导读:本文包含了反向重复表达载体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:番木瓜环斑病毒,反向重复表达载体,原生质体,遗传转化
反向重复表达载体论文文献综述
胡恒[1]（2011）在《番木瓜环斑病毒（PRSV）ci和nib反向重复结构表达载体的转化研究》一文中研究指出番木瓜环斑病毒病是番木瓜的第一大病毒性病害,在世界范围内造成较大危害,目前还没有十分有效的化学药剂能控制PRSV病害,只能采取以栽培措施为主的综合防治措施。植物基因工程的快速发展为植物抗病提供了一条崭新而有效的方法,尤其是近年来RNAi领域研究的快速发展,利用反向重复表达载体对植物进行遗传转化成为研究植物抗病毒研究的一大热点。本研究以番木瓜胚状体、黄瓜子叶节作为转化材料,利用农杆菌介导法将反向重复表达载体pHellsgate-CIIR、pHellsgate-NIbIR导入到受体材料中,期望得到转基因植株。同时利用原生质体瞬时表达体系初步研究了反向重复表达载体对目标基因的沉默效果。主要研究结果如下：(1)对番木瓜下胚轴、叶柄、幼胚以及番木瓜愈伤组织进行胚状体诱导,仅从幼胚和愈伤组织上得到了番木瓜胚状体,其中以幼胚诱导产生的胚状体数量多,耗时短,40d左右即能从幼胚中诱导出胚状体,诱导率为20%。(2)以黄瓜子叶节为外植体建立了黄瓜再生体系,使用含有表达载体pHellsgate-CIIR、pHellsgate-NibIR的农杆菌侵染黄瓜子叶节,通过抗生素筛选,得到了黄瓜转化苗。(3)用PRSV病毒粒子与反向重复表达载体pHellsgate-CIIR共转化番木瓜原生质体,12、24、36、48h分别取样,经原生质体总RNA提取、RT-PCR检测,结果显示,对于只转化PRSV的原生质体,24h开始能够检测到病毒ci基因的表达,且随着时间延长,ci基因的表达量逐渐增多；对于PRSV与反向重复表达载体pHellsgate-CIIR共转化的番木瓜原生质体,没有检测到病毒ci基因的表达,说明重复表达载体pHellsgate-CIIR的产物能够抑制ci基因的表达。(本文来源于《华中农业大学》期刊2011-06-01）
宋培培,李爽,檀根甲,贾琳,丁菲[2]（2010）在《沉默抑制子CMV 2b基因的克隆及其反向重复植物表达载体的构建》一文中研究指出从安徽亳州采集表现明显CMV症状的烟草样本,取ELISA检测阳性反应最强的样本提取总RNA。设计特异性引物扩增CMV RNA2部分片段,克隆并测序。其中包含的2b基因全长336个核苷酸,编码111个氨基酸。将来源于安徽烟草的CMV 2b基因与其它CMV 2b基因进行序列比对,结果表明,来源于安徽烟草的CMV2b基因与来源于韩国的2b基因AF033667的核苷酸序列相似性最高,达98.8%。构建2b基因系统关系树,也表明来源于安徽烟草的CMV 2b基因与AF033667亲缘关系最近。以安徽CMV 2b为模板,分别扩增大小约为300 bp的正向片段CMV 2b(r)和反向片段CMV 2b(i)。先后将反向片段CMV 2b(i)和正向片段CMV 2b(r)分别插入载体pSK-In所含intron两侧,获得重组质粒pSK-2b(r)-In-2b(i)。再将含intron的正反向片段插入pBIN438,最终得到含CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b(r)-In-2b(i)。(本文来源于《激光生物学报》期刊2010年03期）
王莉[3]（2009）在《番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因反向重复结构表达载体的转基因研究》一文中研究指出在植物抗病毒基因工程领域中,利用植物病毒本身的基因或核苷酸序列整合到植物基因组中,能够获得稳定遗传的抗病植株,这样可以克服采用常规的自然选育抗病品系的困难,这种利用基因工程的方法已经成为抗病毒研究的一种有效的手段。随着植物抗病毒研究的不断发展,RNA介导的植物抗性引起研究者的广泛关注,RNA介导的植物抗性是植物进化过程中一种古老而且保守的抗病机制,它主要是通过形成dsRNA,进而启动植物体内转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing,PTGS)体系,使目的基因mRNA发生降解,不能正常的完成翻译过程。