发展阶段,这项技术已取得的飞速发展。近年来,有学者将体外培养的内皮细胞结合促进角膜贴附性的ROCK抑制剂用注射针注射到受体前房进行内皮移植,动物实验取得了成功,与DSAEK相比效果更好,应用于临床试验也取得令人满意的效果。前房注射法方法简单、易于操作,保留了自身正常的角膜上皮和基质结构,手术创伤小,并发症相对较少,恢复效果好,免疫排斥率也较低,经过研究者的不断努力,将来或可成为临床上治疗角膜内皮功能失代偿的新的手术方法。组织工程角膜（Tissue-engineered cornea,TEC）是在体外模拟天然角膜的组成结构构建出的具有良好的生物学活性的角膜供体替代品,主要由支架与种子细胞构成。支架材料主要分合成材料和天然材料两种,是构建组织工程角膜的重要组成部分。合成材料主要是以有机成分做为原材料的合成物,如胶原、丝蛋白等。天然材料主要是脱细胞的生物组织,是目前组织工程角膜主要的材料来源。脱细胞人角膜基质是TEC最理想的材料,然而由于仍需要捐献的角膜供体,其制备收到限制。近几年来脱细胞猪角膜基质（Acellular porcine cornea matrix,APCM）成为研究的热点,经过学者们不断的研究探索,发现APCM具有良好的组织相容性,且免疫原性较低、生物力学特性与人角膜相似,将其作为组织工程角膜的支架材料最为理想。在APCM的应用上,它可支持多种细胞的生长,可用于构建组织工程角膜前板层、后板层、全层等,动物实验也取得不错的效果,在中国已有用于板层角膜移植的成熟产品。因此,将干细胞诱导获得的角膜细胞与支架材料相结合,构建的出不依赖于供体角膜材料的组织工程角膜应用于角膜移植,可充分缓解角膜材料匮乏的压力,为角膜内皮失代偿和其他多种角膜病变的治疗提供不同的选择方案。因此,本研究中我们首先提取了皮肤来源的前体细胞（SKPs）,在体外对其诱导分化并筛选最佳的诱导方案,成功将SKPs分化为角膜内皮样细胞（CEC-like cells）,体外检测证明其具备正常角膜内皮细胞的形态与表面标志;通过初步探索诱导分化的机制,证实SKPs可能通过Wnt通路分化为角膜内皮样细胞。其次,为验证角膜内皮样细胞在体内的功能,我们将诱导的细胞用前房注射的方法治疗兔角膜内皮失代偿模型,取得了良好的效果;我们进一步进行了恒河猴的移植实验,长期观察发现角膜内皮样细胞功能极佳,与正常内皮细胞相似,能够使角膜恢复透明并能长期保持稳定。最后,我们又探索了以脱细胞猪角膜为支架,以诱导的角膜内皮样细胞为种子细胞构建组织工程角膜植片并用于动物实验的可行性;结果显示角膜内皮样细胞在脱细胞猪角膜基质上生长良好,经过动物穿透性角膜移植后,构建的植片可在短期发挥一定的内皮泵功能。总之,丰富的细胞来源、全新的诱导方法、良好的动物移植实验效果,为角膜内皮失代偿和其他多种角膜病变的治疗提供了新的不同的选择方案,为未来应用于临床展示了美好的前景,为再生医学再填枝叶。[目的]将提取的SKPs作为种子细胞体外诱导其分化为角膜内皮样细胞,寻求获得角膜内皮细胞来源的新方法。初步探索SKPs细胞分化为角膜内皮样细胞的分子机制。[方法]1.皮肤来源前体细胞SKPs的培养:收集重睑术后剩余的皮肤组织,将表皮真皮分离得到真皮,胶原酶消化后细胞筛网过滤,将细胞按一定密度接种在培养瓶中,用SKPs培养液培养。2.人角膜内皮细胞系B4G12细胞的培养及条件培养基的提取:从液氮中取出B4G12细胞复苏,无血清培养基常规培养,胰酶常规消化传代。细胞生长到70%-90%融合时,每12小时收集培养基,滤器过滤除菌,保存在-80℃冰箱备用。3.角膜内皮样细胞的诱导:层粘连蛋白、硫酸软骨素按一定比例包被培养板。将SKPs胰酶消化后枪头吹打成单个细胞,按1×105、5×105、1×106密度接种在包被好的培养板中。（1）条件培养基法:将B4G12细胞条件培养基加入接种好SKPs细胞的培养板中,隔日换液,每天观察细胞形态变化。（2）共培养法:将B4G12与SKPs细胞用transwell小室非接触式共培养,隔日换液,每天观察细胞形态变化。筛选最佳诱导方案。4.角膜内皮样细胞的鉴定:RT-PCR检测角膜内皮样细胞较SKPs在Na+/K+ATPase、ZO-1、N-cadherin、CA2、Co14a2、Col8a2、Pitx2、FoxC1的表达变化;免疫荧光及Western blotting检测标记物Na+/K+ATPase、ZO-1表达。将诱导的角膜内皮样细胞传代,RT-PCR、免疫荧光及Western blotting评估各标记物的表达。5.SKPs细胞分化为角膜内皮样细胞的分子机制研究:Western blot法检测角膜内皮样细胞与SKPs细胞t-LRP6、p-LRP6、β-Catenin、Gapdh的表达情况。[结果]1.经过筛选可得,以5×105密度接种SKPs用transwell小室与B4G12细胞共培养的方法得到的角膜内皮样细胞在形态和标记物的表达上最佳。诱导4天开始出现多边形细胞,8天时大部分转变成多边形细胞,呈单层镶嵌样排列,为角膜内皮样细胞,与人内皮细胞形态相似,且能稳定传3代。2.RT-PCR示诱导的细胞较SKPs在多种角膜内皮相关标记物如Na+/K+ ATPase、ZO-1、N-cadherin、CA2、Col4a2、Col8a2表达上随时间变化均有不同程度的增高,在分化相关转录因子Pitx2、FoxC1表达上也不同程度的改变;免疫荧光示诱导的细胞表达Na+/K+ATPase、ZO-1标记物;Western blotting示诱导的细胞Na+/K+ ATPase、ZO-1较SKPs细胞表达量增高。角膜内皮样细胞传代后仍能保持其形态及各标记物的表达。3.Western blot 显示角膜内皮样细胞较 SKPs 细胞在 β-Catenin、t-LRP6、p-LRP6表达上明显增高,说明经过诱导后细胞通过上调LRP6受体和其磷酸化水平激活下游分子,即通过Wnt通路的经典途径诱导分化为角膜内皮样细胞。[结论]SKPs经过与B4G12细胞共培养可诱导分化为角膜内皮样细胞,为角膜内皮细胞提供了新的丰富的来源。SKPs可能通过Wnt通路诱导分化为角膜内皮样细胞。[目的]利用诱导来的角膜内皮样细胞进行角膜内皮失代偿动物模型的角膜内皮移植实验,检测角膜内皮样细胞的体内功能,评估角膜内皮样细胞用于治疗角膜内皮细胞失代偿的可行性。[方法]1.兔角膜内皮失代偿动物模型制作:选取新西兰大白兔,右眼为术眼,利用我们自己制作的装置机械法刮除新西兰大白兔的角膜内皮细胞。HE染色和茜素红染色验证后弹力层的完整性和是否有内皮残留。2.兔角膜内皮移植:将角膜内皮样细胞用Dil标记,调整到一定密度混入100μl培养基中。抽取术眼100μl房水后,实验组将角膜内皮样细胞注射入兔前房,对照组只注射培养基,定期进行裂隙灯、眼压、眼前节OCT、激光共聚焦显微镜等检查。处死动物取角膜行茜素红染色、组织免疫荧光、HE染色等检测。3.恒河猴角膜内皮失代偿动物模型制作:右眼为术眼,机械法刮除角膜内皮细胞。4.恒河猴角膜内皮移植:将角膜内皮样细胞用Dil标记,调整到一定密度混入50μl培养基中,抽取术眼50μl房水后,实验组将角膜内皮样细胞注射入猴前房,对照组只注射培养基,定期进行裂隙灯、眼压、眼前节OCT、角膜内皮镜、B超、房角镜、眼底照相等眼科检查,处死动物取角膜行组织免疫荧光、HE染色等检测。[结果]1.兔角膜内皮移植术后,实验组角膜混浊程度逐渐减轻,可见瞳孔及虹膜纹理,角膜由厚变薄,术后7天角膜几乎完全恢复透明,共聚焦显微镜检查示角膜内皮呈紧密连接多边形,细胞数接近正常;对照组角膜混浊严重,厚度增加,窥不见内皮层。两组眼压均未见明显异常。取角膜行茜素红染色,结果示实验组角膜后弹力层上单层紧密排列的多边形角膜内皮样细胞,对照组后弹力层几乎无细胞。免疫荧光示,实验组角膜内皮面可见Dil红色荧光细胞,表达Na+/K+ATPase,对照组后弹力层裸露。HE染色,实验组角膜厚度基本恢复正常,后表面单层细胞覆盖,对照组角膜水肿增厚,后弹力层几乎无细胞结构。2.猴角膜内皮移植术后,实验组角膜混浊程度逐渐减轻,角膜由厚变薄,术后1个月角膜几乎完全透明,角膜厚度恢复正常;角膜内皮镜检测示角膜内皮样细胞呈多边形,单层紧密贴附在后弹力层上,内皮计数接近正常;前房出现少量渗出和角膜后沉积物,炎症反应较轻且逐渐消失。持续观察1年猴角膜继续保持透明,角膜厚度无明显变化,角膜内皮细胞计数略微减少,未见明显的角膜新生血管,眼压、B超、房角镜、眼底检查均正常。对照组角膜混浊逐渐加重,窥不见内皮层,1月时变成乳白色,随着观察时间延长角膜继续保持混浊。取实验组角膜进行免疫荧光检测示角膜内皮层可见Dil红色荧光,表达Na+/K+ATPase;HE染色示角膜后表面单层细胞覆盖,内皮细胞贴附良好,其他结构未见明显异常。[结论]皮肤来源的角膜内皮样细胞在体内具有与人角膜内皮细胞相似的功能,不仅能在兔角膜内皮移植上取得良好的效果,还能使猴角膜内皮失代偿模型恢复正常并能保持长期稳定,为角膜内皮细胞失代偿的治疗提供了新的选择方案。[目的]探索以诱导来的角膜内皮样细胞为种子细胞,以脱细胞猪角膜为支架构建组织工程角膜植片的可行性,初步评估其进行动物移植的效果。[方法]1.脱细胞猪角膜基质（APCM）及脱细胞猪角膜支架（APCM scaffold,AS）的制作:环钻钻取全层猪角膜,用氯化钠、DNA/RNA酶、PBS进行处理,去除猪角膜的细胞成分制成脱细胞猪角膜基质APCM,切割猪角膜基质前板层至厚度400μm左右,作为脱细胞猪角膜支架AS,置于-20℃保存备用。行HE及DAPI染色进行组织学检测。2.组织工程角膜植片（Tissue-engineered cornea,TEC）的构建:将角膜内皮样细胞一定密度接种在AS上构建组织工程角膜植片TEC,行HE及DAPI染色进行组织学检测,行茜素红染色进行细胞计数。3.兔穿透性角膜移植术:实验组移植组织工程角膜植片TEC,对照组移植脱细胞猪角膜支架AS。术后进行裂隙灯照相、眼压检查,处死后取角膜行免疫荧光染色检测。[结果]1.脱细胞猪角膜基质APCM无细胞残留,胶原排列规则无明显断裂,前弹力层完整;构建的组织工程角膜内皮植片TEC基质面可见贴附良好的CEC-like cells,茜素红染色可见细胞呈单层多边形镶嵌分布,细胞计数与正常兔角膜内皮计数相似。2.兔穿透性角膜移植术后,实验组3周之内角膜逐渐透明,角膜逐渐变薄;对照组角膜逐渐混浊,角膜逐渐增厚水肿。两组术后角膜上皮均逐渐修复,3周后上皮完全覆盖,荧光素染色阴性。观察期间两组术后眼压均未见明显异常,均未见明显的角膜新生血管。取角膜行免疫荧光示,实验组植片基质面覆盖有单层细胞,抗人核抗体和Na+/K+ATPase抗体免疫荧光染色阳性,对照组植片基质面无内皮细胞。[结论]角膜内皮样细胞在脱细胞猪角膜基质上生长良好,可用于构建组织工程角膜植片,进行动物移植实验后组织工程角膜植片可发挥一定的内皮泵功能。
姜晓蕾,杨朝忠,韩宝芹,刘万顺[5]（2017）在《壳聚糖及其衍生物作为组织工程角膜支架的研究进展》文中研究说明利用组织工程技术构建组织工程角膜能够从根本上解决角膜移植供体不足和术后免疫排斥等问题。理想的支架材料是构建组织工程角膜的重要条件。壳聚糖及其衍生物具有良好的透明性、生物相容性、可降解性、力学性能和可塑性,在角膜组织工程中具有良好的应用前景。本文对壳聚糖及其衍生物在角膜组织工程中的研究现状进行了综述,讨论了目前存在的问题,为构建满足临床要求的组织工程角膜提供指导。
张灿伟[6]（2017）在《胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样细胞及角膜内皮样细胞构建组织工程全厚角膜的研究》文中研究说明角膜疾病占全世界致盲性眼病的第二位,全世界超过1000万人因为角膜疾病而致盲。目前,对于角膜盲患者来说,角膜移植仍然是唯一确切有效的治疗方法。但是因为目前捐献的角膜材料严重缺乏,而使很多因角膜疾病而致盲的患者很难获得及时而且有效的治疗。因角膜供体缺乏,我国每年实施手术的病人还不到4000例,而每年需行角膜移植的患者却达到约30万。在这种情况下,人造角膜替代品成为了当前研究的热点。人工角膜（Keratoprosthesis）虽然已被批准应用于临床,但因生物相容性差、术后并发症多,难以在临床上推广。组织工程角膜（Tissue-engineered cornea,TECs）角膜是将体外培养的角膜细胞接种于可降解的生物支架材料上构建的与天然角膜具有相似的功能和结构的角膜替代物。因为其生物相容性具良好的,而受到了广泛的关注。角膜组织工程在近几十年来研究取得了较大进展。脱细胞猪角膜基质（Acellular porcine cornea matrix,APCM）及重组的人胶原在临床或实验动物前板层角膜移植中取得良好效果。但对于多种角膜疾病来说,如圆锥角膜、角膜穿孔等,穿透性角膜移植仍是广泛应用的手术方式。由于传统观念的影响,在我国角膜捐献率较低,而角膜屈光手术的开展使适于穿透性移植的角膜供体进一步减少。构建组织工程全厚角膜植片是解决当前穿透性角膜移植供体不足问题的可行的方法。此外,角膜所包含的细胞类型相对较少,主要有内皮细胞、上皮细胞和角膜基质细胞。相对于其他器官来说,构建TECs角膜更简单、易行。TECs的两个关键成分是种子细胞以及其支架材料。脱细胞猪角膜基质（Acellular porcine cornea matrix,APCM）具有正常角膜的关键特性,如良好的透明性和生物相容性、与天然角膜相似的力学特性、低免疫原性、可耐受手术缝合等。对于TECs的构建来说,其是一种良好的支架材料。此外,猪角膜来源非常广泛。所以,在本研究中我们拟选用已经脱除了细胞的猪角膜基质(脱细胞猪角膜基质（Porcine cornea matrix,PCM）作为组织工程全厚角膜的支架。以往文献报道APCM在基质囊袋植入术后可维持一年不降解,且角膜基质细胞在移植术后3周可迁入其内。鉴于此,角膜基质细胞在组织工程全厚角膜构建中未接种。但猪角膜的厚度大于人角膜,经脱细胞程序后,其厚度进一步增加,而植片与植床厚度不匹配可影响角膜移植术后切口的愈合。因此,在以脱细胞猪角膜为支架的组织工程全厚角膜的构建中,如何制备与天然角膜厚度相似的脱细胞猪角膜片层是首先需要解决的问题。种子细胞作为构建TECs中的又一关键成分,需要具备来源广泛、可在体外大量扩增等特点。但原代培养的人角膜上皮和内皮细胞增殖能力有限,而经基因转染的角膜细胞系具有潜在的致瘤性,限制了其临床应用。胚胎干细胞（Human embryonic stem cells,hESCs）因具有强大的增殖能力和分化全能性,可向机体三个胚层的细胞分化,近年来成为组织工程中种子细胞的一个重要的来源。在我们前期研究中已建立了人胚胎干细胞在体外向角膜缘上皮样细胞和角膜内皮样细胞的诱导分化的方法。诱导的角膜缘上皮样细胞和角膜内皮样细胞与原代培养的细胞具有相似的形态和功能,可作为TECs的种子细胞的来源。角膜的上皮细胞和内皮细胞分别位于角膜前后两面。因此,为了模拟正常角膜结构,建立一个可于支架前后两面同时培养细胞的三维培养方案也是函待解决的问题。综上所述,在本研究中,我们首先开发了一个可制备与天然角膜厚度相似的APCM支架的切割工具。其次,建立了可用于APCM前后两面同时培养细胞的三维培养方案。并通过该培养方案将胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样（Limbal epithelial cell-like,LEC-like）细胞和角膜内皮样（Corneal endothelial cell-like）细胞作为种子细胞接种于APCM支架尝试构建组织工程全厚角膜,探讨该培养方案用于构建组织工程全厚角膜的可行性。本研究发现制备的脱细胞猪角膜支架与天然角膜具有相似的厚度和生物力学特性。以其为支架,通过我们建立的三维培养方案构建的组织工程全厚角膜与天然角膜相似,可形成复层的上皮和单层的内皮,且分别表达角膜上皮和角膜内皮细胞标记物。TECs内皮细胞的密度和生物力学特性也与天然角膜相似,并在体内表现出一定的功能。但是该植片的透明度与天然角膜相比仍存在一定的差距,还需要在以后的研究中进一步改进。第一部分APCM支架的制备[目的]探讨使用我们自行设计的APCM切割工具制备的APCM片层是否可用作组织工程全厚角膜的支架。[方法]1.猪角膜脱细胞程序:首先新鲜的猪眼球放置于超净工作台中,使用含1%青霉素与1%链霉素的高温灭菌的PBS充分洗涤。使用角膜穿刺刀和角膜剪取下角膜,中央11mm的角膜使用环钻钻下,然后使用1.5mol/L的无菌氯化钠溶液及5U/ml的DNA/RNA酶处理,脱除猪角膜的细胞成分。2.脱细胞猪角膜片层的切割:将脱完细胞的猪角膜置于我们自行设计的切割工具内,通过加压排出脱细胞猪角膜内的水分,将切割工具的刻度调整至400μm,使用薄刀片沿右侧加压块切割猪角膜基质前板层（如第一部分图2所示）,作为组织工程角膜的支架,-20℃无菌保存备用。3.APCM支架的生物学特性检测:HE及DAPI染色检测APCM支架中细胞脱除情况。免疫荧光法检测角膜上皮的基底膜成分collagen Ⅳ和laminin的表达,评价经脱细胞处理的支架的上皮基底膜是否完整。测量样品含水量,使用千分尺测量支架的厚度,分光光度计测量支架的透明度,Instron电子拉伸机测量支架的生物力学强度。[结果]HE和DAPI染色显示APCM支架内未见明显的细胞以及细胞核内物质残留,支架内胶原保存完好,无明显断裂。免疫荧光染色可在APCM支架前表面检测到连续的collagen Ⅳ和laminin表达。APCM支架的厚度和生物力学强度与正常兔角膜相似,含水量略高于正常兔角膜,但透光度略低于正常兔角膜,而经甘油脱水后其透光度增加,甚至略高于正常兔角膜。[结论]高渗盐联合DNA/RNA酶可有效去除猪角膜内的细胞成分,并保留了上皮细胞基底膜。切割后的APCM支架与正常兔角膜厚度和生物力学强度相似,可以用作组织工程全厚角膜构建的支架材料。第二部分hESCs体外分化为LEC-like和CEC-like细胞的实验研究[目的]体外诱导hESCs分化为LEC-like细胞和CEC-like细胞,并分选纯化ABCG2阳性的LEC-like细胞和N-cadherin阳性的CEC-like细胞。[方法]1.hESCs的培养和表型检测:将hESCs H1细胞株培养于Matrigel包被的培养板中,使用mmTeSRl培养基进行培养,每5天传代。免疫荧光法检测hESCs标记物OCT4及SSEA-3的表达。2.人角膜缘上皮细胞和基质成纤维细胞的培养和鉴定:（1）角膜缘上皮细胞（Limbal epithelial cells,LECs）培养:角膜移植术后剩余的角膜环经含1%青霉素-链霉素的PBS充分冲洗后,显微镜下剥除后弹力层,然后置于2.4U/ml的dispase Ⅱ中消化1.5小时,0.25%胰酶-0.02%EDTA消化10分钟,将消化下来的LECs置于2%去生长因子Matrigel包被的培养皿培养。荧光免疫法检测LEC细胞的标记物ABCG2、p63及CK3的表达;（2）角膜基质成纤维细胞（Corneal stromal fibroblasts,CSFs）培养:残余的组织块使用剪刀修剪成约1mm3大小,置于0.02%的胶原酶A中继续消化2小时,离心后接种于培养皿,使用含胎牛血清（FBS）的培养基培养。荧光免疫法检测CSF细胞标记物vimentin和α-SMA的表达。3.条件培养基的收集与配制:（1）LEC细胞条件培养基的配制:根据我们以前研究结果,将收集的LEC细胞培养基与其原培养基以3:1比例混合作为LEC细胞条件培养基;（2）角膜内皮细胞分化培养基的制备:根据我们以前研究结果,晶状体上皮细胞系生长到700%-90%融合时,每12小时收集培养基,与CSF细胞培养基以3:1比例混合作为CEC-like细胞分化培养基。两种条件培养基均经0.22μm滤器过滤除菌后,保存在-80℃冰箱备用。4.体外诱导hESCs分化为LEC-like细胞和CEC-like细胞:（1）hESCs经2mg/ml的dispase酶消化后置于低粘附培养皿中,使用拟胚体（Embryoid bodies,EBs）培养基培养形成EBs。（2）按照我们以往报道的方法诱导hESCs分化为LEC-like和CEC-like细胞。LEC-like细胞的诱导:Ⅳ型胶原包被培养板,24孔板每孔中接种10-15个EBs,使用角膜缘上皮细胞条件培养基培养9天,诱导其分化为LEC-like细胞。CEC-like细胞的诱导:纤连蛋白、层黏连蛋白以及硫酸软骨素包被液包被的六孔细胞培养板,每孔接种80个EBs,通过Transwell与CSF细胞共培养5天,随后去除CSF细胞,使用CEC-like细胞分化培养基继续培养2周,诱导其分化为CEC-like细胞。5.LEC-like细胞和CEC-like细胞的表型鉴定和纯化:（1）LEC-like细胞表型的鉴定和纯化:荧光免疫法检测ABCG2、p63和CK3的表达,流式细胞术分选ABCG2阳性的细胞,作为LEC-like细胞;（2）CEC-like细胞表型鉴定和纯化:免疫荧光法检测N-cadherin、ZO-1和Na+/K+ATP酶的表达,流式细胞术分选N-cadherin阳性的细胞作为CEC-like细胞。[结果]诱导的LEC-like细胞呈铺路石样,高表达ABCG2,p63和CK3,与原代培养的LEC细胞相似。诱导的CEC-like细胞呈多边形,在EBs周围形成内皮细胞单层,CEC细胞标记物N-cadherin、ZO-1和Na+/K+ATP酶荧光免疫染色呈阳性。流式细胞术分析显示诱导的LEC-like细胞中ABCG2阳性的细胞约为34.94%,诱导的CEC-like细胞中N-cadherin阳性的细胞约10.91%。流式细胞术分选的LEC-like 细胞共表达 ABCG2 和 p63,分选的 CEC-like 共表达 N-cadherin、ZO-1和 Na+/K+ ATP 酶。[结论]我们诱导的LEC-like细胞和CEC-like细胞分别与原代培养的角膜缘上皮细胞和角膜内皮细胞表现出相似的形态和标记物表达。通过细胞分选可获取纯度较高的LEC-like细胞和CEC-like细胞。第三部分组织工程全厚角膜的构建和体内功能的检测[目的]探讨使用我们建立的三维培养方案构建组织工程全厚角膜的可行性,并进一步检测构建的组织工程角膜的生物学特性和体内功能,评估其用于穿透性角膜移植（Penetrating keratoplasty,PKP）的可行性。[方法]1.CEC-like细胞和LEC-like细胞的接种:将APCM支架置于我们开发的培养系统的中空插件内（如第三部分图1所示）,基质面朝上,将CEC-like细胞按3000/mm2接种于基质面,培养两周。随后反转构建物,使其前弹力层面朝上,然后按照1.5×1 04/mm2的密度接种LEC-like细胞。培养基没过构建物培养1周,随后改为气液界面法继续培养1周,促进上皮形成复层。2.组织工程角膜形态及生物学特性检测:H&E染色观察组织工程角膜的组织形态。荧光免疫法检测组织工程角膜上皮及内皮标记物的表达。台盼蓝-茜素红染色,随后于显微镜下计数内皮细胞密度。使用千分尺测量组织工程角膜的厚度,分光光度计测量其的透光度,Instron电子拉伸机测量其生物力学强度。3.穿透性角膜移植:实验组以组织工程全厚角膜作为植片进行PKP手术。对照组:以APCM支架为植片,其余操作与实验组相同。术后行裂隙灯检查、眼压测量以及眼前节OCT检查,观察组织工程角膜植片透明度和厚度变化、角膜新生血管生长及术后免疫排斥反应。术后8周行共聚焦激光角膜显微镜检查观察内皮情况。4.组织学观察:术后1、2、4和8周分别摘除1只家兔角膜,H&E染色观察术后组织工程角膜和APCM支架上皮和内皮的变化、基质细胞长入和浸润的炎细胞。抗人核抗体追踪TECs内人角膜细胞在移植术后的变化。免疫荧光法检测移植术后TECs上皮及内皮标记物的表达。[结果]1.组织工程全厚角膜生物学特征的体外检测:HE染色可见构建物形成3-4层上皮和单层的内皮。免疫荧光染色显示:在构建物上皮层中,角膜上皮细胞标记物CK3呈阳性,部分基底部细胞中角膜缘干细胞标记物ABCG2呈阳性,但未检测到p63的表达。构建物内皮中CEC细胞标记物Na+/K+ATP酶、N-cadherin和ZO-1。组织工程角膜与正常兔角膜具有相似的内皮细胞密度、厚度和生物力学强度,但透光度略低于正常兔角膜。2.组织工程全厚角膜体内功能的检测:穿透性角膜移植术后实验组和对照组角膜植片厚度均增加,术后1周后,实验组植片开始变薄,透明度逐渐增加;对照组植片厚度逐渐增加,透明度随时间延长逐渐下降。2-4周时两组中家兔的植片中开始出现新生血管,但在对照组中,新生血管生长更快,至术后8周时新生血管已经长满植片,植片厚度平均为780μm,呈瓷白色,不透明。实验组至术后8周时新生血管长入植片边缘,厚度平均为460μm,透过植片可见虹膜。HE染色示:实验组植片各时间点均可见上皮和内皮细胞覆盖,对照组至术后4周时可见上皮细胞覆盖,但观察期内植片后表面未见内皮细胞。术后2周时两组植片中均可见炎细胞浸润,但在观察期内未见炎细胞明显增加。抗人核抗体染色显示:实验组在4周内可检测到抗人核抗体阳性的上皮细胞。术后8周时在植片上皮中未检测到抗人核抗体阳性的细胞,但在内皮还可以检测到抗人核抗体阳性的细胞,而对照组中没有检测到抗人核抗体阳性的细胞。免疫荧光染色显示:术后4周时,移植的组织工程角膜上皮中可检测到抗人CK3抗体染色阳性的细胞,但未检测到人ABCG2和p63的表达。术后8周时抗人CK3阳性的细胞消失,但在植片内皮面仍可检测到表达人角膜内皮细胞标记物的细胞。[结论]我们建立的三维培养方案可用于组织工程全厚角膜的构建,构建的角膜与天然角膜具有相似的内皮细胞密度、厚度和生物力学强度。在体内,组织工程全厚角膜也表现出一定的天然角膜的生物学功能,且免疫排斥反应并不重,但其透明度仍低于天然角膜。如何提高构建的组织工程全厚角膜在体内的透明度还需要在以后的实验中再进一步研究。
袁晓龙[7]（2015）在《利用鱼类胶原蛋白支架体外构建组织工程全层人角膜的研究》文中认为角膜是位于眼球最前壁的一层透明膜,具有一定的曲率半径,在维持视功能和保护眼球方面发挥了不可替代的重要功能。人角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层构成,其中,厚度约50μm的上皮层由6-8层人角膜上皮细胞（HCEP细胞）构成,厚度约500μm的基质层由人角膜基质细胞（HCS细胞）和主要由胶原蛋白组成的高度有序的细胞外基质构成,厚度约5μm的内皮层由单层人角膜内皮细胞（HCE细胞）组成。角膜因位于眼表最前端,直接与外界接触,故极易受到损伤和感染,一旦发生病变将会引起角膜混浊、视力下降甚至致盲。目前,临床上治疗角膜病盲的唯一有效手段是角膜移植。但遗憾的是,由于捐献角膜数量的严重不足及捐献角膜老化,致使绝大数角膜病盲患者无法通过角膜移植重见光明。近年来角膜组织工程技术的快速发展,使组织工程角膜的体外构建成为可能,而组织工程角膜作为捐献角膜的等效替代物,则是目前从根本上解决捐献角膜高度匮乏问题、使众多角膜病盲患者恢复视功能的唯一希望。如何获得足量正常的种子细胞和生物相容性理想的载体支架一直是制约组织工程角膜规模化体外构建的两大因素,已成为角膜组织工程领域的研究热点和难点。在种子细胞方面,目前的研究主要集中在干细胞、转染组织细胞系和原代组织细胞的体外培养上,但由于体外培养条件、伦理或潜在致瘤性等多种限制,目前仍无法满足组织工程角膜规模化构建对种子细胞的需求。近年来,本实验室成功建立了非转染无致瘤性的HCE、HCS和HCEP的三种组织细胞系,并以其为种子细胞先后进行了组织工程人角膜内皮、基质和上皮的体外构建研究,达到了较为理想的动物移植效果,使利用非转染人角膜组织细胞系规模化构建组织工程角膜成为可能。在载体支架方面,目前的研究主要集中在天然生物材料、人工合成高分子材料和生物大分子复合材料方面。鉴于天然生物材料或多或少地受到其病原体携带风险和来源的限制、人工合成高分子材料还存在有生物相容性不理想等缺陷,学者们便逐渐将研究重点转移到生物大分子复合材料的研发方面。在生物大分子复合材料的研究中,胶原蛋白由于具有来源广泛、在进化上高度保守、免疫原性低且生物相容性理想等诸多优势,已被广泛用于各种载体支架材料的制备研究,且利用人胶原蛋白复合支架成功构建出了组织工程角膜,但遗憾的是,所制备出的胶原蛋白复合支架仍然存在有力学性能欠佳、体内降解速度过快和制备成本较高等缺陷。近年来,高效无毒交联剂及其交联技术的快速发展以及非酶解/完整分子鱼类胶原蛋白制备技术的建立,为利用鱼类胶原蛋白制备组织工程角膜载体支架创造了条件。本文在前期研究工作的基础上,首次利用本实验室自主分离纯化的非酶解/完整分子鱼类胶原蛋白启动了鱼类胶原蛋白支架的制备研究,进而以其为载体支架、以非转染无致瘤性的三种组织细胞系作为种子细胞进行了组织工程全层人角膜（TE-flHC）的体外构建研究,旨在建立鱼类胶原蛋白支架的制备与TE-flHC体外构建的技术工艺,获得形态结构、属性和功能蛋白表达正常的TE-flHC。为了利用鱼类胶原蛋白制备出生物相容性理想的载体支架,本文采用本实验室业已纯化的孔鳐鱼皮胶原蛋白,选用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）交联剂和自制模具,进行了鱼类胶原蛋白支架的制备和鉴定。鱼类胶原蛋白的鉴定结果显示,所纯化的孔鳐鱼皮胶原蛋白纯度高,在SDS-PAGE电泳中无杂带,存在形式分别为单股α链、双股α链和三股α链,单α链的分子量约为120 kDa, Gly含量约占总氨基酸含量的32.34%,符合胶原蛋白的分子量和氨基酸组成的基本特征,为未被降解的胶原蛋白完整分子,可用于鱼类胶原蛋白复合支架的制备。在对所纯化胶原蛋白进行鉴定之后,本文以所得鱼胶原蛋白为原料,采用自制装置并通过EDC/NHS交联改性制备出了鱼类胶原蛋白支架。含水量测定结果显示,60mg/mL、80 mg/mL和100mg/mL胶原蛋白支架的含水量分别为90.53%±0.06%、89.88%±0.03%和86.34.%±0.11%；透明度与透光率结果显示,上述三种胶原蛋白支架均具有良好的透明度,其透光率分别为91.15±2.36%、89.77±2.30%和86.09±2.31%；力学性能检测结果发现,增加胶原蛋白支架的抗拉强度和断裂伸长率随胶原蛋白的浓度升高而提高。冰冻切片HE染色和扫描电镜结果表明,100 mg/mL胶原蛋白支架相对于60 mg/mL和80 mg/mL胶原蛋白支架,其组织结构较为致密,胶原纤维连续,孔径大小均匀,内部结构最佳。以上结果说明,所制备的鱼类胶原蛋白支架具有良好的光学性能、力学性能和组织结构,可望用作TE-flHC体外构建的载体支架。为了获得足量的人角膜种子细胞,本文首先对业已建立的三种非转染人角膜组织细胞系进行了扩增培养和鉴定。形态观察和生长曲线的鉴定结果显示,HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞仍分别保持有上皮样、成纤维样和多角形内皮样的形态特征,其群体倍增时间分别为38.5h、37.6 h和36.2 h；染色体鉴定结果显示,这三种细胞的特征染色体数目均为2n=46条；免疫细胞化学检测结果发现,HCEP细胞仍保持有其标志蛋白——角蛋白3/12以及功能蛋白——紧密连接蛋白（ZO-1）,整联蛋白131、间隙连接蛋白-43、钠钾泵和乙醛脱氢酶的阳性表达；HCS细胞仍保持有其标志蛋白——波形蛋白以及功能蛋白——整联蛋白p1、间隙连接蛋白-43、钠钾泵和乙醛脱氢酶（ALDH）的阳性表达；HCS细胞仍保持有标志蛋白——血管内皮生长因子受体蛋白（FLK-1）以及功能蛋白——整联蛋白β5,紧密连接蛋白（ZO-1）,间隙连接蛋白-43和钠钾泵的阳性表达。这些结果表明,体外扩增培养的三种人角膜组织细胞在形态、增殖能力、染色体特征以及功能蛋白表达方面仍然具有典型的原有属性和发挥形成细胞连接和穿膜运输的潜能,可作为种子细胞用于TE-flHC的体外构建。为了验证所制备的鱼类胶原蛋白支架的生物相容性,本文在获得足量的人角膜种子细胞后,利用MTT法、RT-PCR和免疫组织化学等方法检测了支架对三种人角膜组织细胞的细胞活力、细胞的生长与增殖调控基因表达以及功能蛋白表达的影响作用。MTT实验结果发现,鱼类胶原蛋白支架浸提液对体外培养的HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞的细胞活力没有显着影响（P>0.05）。RT-PCR结果表明,支架对三种种子细胞生长和增殖基因的表达水平也没有显着影响（P>0.05）。免疫组织化学检测结果显示,HCEP细胞在接种于支架表面后仍能保持其标志蛋白——角蛋白3/12、细胞连接形成蛋白——整联蛋白p1、ZO-1和间隙连接蛋白-43以及功能蛋白——钠钾泵和ALDH的阳性表达；HCS细胞在接种于支架表面后仍能保持其标志蛋白——波形蛋白、细胞连接形成蛋白——整联蛋白β1和间隙连接蛋白-43、以及功能蛋白——钠钾泵和ALDH的阳性表达；HCE细胞在接种于支架表面后仍能保持其标志蛋白——FLK-1、细胞连接形成蛋白——整联蛋白β5、ZO-1和间隙连接蛋白-43、以及功能蛋白——钠钾泵的阳性表达。这些结果表明,所制备的鱼类胶原蛋白支架对三种人角膜组织细胞不仅没有毒性,而且对其生长增殖调控基因、标志蛋白及功能蛋白的表达没有任何影响作用,与三种人角膜组织细胞具有理想的生物相容性,可以作为载体支架用于TE-flHC的体外构建。在获得足量正常的三种人角膜组织细胞和生物相容性理想的鱼类胶原蛋白支架后,本文以三种人角膜组织细胞为种子细胞、以鱼类胶原蛋白支架为载体支架,进行了TE-flHC的体外构建和鉴定研究。我们在优化种子细胞的接种天数后,分别将HCS细胞、HCE细胞和HCEP细胞接种于鱼类胶原蛋白支架,通过浸没培养或液气-液界面培养数天后成功构建TE-flHC,并通过外观观察、透明度检测、冰冻切片HE染色、荧光标记物检测、茜素红染色、透射电镜、扫描电镜和免疫组织化学检测对其透光性能、组织结构及种子细胞的蛋白表达等方面进行鉴定。透光性能检测结果表明,构建的TE-flHC具有良好的透光率与透明度,具有类似正常角膜的高透光性能。荧光标记物检测与HE染色结果表明,三种人角膜细胞分界明显,HCEP细胞在支架表面形成5至8层复层上皮结构；HCS细胞均匀分布于支架内部；HCE细胞形成完整的细胞单层结构。茜素红染色结果表明,细胞密度为2750±260个/mm2,相当于30岁成年人的角膜内皮细胞数。超微结构观察结果表明,HCEP细胞具有丰富的微绒毛结构,角膜上皮细胞与鱼类胶原蛋白支架的连接处存在致密的基底膜,并且细胞-细胞、细胞-支架之间结合紧密；HCS细胞呈纤维样,形态伸展,与鱼类胶原蛋白支架连接紧密；HCE细胞平整连续,形成了由完整的单层结构,与正常角膜内皮层相似。以上结果说明构建的TE-flHC具有类似于正常角膜的解剖结构。免疫组织化学检测结果显示,三种人角膜组织细胞均能维持其原有属性,并且形成了紧密连接、锚定连接和通讯连接,具有正常角膜相似的进行膜泡运输和抗UV氧化损伤的功能。综上所述,本文利用孔鳐皮胶原蛋白制备出了光学性能、力学性能和组织结构良好且与HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞具有理想生物相容性的鱼类胶原蛋白支架,进而以胶原蛋白支架为载体支架,以属性正常、增殖能力旺盛及功能蛋白表达正常的非转染HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞为种子细胞,成功体外构建出了与正常角膜结构、属性与功能相似的组织工程全层角膜。本文研究结果,对于鱼类胶原蛋白在组织工程领域的高质化应用具有重要意义,为我国数百万、全世界有数千万角膜病盲患者早日通过TE-flHC移植重见光明带来希望。
庞鑫[8]（2015）在《组织工程人后板层半角膜体外构建的实验研究》文中进行了进一步梳理角膜（Cornea）是位于眼球表面的一层透明组织,是维持正常视功能的重要结构,由于位于眼表的最外层,因而极易受到损伤和感染,致使角膜病是引起视力下降甚至致盲的主要因素,目前主要依赖于角膜移植手术进行治疗。据流行病学调查显示,我国现有角膜病盲患者300余万,均需要通过角膜移植进行治疗,但因捐献角膜数量有限和供体角膜老化,每年能接受手术治疗的患者只有1000余人,绝大多数患者因得不到可用的供体角膜而无法接受角膜移植和复明。目前,体外构建的组织工程角膜（Tissue-engineered human cornea）作为捐献角膜的替代物,是解决供体角膜匮乏的主要途径,已成为众多角膜病盲患者重见光明的希望。组织工程角膜体外构建的核心要素是种子细胞（Seeder cells）、载体支架（Carrier scaffold）和信号分子（Signaling molecules）。组织工程角膜的体外构建,要求种子细胞必须能够持续保持细胞固有的形态结构、旺盛的增殖能力、稳定的遗传性能和发挥固有功能的潜能,要求载体支架必须具有与天然角膜类似的光学性能、三维网架结构、生物相容性和机械强度。获得足量正常的种子细胞和生物相容性理想的的载体支架是开展组织工程角膜体外构建研究的前提条件。人角膜在组织结构上由上皮层（Epithelium）、前弹力层（Bowman’s membrane）、基质层（Stroma）、后弹力层（Descemet’ membrane）和内皮层（Endothelium）构成。其中,人角膜基质（Human cornea stroma, HCS）由交错排列的200-250个胶原板层结构和散在分布的HCS细胞组成,占角膜厚度的90%,在角膜厚度和透明度维持中具有关键作用；而人角膜内皮（Human cornea endothelium, HCE）位于角膜最内层、由连接紧密的单层HCE细胞镶嵌而成,是角膜和前房的天然屏障,通过泵-漏机制维持角膜透明度并为角膜供养/氧,在角膜厚度和透明度维持中具有决定性作用。在角膜受到深度创伤和感染时,往往会伤及深层HCS和HCE,即后板层半角膜,轻者引起角膜水肿和角膜内皮失代偿,重者甚至致盲。目前后板层半角膜的治疗方法主要是通过单层HCS和HCE的多次角膜移植手术,不仅增加了手术创伤和感染的风险,而且在角膜愈合和移植瘢痕残留方面也存在有诸多缺陷。因此,体外构建出可用于移植的组织工程人后板层半角膜（Tissue-engineered posterior hemicornea, TE-pHC）已成为学者们新的研究热点。本文研究目的就是利用本实验室自主建立的非转染、无致瘤性的HCE细胞系和HCS细胞系作为种子细胞,以带后弹力层的脱细胞猪角膜基质（acellular porcine corneal stromata with Descemet’ membrane, aPCS-DM）为载体支架,进行TE-pHC的体外构建研究,旨在获得与活体角膜后半层组织结构高度近似的TE-pHC。为了获得足量正常的TE-pHC种子细胞,本文首先对非转染无致瘤性HCS和HCE组织细胞系细胞进行了体外扩增培养,并对其形态结构、增殖活性、染色体属性以及细胞标志蛋白和功能蛋白的表达进行了鉴定。光镜观察结果发现,体外扩增培养的第1批65代HCE细胞形成汇合单层时呈多角形的六边形内皮样细胞形态,第28批63代HCS细胞形态呈梭型,仍然具有其原有细胞的形态特征；生长与增殖活性的检测结果显示,HCE细胞和HCS细胞的群体倍增时间分别为48.54 h和38.28 h,仍保持有旺盛的体外增殖能力；染色体组型分析结果发现,这两种细胞的特征性染色体数目均为2n=46条,仍具有人类染色体的特征；免疫细胞化学检测结果显示,HCE细胞和HCS细胞仍分别保持有HCE细胞标志蛋白——人血管内皮生长因子受体-2（FLK-1）和HCS细胞标志蛋白——波形蛋白的阳性表达,表明两种细胞仍保持有HCE细胞和HCS细胞的固有属性。对HCE细胞和HCS细胞功能蛋白的免疫细胞化学检测结果发现,HCE细胞仍保持有细胞连接形成蛋白——紧密连接蛋白1（ZO-1）、间隙连接蛋白-43（CX-43）和整联蛋白βv/β5以及膜运输蛋白——Na+/K+-ATPase的阳性表达,而HCS细胞保持有CX-43和整联蛋白β1以及Na+/K+-ATPase和乙醛脱氢酶3（ALDH3）的阳性表达,证明这两种细胞均仍然保持有形成细胞-细胞间、细胞-细胞外基质间细胞连接和执行膜运输功能的潜能,且HCS细胞保持有抗紫外损伤的潜能。上述鉴定结果证明,第65代HCE细胞和第63代HCS细胞在体外扩增培养中的形态、染色体属性和细胞属性正常,增殖能力旺盛,并依然保持有形成细胞连接和执行膜运输功能的潜能,符合作为组织工程角膜种子细胞的各项条件,可以被用于TE-pHC体外构建的种子细胞。为了获得形态结构与天然角膜类似的TE-pHC载体支架,本文以新鲜猪角膜为材料进行了aPCS-DM支架的制备和鉴定。我们利用冻融循环联合核酸酶消化的方法进行脱细胞处理,经核黄素交联及风干处理,获得了aPCS-DM载体支架。用于构建TE-pHC前,分别对光学性能、组织结构、理化性质和机械性能进行了检测和评价。光学性能检测结果显示,aPCS的透明度和透光率近似于天然角膜,具有良好的光学性能。组织学检查结果显示,经过脱细胞处理后aPCS胶原板层仍保持排列规则且结构致密,后弹力层完整且表面平整,异种细胞在处理过程中被去除；理化性质检测结果显示,含水量略高于天然角膜,aPCS中DNA残留量低且符合医用生物材料标准,糖胺聚糖分布与天然角膜相似。生物力学性能检测结果显示,aPCS在生物力学性能上与天然角膜无显着差异。上述结果表明,本文制备的aPCS-DM支架具有良好的光学性能,三维组织结构和理化性质与天然角膜高度近似,生物力学性能优良,满足作为构建TE-pHC的载体支架材料的要求。为了进一步检测载体支架与两种细胞的生物相容性,本文对aPCS支架进行了细胞毒性评价和接种细胞后的免疫组织化学检测。利用HCE细胞和HCS细胞进行MTT细胞毒性的检测结果显示,制备的aPCS无细胞毒性作用。接种HCS细胞和HCE细胞后aPCS的的免疫组织化学结果显示,细胞在载体支架内部和后弹力层表面均能阳性表达其标志蛋白、连接形成蛋白和功能蛋白。上述结果综合表明,aPCS支架不仅无细胞毒性,还能够为细胞的黏附、增殖和功能表达提供合适的三维空间结构,具备良好的生物相容性,是作为TE-pHC体外构建的理想支架材料。在已获得种子细胞和载体支架的前提下,为了构建具有功能的TE-pHC,本实验进行了TE-pHC的体外构建并对其进行了鉴定。本文通过比较HCE细胞和HCS细胞的不同接种方式和摸索细胞接种时间建赢了TE-pHC的构建技术路线：微量注射的方法将HCS细胞接种于aPCS支架的基质中,培养24 h后将接种过HCS细胞的植片后弹力层面向上直接法接种HCE细胞,继续培养至4天,从而构建出TE-pHC.对TE-pHC进行组织结构和功能检查,茜素红染色结果说明HCE细胞在后弹力层面形成连续的单层,细胞密度为2910±420个／mm2的密度,相当于健康成人30岁左右的内皮细胞密度；H&E染色结果显示HCS细胞在注射点附近支架黏附并伸展,向周围扩散分布,HCE细胞连续完整单层与后弹力层结合紧密; TE-pHC的电镜结果显示,HCE细胞在aPCS后弹力层上形成的单层细胞表面平整,细胞与细胞连接紧密,两种细胞与支架材料间均形成连接结构。免疫组织化学检测结果显示构建的TE-pHC中HCE细胞和HCS细胞标志蛋白、连接形成蛋白和功能蛋白表达均呈阳性。上述结果表明构建的TE-pHC在组织结构上近似于人角膜后板层,HCE细胞和HCS细胞功能蛋白正常表达,具有发挥后板层生物学功能的潜能。综上所述,本文利用在体外扩增培养中的形态、染色体属性和细胞属性正常,增殖能力旺盛的非转染HCE细胞和HCS细胞,以光学性能优良,组织结构和理化性质与天然角膜高度近似,生物相容性和机械力学性能良好的aPCS-DM为载体支架,经体外构建5天后即可获得形态组织结构和生物学性能与活体角膜后板层高度近似的TE-pHC,具有发挥其生物学功能的潜能。这些研究结果表明本实验在体外成功构建的TE-pHC,既可作为体外角膜实验的良好模型,又兼具后板层半角膜移植等效替代物的应用前景。TE-pHC体外构建技术的建立及形态结构正常TE-pHC的获得,为其替代捐献角膜用于后板层角膜异常病变的临床治疗创造条件,也可替代组织工程人全层角膜用于角膜缘完好的全层角膜异常患者的穿透性板层移植,不仅科学意义重大,社会意义和应用价值重大,为组织工程角膜的临床应用奠定了体外实验基础。
陶蒙[9]（2015）在《组织工程角膜动态培养及透明度检测仪器开发与实验论证》文中进行了进一步梳理利用组织工程技术在体外构建培养角膜组织来解决角膜供体问题，为广大角膜盲患者的复明带来了希望。但是，目前大多数组织工程角膜都是采用静态培养的方式，通过手工塑形，人工培养操作，导致培养出来的角膜组织很多时候存在着形态不规范，透明度差，批次之间的质量难以控制等一系列问题。近几年，研究发现力学刺激在组织工程学、生物学、形态学等方面发挥着极其重要的作用，构建良好力学环境对大多数体内器官、组织的生长都有着很大的影响。同时考虑到培养出来的角膜组织透明度的好坏是决定角膜是否培养成功的最关键因素之一，而目前临床与实验针对角膜透明度通常采用主观判断为主，无法用数据客观评价。因此，本文开发一套组织工程角膜体外动态培养系统及透明度检测仪器，能够模拟体内角膜的力学环境，构建理想的角膜培养微环境，同时用透明度检测装置检测组织工程角膜的透明度值，提供更加客观的评价标准:（1）根据透明度光学的基本原理，以虚拟仪器为开发平台，采用计算机，数据采集卡、照度传感器等器件，确定组织工程角膜透明度检测的测量方法，完成组织工程角膜透明度检测仪器的开发，同时使用红色激光或者普通LED可见光作为光源，针对有机玻璃、普通浮法玻璃、隐形眼镜和猪角膜的测量计算，确定组织工程角膜透明度测量仪的系统误差修正值为0.0094，精度误差为0.6-1.0%，满足测量要求。采用红色激光光源测量的角膜透明度比普通LED可见光测得的值有细微不同；但是对于确定的光源，该仪器不影响被测组织工程角膜透明度的优劣评判；更换不同波长光源，可以获得该种波长情况下角膜透明度的精确值。（2）实现组织工程角膜动态培养系统开发，系统由角膜反应器和控制系统两大部分组成，利用ANSYS对角膜模型进行有限元的力学分析，合理设计生物培养系统的力学环境，确定了角膜反应器的内部结构，可以将角膜种子细胞-生物可降解载体支架放入处于无菌CO2培养箱内部的角膜反应器中，通过调控反应器的压力大小、电机转动和培养液灌流等方式来实现动态培养。通过对脱细胞猪角膜基质的动静态实验对比，经倒置显微镜、透明度检测仪器观察可以发现动态实验后的脱细胞猪角膜基质样品表面更加平整，更加透明，胶原纤维更加有序。综上所述，本文研究的组织工程角膜透明度测量方法与仪器可以对组织工程角膜进行定量的检测，实现了组织工程角膜透明度参数的可比性，从而更客观与科学，有望成为组织工程角膜度透明度测量的新标准；而开发的组织工程角膜动态培养系统，为接下来的组织工程角膜的体外构建开创了新的思路，给组织工程角膜临床应用和大规模产业化、标准化培养打下良好的基础。
刁金美[10]（2014）在《基于脱细胞猪角膜基质的组织工程全层人角膜的体外重建、鉴定及其在动物移植中的作用研究》文中研究说明角膜是位于眼表的透明组织，主要行使屈光的功能。由于角膜直接与外界环境接触，因此极易受到机械外伤、热灼伤以及微生物的感染，导致角膜病的发生，严重者甚至失明。角膜移植是唯一的治疗方法。但是，目前所需的供体角膜数量严重匮乏，远远不能满足临床的需要。随着角膜组织工程的兴起与发展，组织工程人角膜（Tissue-engineered Human Cornea，TE-HC）有望成为捐献角膜的等效替代物，从而解决供体不足的问题，为角膜病盲患者带来复明的希望。TE-HC体外重建的核心要素主要包括两方面：一是能够获得足量的、形态结构及功能正常的人角膜种子细胞；二是制备出与种子细胞具有良好生物相容性的载体支架。目前用于TE-HC的种子细胞主要有胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）、原代培养细胞、成体干细胞（adult stem cells,ASC）以及转染细胞系细胞； ESC应用引起的伦理问题、原代培养细胞的数量限制、ASC诱导分化率低以及转染细胞系细胞的潜在致瘤性风险，限制了这些细胞在角膜组织工程中的应用；载体支架主要有天然生物材料、天然高分子材料以及合成高分子材料。天然高分子材料构建的载体支架存在的机械性能缺陷、合成高分子材料的生物相容性较差限制了其作为组织工程角膜载体支架的应用。因此寻找理想的角膜种子细胞以及载体支架材料成为体外成功重建TE-HC的关键因素。本文采用的非转染、无致瘤性的HCEP（human corneal epithelium, HCEP）细胞、基质（human corneal stroma, HCS）细胞以及内皮（human corneal endothelium, HCE）细胞，具有角膜细胞的正常属性及功能，并且体外增殖能力强，短时间内即可获得大量的细胞，从而作为理想的种子细胞解决了TE-HC体外重建的种子细胞来源问题。而在载体支架方面，经本实验室前期的研究、探索及优化，制备出了具有透光率高、生物相容性好的脱细胞猪角膜基质（acellular porcine corneal stroma, aPCS），成为体外重建TE-HC的理想载体支架材料。为了进一步鉴定HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞的属性、功能蛋白的表达以及是否具有潜在的致瘤性，本文对第70代的HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞进行了复苏、扩增培养和鉴定。结果显示，复苏的第70代HCEP细胞和HCE细胞均呈典型上皮细胞型，而HCS细胞呈典型成纤维细胞型。HCEP细胞、HCE细胞的细胞与细胞之间紧密相靠、互相衔接，排列呈现“铺路石”状，具有连接成片的能力，而HCS细胞排列呈流线型。HCEP细胞、HCE细胞以及HCS细胞的群体倍增时间分别为39.6h、38.6h和36.5h，三种细胞的活力良好，增殖分裂旺盛，特征性染色体数目仍均为2n=46。功能蛋白的表达检测结果显示，HCEP细胞能够表达HCEP特异性标志蛋白---角蛋白3和12，以及钠钾泵和整联蛋白，表明该细胞仍具有角膜上皮的表型，且具有形成完整HCEP结构的潜能；HCS细胞能够表达HCS特异性标志蛋白---波形蛋白,以及乙醛酸脱氢酶ALDH3A1及整联蛋白，表明该细胞仍具有角膜基质细胞的潜能；而HCE细胞能够表达钠钾泵、紧密连接蛋白ZO-1及整联蛋白，表明该细胞仍具有角膜内皮的表型，且具有形成完整HCE结构的潜能。致瘤性检验结果显示，这三种角膜种子细胞安全性好，均无致瘤性。因此，HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞可作为体外重建TE-HC的理想种子细胞。为了获得理想的载体支架，本文以带后弹力层的猪角膜为研究材料，应用0.5%脱氧胆酸钠及0.04%原钒酸钠联合DNA-RNA酶对猪角膜进行脱细胞处理，通过风干的方法制备出理想的aPCS载体支架材料，并对其进行了形态功能鉴定和生物相容性研究。石蜡切片HE染色和冰冻切片DAPI染色结果显示，aPCS无任何细胞残留；阿利新兰染色结果显示胞外基质糖胺聚糖（GAG）的分布与对照相似；而扫描电镜结果显示aPCS后弹力层面及基质面光滑平整；透射电镜结果显示构成aPCS胶原板层的胶原纤维排列整齐规则。为了检测aPCS的生物相容性，我们制备了aPCS浸提液，并进行了浸提液对HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞的细胞活力及细胞毒性的检测，结果显示aPCS浸提液对三种细胞的生长均无影响，不影响细胞的增殖，也不引起细胞的凋亡，没有对细胞产生毒性。因此，aPCS可以作为体外重建TE-HC的理想载体支架。为了建立TE-HC体外规模化重建的技术工艺条件，在获得了理想的种子细胞和载体支架材料后，我们进行了TE-HC的体外重建研究。首先采用微量注射的方法将HCS细胞接种于aPCS支架的基质中，然后将其置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的DMEM/F12（1:1）培养液中，培养24h；其次，将接种过HCS细胞的植片放于插入式培养皿中，后弹力层面朝上，将HCE细胞接种于aPCS的后弹力层面，培养24h后反转植片，后弹力层朝下，接种HCEP细胞，采用气-液界面培养方法持续培养5d，从而重建出了TE-HC，并对其形态结构及细胞功能蛋白表达进行了鉴定。茜素红染色结果显示HCE细胞在后弹力层面形成了连续的细胞单层；石蜡切片HE染色结果显示aPCS支架内基质细胞伸展良好，与支架材料结合紧密；而HCEP细胞在aPCS支架基质层表面形成了6-7层的复层上皮结构，类似于正常角膜的结构；免疫组化染色结果显示TE-HC的HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞的标志性蛋白、功能蛋白表达均呈阳性，与正常细胞的表型和功能相同。上述结果表明以带后弹力层的aPCS为载体支架、以第70代HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞为种子细胞体外成功重建出了TE-HC，具有与活体角膜相似的组织结构，其种子细胞具有功能蛋白的阳性表达，表明可能具有全角膜的生物学功能。为了鉴定体外重建TE-HC的生物学功能，本文选用新西兰兔和比格犬进行了TE-HC的穿透性角膜移植实验，并通过过裂隙灯显微镜观察、角膜厚度以及眼压测定等方法来评估在体TE-HC的透明度、厚度和新生血管等特征。结果显示，新西兰兔术后前10d，角膜水肿，眼压偏高；第20d，水肿状况减轻，眼压恢复正常；第30d，角膜部分透明。比格犬移植实验结果显示，在术后前期，植片水肿，眼压升高，但是30d后，角膜重新上皮化，眼压恢复正常，角膜水肿减轻，但是还是未恢复到正常角膜厚度，目前我们已观察至270d，发现角膜新生血管情况好转，但是术眼角膜厚度还是高于正常角膜。综上所述，本文以具有正常属性和功能的第70代HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞为种子细胞，以具有良好生物相容性的aPCS为载体支架，体外重建了形态结构和功能属性与活体角膜相似的TE-HC，并进行了新西兰兔和比格犬的穿透性角膜移植实验，虽然在体动物实验结果没有达到我们预想的理想情况，但是却为我们提供了后续TE-HC重建的参数，在此基础上，接下来我们将对TE-HC的重建方法进行进一步优化，从而最终能够实现成功重建出可应用于临床角膜移植的TE-HC。
二、组织工程技术构建角膜组织研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、组织工程技术构建角膜组织研究进展（论文提纲范文）
（1）基于光交联水凝胶的体外角膜再生研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 角膜的结构 |
| 1.3 角膜的功能 |
| 1.4 角膜的损伤与修复 |
| 1.4.1 角膜的损伤与疾病 |
| 1.4.2 临床上的角膜修复方法 |
| 1.5 角膜组织工程概述 |
| 1.5.1 角膜组织工程适用的生物支架材料 |
| 1.5.2 角膜组织工程适用的种子细胞 |
| 1.5.3 角膜组织工程面临的挑战与应用前景 |
| 1.6 本论文的研究目的、意义及内容 |
| 第2章 甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)水凝胶的制备及其理化性能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.2.2 实验步骤 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 GelMA水凝胶的内部结构 |
| 2.3.2 平衡水含量和酶降解 |
| 2.3.3 力学表征 |
| 2.3.4 接触角和光学性质表征 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 GelMA水凝胶用于角膜基质再生的生物学性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 主要试剂和仪器 |
| 3.2.2 大鼠骨髓间充质干细胞(rBM-MSCs)的黏附 |
| 3.2.3 支架中rBM-MSCs的活力和形态 |
| 3.2.4 支架中rBM-MSCs的增殖 |
| 3.2.5 诱导分化rBM-MSCs |
| 3.2.6 qRT-PCR检测rBM-MSCs中角膜基质细胞标志物的表达 |
| 3.2.7 免疫荧光检测rBM-MSCs中Lumican的表达 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 rBM-MSCs对于GelMA水凝胶的黏附与存活 |
| 3.3.2 rBM-MSCs在GelMA水凝胶表面的形态 |
| 3.3.3 支架中rBM-MSCs的增殖情况 |
| 3.3.4 rBM-MSCs中的角膜基质细胞标志物的基因表达 |
| 3.3.5 rBM-MSCs中Lumican的表达 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 GelMA/HAMA双网络(DN)水凝胶用于角膜上皮再生的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 GelMA、HAMA的合成 |
| 4.2.3 核磁共振氢谱(~1H-NMR)和傅里叶红外光谱检测(FTIR) |
| 4.2.4 GelMA、HAMA和GelMA/HAMA双网络(DN)水凝胶的合成 |
| 4.2.5 DN水凝胶的理化性能检测 |
| 4.2.6 兔角膜上皮细胞(CEpCs)的培养 |
| 4.2.7 DN水凝胶生物学性能检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 GelMA和HAMA的~1H-MNR和FTIR的表征 |
| 4.3.2 GelMA/HAMA DN水凝胶的合成 |
| 4.3.3 GelMA/HAMA DN水凝胶的内部结构 |
| 4.3.4 GelMA/HAMA DN水凝胶的机械性能 |
| 4.3.5 GelMA/HAMA DN水凝胶的溶胀和保水性能 |
| 4.3.6 GelMA/HAMA DN水凝胶的光学性质和亲水性 |
| 4.3.7 GelMA/HAMA DN水凝胶的体外降解特性 |
| 4.3.8 CEpCs对于GelMA/HAMA DN水凝胶的增殖 |
| 4.3.9 CEpCs在GelMA/HAMA DN水凝胶上的生存力 |
| 4.3.10 CEpCs在GelMA/HAMA DN水凝胶上的形态 |
| 4.3.11 CEpCs在GelMA/HAMA DN水凝胶上CK3的表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）人胚胎干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 角膜内皮移植手术方式的改良 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验器械 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 实验耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 兔原代角膜内皮细胞的培养 |
| 1.2.2 细胞存活率测定实验 |
| 1.2.3 免疫荧光染色 |
| 1.2.4 细胞悬液制备 |
| 1.2.5 角膜内皮植片的构建 |
| 1.2.6 前房注射法行角膜内皮细胞移植及术后评估 |
| 1.2.7 角膜后弹力层剥除内皮移植术行角膜内皮细胞移植 |
| 1.2.8 活体共焦角膜显微镜检查 |
| 1.2.9 角膜厚度测量 |
| 1.2.10 眼压测量 |
| 1.3 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 单细胞前房注射法与DSEK法行细胞移植的对比研究 |
| 2.2 迷你植片制备方法的建立 |
| 2.2.1 制备迷你植片的消化酶的确定 |
| 2.2.2 制备迷你植片消化时间的确定 |
| 2.3 迷你植片移植细胞的贴壁能力测定 |
| 2.3.1 迷你植片体外促进移植细胞贴壁 |
| 2.3.2 迷你植片体内促进移植细胞贴附 |
| 2.4 迷你植片移植后体内细胞功能测定 |
| 2.4.1 迷你植片促进移植细胞形成屏障功能 |
| 2.4.2 迷你植片促进移植细胞的泵功能形成 |
| 第三章 讨论 |
| 第二部分 人胚胎干细胞向角膜内皮样细胞的诱导分化 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验器械 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 实验耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 人胚胎干细胞的培养及诱导分化 |
| 1.2.2 免疫荧光染色 |
| 1.2.3 实时荧光定量PCR |
| 1.2.4 流式细胞仪检测 |
| 1.2.5 成瘤性检测 |
| 1.2.6 石蜡切片的制作及苏木素-伊红染色 |
| 1.3 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 人胚胎干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞 |
| 2.2 人胚胎干细胞诱导分化为神经嵴细胞的相关检测 |
| 2.3 神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮样细胞 |
| 2.4 诱导hESC向角膜内皮样细胞定向分化的基因表达时程变化 |
| 2.5 诱导的角膜内皮样细胞的安全性 |
| 第三章 讨论 |
| 第三部分 胚胎干细胞诱导的角膜内皮细胞对于角膜内皮失代偿动物的治疗效果 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验器械 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 实验耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 前房注射法行新西兰大白兔角膜内皮移植及术后评估 |
| 1.2.2 前房注射法行食蟹猴角膜内皮移植术及术后评估观察 |
| 1.2.3 免疫荧光染色 |
| 1.2.4 茜素红染色 |
| 1.2.5 地高辛标记细胞 |
| 1.2.6 活体共焦角膜显微镜检查 |
| 1.2.7 角膜厚度测量 |
| 1.2.8 眼压测量 |
| 1.3 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 hESC诱导的角膜内皮样细胞治疗兔角膜内皮失代偿的疗效评估 |
| 2.1.1 诱导的角膜内皮样细胞移植后角膜透明度的变化 |
| 2.1.2 诱导的角膜内皮样细胞移植后角膜厚度的变化 |
| 2.1.3 诱导的角膜内皮样细胞移植后的形态学变化 |
| 2.1.4 诱导的角膜内皮样细胞移植后的追踪 |
| 2.2 hESC诱导的角膜内皮样细胞治疗猴角膜内皮失代偿的疗效评估 |
| 2.2.1 诱导的角膜内皮样细胞移植后角膜的变化 |
| 2.2.2 诱导的角膜内皮样细胞移植后角膜厚度的变化 |
| 2.2.3 诱导的角膜内皮细胞移植后的形态学变化 |
| 2.2.4 诱导的角膜内皮样细胞移植后的追踪 |
| 第三章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 主要缩略词表 |
| 致谢 |
（3）兔角膜基质细胞及脱细胞猪角膜基质构建组织工程角膜移植的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: 体外诱导人皮肤来源的前体细胞分化为角膜内皮样细胞的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 利用角膜内皮样细胞进行角膜内皮移植的实验研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 利用角膜内皮样细胞构建组织工程角膜植片的初步实验研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 皮肤干细胞及其在组织工程角膜应用的相关进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（5）壳聚糖及其衍生物作为组织工程角膜支架的研究进展（论文提纲范文）
| 1 壳聚糖概述 |
| 2 壳聚糖及其衍生物作为组织工程角膜支架材料的优点 |
| 2.1 良好的生物相容性及生物可降解性 |
| 2.2 良好的机械性能 |
| 2.3 良好的可塑性 |
| 3 壳聚糖在组织工程角膜中的应用研究 |
| 3.1 组织工程角膜上皮 |
| 3.2 组织工程角膜内皮 |
| 3.3 组织工程角膜基质 |
（6）胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样细胞及角膜内皮样细胞构建组织工程全厚角膜的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 APCM支架的制备 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 hESCs体外分化为LEC-like细胞和CEC-like细胞的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 组织工程全厚角膜的构建和体内功能的检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
（7）利用鱼类胶原蛋白支架体外构建组织工程全层人角膜的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 角膜的解剖学特征与生理功能 |
| 1.1 角膜的解剖学特征 |
| 1.1.1 上皮层 |
| 1.1.2 前弹力层 |
| 1.1.3 基质层 |
| 1.1.4 后弹力层 |
| 1.1.5 内皮层 |
| 1.1.6 角膜缘 |
| 1.2 角膜的生理功能 |
| 1.2.1 屏障功能 |
| 1.2.2 透光功能 |
| 1.2.3 屈光功能 |
| 2 角膜病变及治疗 |
| 3 组织工程角膜研究进展 |
| 3.1 组织工程角膜种子细胞的研究 |
| 3.1.1 角膜缘干细胞(limbal stem cells) |
| 3.1.2 间充质干细胞(mesenchymal stem cells) |
| 3.1.3 角膜上皮细胞(corneal epithelial cells) |
| 3.1.4 口腔黏膜上皮细胞(oral mucosa epithelial cell) |
| 3.1.5 角膜基质细胞(corneal stromal cells) |
| 3.1.6 角膜内皮细胞(corneal endothelial cells) |
| 3.2 组织工程角膜载体支架材料的研究 |
| 3.2.1 天然生物材料 |
| 3.2.2 人工合成高分子材料 |
| 3.2.3 生物大分子复合材料 |
| 3.3 组织工程全层角膜体外构建研究进展 |
| 4 本文的研究目的和意义 |
| 第二章 鱼类胶原蛋白支架的制备及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鱼胶原蛋白鉴定 |
| 2.1.1 鱼胶原蛋白分子量检测 |
| 2.1.2 鱼胶原蛋白氨基酸组成分析 |
| 2.2 交联条件优化 |
| 2.2.1 交联浓度优化 |
| 2.2.2 交联时间优化 |
| 2.2.3 冰冻切片 |
| 2.2.4 HE染色 |
| 2.3 鱼类胶原蛋白支架的制备 |
| 2.4 鱼类胶原蛋白支架理化性质检测 |
| 2.4.1 外观观察 |
| 2.4.2 透光率 |
| 2.4.3 含水量检测 |
| 2.4.4 力学性能检测 |
| 2.4.5 鱼类胶原蛋白支架组织结构检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 鱼胶原蛋白鉴定 |
| 3.1.1 分子量检测 |
| 3.1.2 氨基酸分析 |
| 3.2 EDC/NHS交联条件优化 |
| 3.2.1 交联浓度优化 |
| 3.2.2 交联时间优化 |
| 3.3 鱼类胶原蛋白支架的鉴定 |
| 3.3.1 透光性能检测 |
| 3.3.2 含水量检测 |
| 3.3.3 力学性能检测 |
| 3.3.4 鱼类胶原蛋白支架的组织结构 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 人角膜组织细胞的体外扩增培养及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的复苏及扩增培养 |
| 2.1.1 细胞的复苏 |
| 2.1.2 细胞的扩增培养 |
| 2.2 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的细胞生长曲线测定 |
| 2.3 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的染色体组型分析 |
| 2.4 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的免疫细胞化学检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的生长特性 |
| 3.2 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的染色体组型分析 |
| 3.2.1 HCEP细胞的染色体组型 |
| 3.2.2 HCS细胞的染色体计数与核型分析 |
| 3.2.3 HCE细胞的染色体计数与核型分析 |
| 3.3 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的免疫细胞化学检测 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 鱼类胶原蛋白支架的生物相容性研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鱼类胶原蛋白支架的制备和灭菌处理 |
| 2.1.1 鱼类胶原蛋白支架的制备 |
| 2.1.2 鱼类胶原蛋白支架的灭菌处理 |
| 2.2 鱼类胶原蛋白支架浸提液制备 |
| 2.3 人角膜细胞的体外培养与接种 |
| 2.3.1 人角膜细胞体外培养 |
| 2.3.2 接种前鱼类胶原蛋白支架的处理 |
| 2.3.3 HCEP细胞的CFSE标记与接种 |
| 2.3.4 HCS细胞的DiI标记与接种 |
| 2.3.5 HCE细胞的Celltrace标记与接种 |
| 2.4 生物相容性检测 |
| 2.4.1 细胞活力检测 |
| 2.4.2 RT-PCR检测 |
| 2.4.3 荧光标记物观察 |
| 2.4.4 免疫组织化学检测 |
| 2.5 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 鱼类胶原蛋白支架浸提液对种子细胞的细胞活力影响 |
| 3.2 鱼类胶原蛋白支架中种子细胞的生长及增殖基因的表达情况 |
| 3.3 鱼类胶原蛋白支架中种子细胞标志蛋白与功能蛋白表达情况 |
| 3.3.1 鱼类胶原蛋白支架中HCEP细胞标志蛋白与功能蛋白表达情况 |
| 3.3.2 鱼类胶原蛋白支架中HCS细胞标志蛋白与功能蛋白表达情况 |
| 3.3.3 鱼类胶原蛋白支架中HCE细胞标志蛋白与功能蛋白表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 体外构建组织工程全层人角膜的实验研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鱼类胶原蛋白支架的制备和火菌处理 |
| 2.1.1 鱼类胶原蛋白支架制备 |
| 2.1.2 鱼类胶原蛋白支架的灭菌处理 |
| 2.2 种子细胞接种天数的优化 |
| 2.2.1 接种前鱼类胶原蛋白支架的处理 |
| 2.2.2 HCEP细胞的CFSE标记与接种天数优化 |
| 2.2.3 HCS细胞的Dil标记与接种天数优化 |
| 2.2.4 HCE细胞的Celltrace标记与接种天数优化 |
| 2.2.5 冰冻切片与HE检测 |
| 2.2.6 细胞标记物荧光观察 |
| 2.3 TE-flHC的体外构建 |
| 2.4 体外构建的TE-flHC的鉴定 |
| 2.4.1 光学透明度与透光率 |
| 2.4.2 冰冻切片与HE检测 |
| 2.4.3 TE-flHC内皮的茜素红染色 |
| 2.4.4 细胞标记物焚光观察 |
| 2.4.5 扫描电镜检测 |
| 2.4.6 透射电镜检测 |
| 2.4.7 免疫组织化学检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 种子细胞接种大数的优化 |
| 3.1.1 HCEP细胞接种天数优化 |
| 3.1.2 HCS细胞接种天数优化 |
| 3.1.3 HCE细胞接种天数优化 |
| 3.2 TE-flHC的透光性能检测 |
| 3.3 TE-flHC组织结构观察 |
| 3.4 TE-flHC的超微结构观察 |
| 3.5 TE-flHC的生物学功能检测 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）组织工程人后板层半角膜体外构建的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 角膜基本结构 |
| 1.1 角膜上皮层 |
| 1.2 角膜前弹力层 |
| 1.3 角膜基质层 |
| 1.4 角膜后弹力层 |
| 1.5 角膜内皮层 |
| 2 组织工程角膜概述 |
| 3 组织工程角膜种子细胞的研究概述 |
| 3.1 原代或传代细胞 |
| 3.2 成体干细胞 |
| 3.3 胚胎干细胞 |
| 3.4 永生化细胞系 |
| 4 组织工程角膜载体支架的研究概述 |
| 4.1 天然材料 |
| 4.1.1 羊膜 |
| 4.1.2 脱细胞角膜基质 |
| 4.2 生物大分子材料 |
| 4.2.1 胶原 |
| 4.2.2 丝素蛋白 |
| 4.2.3 纤维蛋白 |
| 4.2.4 壳聚糖 |
| 4.3 人工合成高分子材料 |
| 4.4 细胞片技术 |
| 5 脱细胞角膜在组织工程角膜中的应用 |
| 5.1 脱细胞方法 |
| 5.1.1 物理方法 |
| 5.1.2 化学方法 |
| 5.1.3 渗透溶液法 |
| 5.1.4 生物方法 |
| 5.1.5 螫合剂 |
| 5.1.6 醇类 |
| 5.2 脱细胞角膜在组织工程角膜构建中的应用 |
| 5.2.1 角膜基质细胞的接种 |
| 5.2.2 角膜基质细胞的接种 |
| 6 本文研究目的及意义 |
| 第二章 人角膜内皮细胞和基质细胞的扩增培养及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HCE细胞和HCS细胞的复苏和体外扩增培养 |
| 2.1.1 HCE细胞和HCS的复苏 |
| 2.1.2 HCE细胞和HCS细胞的体外扩增培养 |
| 2.2 HCE细胞和HCS细胞的生长特性测定 |
| 2.3 HCE细胞和HCS细胞的染色体组型分析 |
| 2.4 HCE细胞和HCS细胞的免疫化学检测 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCE细胞的形态观察 |
| 3.2 HCE细胞和HCS细胞生长特性 |
| 3.3 HCE细胞和HCS细胞的染色体核型分析 |
| 3.4 HCE细胞和HCS细胞相关蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 脱细胞猪角膜基质支架的制备及鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 脱细胞猪角膜基质支架的制备 |
| 2.1.1 猪角膜的取材 |
| 2.1.2 猪角膜的脱细胞处理与保存 |
| 2.2 脱细胞猪角膜基质光学性能检查 |
| 2.2.1 形态观察 |
| 2.2.2 透光率检测 |
| 2.3 脱细胞猪角膜基质组织结构学检查 |
| 2.3.1 石蜡切片与H&E染色 |
| 2.3.1.1 石蜡切片制作 |
| 2.3.1.2 H&E染色 |
| 2.3.2 透射电镜观察 |
| 2.3.3 扫描电镜观察 |
| 2.4 脱细胞猪角膜基质成分分析 |
| 2.4.1 含水量测定 |
| 2.4.2 冰冻切片与DAPI染色 |
| 2.4.3 DNA含量检测 |
| 2.4.4 阿利新兰染色 |
| 2.5 脱细胞猪角膜基质生物力学性能测试 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 脱细胞猪角膜基质的理化性质鉴定 |
| 3.1.1 外观观察 |
| 3.1.2 透光率 |
| 3.2 脱细胞猪角膜基质的组织结构检查 |
| 3.2.1 H&E染色结果 |
| 3.2.2 透射电镜观察结果 |
| 3.2.3 扫描电镜观察结果 |
| 3.3 脱细胞猪角膜基质的成分 |
| 3.3.1 含水量测定 |
| 3.3.2 脱细胞猪角膜基质DAPI染色结果 |
| 3.3.3 DNA定量检测结果 |
| 3.3.4 脱细胞猪角膜基质阿利新兰染色结果 |
| 3.4 脱细胞猪角膜基质的生物力学检查结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 脱细胞猪角膜基质支架的生物相容性研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 aPCS浸提液对HCE细胞及HCS细胞毒性检测 |
| 2.1.1 浸提液制备 |
| 2.1.2 形态学观察 |
| 2.1.3 增殖能力检测 |
| 2.2 接种于aPCS支架上的HCE细胞及HCS细胞免疫化学检测 |
| 2.2.1 HCS细胞的接种 |
| 2.2.2 HCS细胞免疫细胞化学检测 |
| 2.2.3 HCE细胞的接种 |
| 2.2.4 HCE细胞免疫细胞化学检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 aPCS浸提液对HCE细胞及HCS细胞活力影响作用分析 |
| 3.1.1 HCE细胞和HCS细胞形态学评价 |
| 3.1.2 增殖能力检测结果 |
| 3.2 接种于aPCS支架的HCE细胞及HCS细胞属性和功能蛋白表达 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 体外构建组织工程人角膜后板层的实验研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 组织工程人后板层半角膜接种HCE细胞条件摸索 |
| 2.1.1 HCE细胞的接种方法的比较 |
| 2.1.1.1 HCE细胞温敏培养板法 |
| 2.1.1.2 HCE细胞直接接种法 |
| 2.1.1.3 接种HCE细胞的aPCS茜素红染色 |
| 2.1.2 aPCS接种HCE细胞的培养时间摸索 |
| 2.2 组织工程人后板层半角膜接种HCS细胞条件摸索 |
| 2.2.1 HCS细胞的接种方法的比较 |
| 2.2.1.1 HCS细胞的DiI细胞标记 |
| 2.2.1.2 HCS细胞直接接种法 |
| 2.2.1.3 HCS细胞注射接种法 |
| 2.2.1.4 HCS细胞标记的荧光观察 |
| 2.2.2 aPCS接种HCE细胞的培养时间摸索 |
| 2.3 组织工程人后板层半角膜的体外构建 |
| 2.4 体外构建组织工程人后板层半角膜的鉴定 |
| 2.4.1 TE-pHC内皮的茜素红染色 |
| 2.4.2 冰冻切片的细胞荧光标记观察 |
| 2.4.3 石蜡切片H&E染色 |
| 2.4.4 TE-pHC的免疫组织化学检测 |
| 2.4.5 TE-pHC的透射电镜观察 |
| 2.4.6 TE-pHC的扫描电镜观察 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 aPCS接种HCE细胞的摸索 |
| 3.1.1 HCE细胞接种方式的比较 |
| 3.1.2 HCE细胞在后弹力层面形成单层情况 |
| 3.1.3 HCE细胞的分布与定位 |
| 3.2 aPCS接种HCS细胞的摸索 |
| 3.2.1 HCS细胞接种方式的比较 |
| 3.2.2 HCS细胞在aPCS支架中的分布情况 |
| 3.3 体外构建TE-pHC的鉴定 |
| 3.3.1 TE-pHC的内皮单层茜素红染色 |
| 3.3.2 细胞荧光标记观察和H&E染色 |
| 3.3.3 TE-pHC的免疫组织化学检测 |
| 3.3.4 TE-pHC的扫描电镜检测 |
| 3.3.5 TE-pHC的透射电镜检测 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在校期间发表论文 |
（9）组织工程角膜动态培养及透明度检测仪器开发与实验论证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题研究背景及意义 |
| 1.2 组织工程角膜的国内外研究进展 |
| 1.2.1 角膜的结构与功能 |
| 1.2.2 组织工程角膜上皮层研究 |
| 1.2.3 组织工程角膜基质层研究 |
| 1.2.4 组织工程角膜内皮层研究 |
| 1.2.5 全层角膜重建的研究 |
| 1.2.6 组织工程角膜透明度研究 |
| 1.3 力学因素在组织工程角膜培养中的作用 |
| 1.3.1 角膜的生物力学特性 |
| 1.3.2 力学环境对角膜生长的影响 |
| 1.4 论文的研究目的和主要内容 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 论文的主要内容 |
| 1.5 本章小结 |
| 第2章 组织工程角膜透明度检测仪器开发 |
| 2.1 角膜透明度检测仪器的测量原理 |
| 2.1.1 透明度的光学定义 |
| 2.1.2 仪器测量工作原理及设计依据 |
| 2.2 硬件装置设计开发 |
| 2.2.1 仪器整体设计实现 |
| 2.2.2 组织工程角膜透明度换算 |
| 2.2.3 硬件系统设备 |
| 2.3 基于 LABVIEW 检测软件系统设计开发 |
| 2.3.1 系统开发软件 |
| 2.3.2 软件主要设计模块 |
| 2.4 组织工程角膜透明度检测装置的精确度分析 |
| 2.4.1 空载状态组织工程透明度装置测量精确分析 |
| 2.4.2 组织工程角膜透明度装置精确度分析 |
| 2.4.3 不同光源对透明度测量精确度影响 |
| 2.4.4 结果讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 组织工程角膜生物培养系统 |
| 3.1 组织工程角膜体外动态培养和监控系统的总体方案 |
| 3.2 角膜生物培养反应器设计 |
| 3.2.1 设计原则 |
| 3.2.2 有限元分析角膜生物力学性能 |
| 3.2.3 角膜生物反应器构成 |
| 3.3 监控系统设计实现 |
| 3.3.1 传感器系统 |
| 3.3.2 电机控制 |
| 3.3.3 蠕动泵和培养箱的选择及装置搭建 |
| 3.4 结果讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 脱细胞基质角膜制备与生物培养系统的实验分析 |
| 4.1 脱细胞猪角膜基质实验材料制备 |
| 4.1.2 主要实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂药品 |
| 4.1.4 材料制备过程 |
| 4.1.5 实验材料选择 |
| 4.2 动态培养系统的实验分析 |
| 4.2.1 系统调试和样品实验 |
| 4.2.2 光镜观察 |
| 4.2.3 透明度检测 |
| 4.3 结果讨论 |
| 4.3.1 形态观察 |
| 4.3.2 透明度 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（10）基于脱细胞猪角膜基质的组织工程全层人角膜的体外重建、鉴定及其在动物移植中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 组织工程角膜的研究概述 |
| 1 角膜的结构与功能 |
| 1.1 角膜的解剖结构 |
| 1.2 角膜的生理功能 |
| 1.2.1 屏障功能 |
| 1.2.2 屈光功能 |
| 1.3 角膜疾病及治疗 |
| 2 组织工程学概述 |
| 2.1 组织工程学的建立与发展 |
| 2.2 组织工程的基本原理 |
| 2.3 组织工程的研究方向 |
| 2.3.1 组织工程种子细胞研究 |
| 2.3.2 组织工程支架材料研究 |
| 3 组织工程角膜的研究进展 |
| 3.1 组织工程角膜种子细胞的研究进展 |
| 3.1.1 胚胎干细胞研究 |
| 3.1.2 成体干细胞研究 |
| 3.1.3 其他类型细胞研究 |
| 3.2 组织工程角膜载体支架材料 |
| 3.2.1 天然材料 |
| 3.2.2 合成材料 |
| 4 本文的研究目的和意义 |
| 第二章 组织工程人全层角膜种子细胞的体外培养及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验药品 |
| 1.5 溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的复苏及扩增培养 |
| 2.1.1 细胞的复苏 |
| 2.1.2 细胞的扩增培养 |
| 2.2 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的细胞生长曲线测定 |
| 2.3 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的染色体组型分析 |
| 2.4 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的免疫荧光染色 |
| 2.5 细胞的致瘤性检验 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的生长特性 |
| 3.2 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的染色体计数与核型分析 |
| 3.3 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的免疫细胞化学检测 |
| 3.4 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的致瘤性检验 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 脱细胞猪角膜基质的制备及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验药品 |
| 1.5 主要溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 aPCS 的制备 |
| 2.2 aPCS 理化性能的检测 |
| 2.2.1 透光率检测 |
| 2.2.2 含水量检测 |
| 2.2.3 冰冻及石蜡切片 |
| 2.2.4 HE 染色 |
| 2.2.5 DAPI 染色 |
| 2.2.6 阿利新兰染色 |
| 2.2.7 电镜观察超微结构 |
| 2.3 aPCS 与角膜种子细胞的生物相容性研究 |
| 2.3.1 浸提液制备 |
| 2.3.2 细胞活力检测 |
| 2.3.3 细胞毒性检测 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 aPCS 外观 |
| 3.2 aPCS 理化性能 |
| 3.3 aPCS 与种子细胞的生物相容性 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 体外重建组织工程人全角膜的实验研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验药品 |
| 1.5 常用溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TE-HC 的体外重建 |
| 2.1.1 TE-HC 载体支架 aPCS 的制备 |
| 2.1.2 TE-HC 种子细胞的扩增培养 |
| 2.1.3 TE-HC 种子细胞的收集 |
| 2.1.4 TE-HC 的体外重建 |
| 2.2 体外重建 TE-HC 的鉴定 |
| 2.2.1 TE-HC 的光学透明度 |
| 2.2.2 TE-HC 内皮的茜素红染色 |
| 2.2.3 石蜡切片 HE 染色 |
| 2.2.4 TE-HC 的免疫细胞化学检测 |
| 2.2.5 TE-HC 的电镜观察 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TE-HC 的光学透明度 |
| 3.2 TE-HC 内皮的茜素红染色 |
| 3.3 石蜡切片 HE 染色 |
| 3.4 TE-HC 的电镜超微结构 |
| 3.5 TE-HC 的免疫组织化学检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 组织工程全层人角膜的动物移植研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验药品 |
| 1.5 常用溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TE-HC 的体外重建 |
| 2.1.1 TE-HC 载体支架 aPCS 的制备 |
| 2.1.2 TE-HC 种子细胞的扩增培养 |
| 2.1.3 TE-HC 种子细胞的收集 |
| 2.1.4 TE-HC 种子细胞的标记 |
| 2.1.5 TE-HC 的体外重建 |
| 2.2 穿透性角膜移植及检测 |
| 2.2.1 穿透性角膜移植手术 |
| 2.2.2 术后护理 |
| 2.2.3 术后在体检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 标记种子细胞的 TE-HC 的体外重建 |
| 3.2 角膜厚度 |
| 3.3 眼压 |
| 3.4 裂隙灯观察 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文 |
四、组织工程技术构建角膜组织研究进展（论文参考文献）
- [1]基于光交联水凝胶的体外角膜再生研究[D]. 延亚云. 太原理工大学, 2021(01)
- [2]人胚胎干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究[D]. 贾艳妮. 青岛大学, 2019(07)
- [3]兔角膜基质细胞及脱细胞猪角膜基质构建组织工程角膜移植的研究[D]. 张璐. 昆明医科大学, 2019(06)
- [4]人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究[D]. 申琳. 山东大学, 2018(01)
- [5]壳聚糖及其衍生物作为组织工程角膜支架的研究进展[J]. 姜晓蕾,杨朝忠,韩宝芹,刘万顺. 眼科新进展, 2017(04)
- [6]胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样细胞及角膜内皮样细胞构建组织工程全厚角膜的研究[D]. 张灿伟. 山东大学, 2017(08)
- [7]利用鱼类胶原蛋白支架体外构建组织工程全层人角膜的研究[D]. 袁晓龙. 中国海洋大学, 2015(07)
- [8]组织工程人后板层半角膜体外构建的实验研究[D]. 庞鑫. 中国海洋大学, 2015(07)
- [9]组织工程角膜动态培养及透明度检测仪器开发与实验论证[D]. 陶蒙. 杭州电子科技大学, 2015(10)
- [10]基于脱细胞猪角膜基质的组织工程全层人角膜的体外重建、鉴定及其在动物移植中的作用研究[D]. 刁金美. 中国海洋大学, 2014(01)