本研究以烟草、拟南芥、番木瓜作为转化材料,利用农杆菌介导法将含有报告基因GFP的载体pGA-GFP以及CP反向重复表达载体pHellsgate_8-CP_(IR)、pHellsgate_(12)-CP_(IR)导入到受体材料中,主要研究结果如下:(1)pHellsgate_(12)-CP_(IR)表达载体转化烟草共获得120株抗性苗,用CP基因两端特异性引物P5(+),P4(-)进行PCR扩增。随机挑选了90株进行检测,其中有26株扩增出与预期目的基因一致的条带,阳性率占28.9%。用CP的正向引物P5(+)与其中一个内含子PDK的负向引物PDK(-)可以扩增总长约1700的片段,随机选取5株已经扩增出CP的pHellsgate_(12)-CP_(IR)植株进行检测,检测结果发现均能扩增出与阳性对照一致的条带。从PCR初步鉴定为阳性的pHellsgate_(12)-CP_(IR)转基因烟草中选取其中的7株进行Southern杂交检测,以碱性磷酸酶直接标记CP全长基因861bp作为杂交探针,7个转基因株系中都观察到杂交信号,进一步说明目的基因已整合到烟草基因组中。用Trizol提取pHellsgate_(12)-CP_(IR)转基因植物的总RNA,使用α-~(32)p标记的CP作为探针进行杂交,仅在含有PRSV番木瓜病样中检测到CP mRNA的表达,转基因及对照中均没有检测到CP mRNA的表达。采用摩擦接种法对所得的26株pHellsgate_(12)-CP_(IR)转基因烟草接种番木瓜环斑病毒,接种后6周观察结果:7株转基因植株在植物整个发育期没有任何明显的症状,发育正常,即转基因植株对PRSV有一定抗病性。4株转基因植株形成大小不一的枯斑,直径约为0.2～1.0cm。15株转基因植株与非转基因对照发病症状类似,叶片出现大面积黄化,8周后病症处严重坏死。(2)表达载体pGA-GFP转化烟草得到5株抗性苗,用GFP两端的特异引物G20,G21进行PCR扩增,仅一株扩增到目的带750bp,阳性率占20%,但未观察到荧光表达。(3)pHellsgate_8-CP_(IR)表达载体转化烟草共获得70株抗性苗,有待于进一步进行分子检测。(4)pHellsgate_8-CP_(IR)表达载体转化拟南芥,对拟南芥T_1代种子进行筛选,具有抗性的转化植株能够在含有50mg/L kan的培养基上正常生长,叶片较绿,根系发达,而不具有抗性的阴性植株虽然也能够发芽,但是随后就会逐渐黄化枯死。筛选获得的抗性植株有待进一步进行分子检测。(本文来源于《华中农业大学》期刊2009-06-01）
刘卓[4]（2009）在《农杆菌介导的番木瓜环斑病毒CI和NIB反向重复结构表达载体的转基因研究》一文中研究指出番木瓜环斑病毒病是番木瓜的第一大病毒性病害,到目前为止,还没有完全根治该病的方法,只能采取以栽培措施为主的综合防治措施。植物基因工程的发展为植物抗病毒的研究提供了一条新的途径,尤其是随着RNAi领域研究的快速发展,利用反向重复表达载体对植物进行遗传转化成为研究植物抗病毒研究的一大热点。将来源于病毒本身的基因导入病毒的植物寄主,均能够使植物获得一定的抗病性。本实验中使用的是来源于番木瓜环斑病毒的运动蛋白基因CI和复制酶基因NIB,本实验以烟草叶盘、番木瓜合子胚和胚性愈伤以及拟南芥花序为受体材料,用根癌农杆菌介导法进行CI基因和NIB基因反向重复结构表达载体的遗传转化,获得烟草的转基因材料和拟南芥的抗性材料,并且对于根癌农杆菌介导的烟草转化,番木瓜转化和拟南芥转化中的问题进行了讨论,同时对转基因检测的方法进行了相关的分析。本研究的主要结论如下:(1)利用含有pHellsgate-CI_(IR)载体的农杆菌转化烟草,共获得抗性植株约100株,检测的抗性植株有62株,通过PCR扩增,有14株能够扩增出CI基因的目的条带660bp,阳性率为22.5%。对经过PCR初步鉴定的阳性植株进行Southern杂交检测。以回收的PCR产物片段作为阳性对照,以未转化的烟草作为阴性对照,结果表明,抗性植株没有得到相应的杂交信号。采用摩擦接种的方法,使用番木瓜环斑病毒汁液对转基因烟草进行攻毒实验。未转化的野生型烟草分别接种病毒缓冲液PBS,番木瓜环斑病毒汁液,同时使用未接种任何汁液的未转化烟草作为对照。接种番木瓜环斑病毒汁液的未转化的野生型烟草在接种1周后出现黄化,皱缩现象,未接种病毒的未转化野生型烟草生长状态良好,接种番木瓜环斑病毒汁液的转基因烟草在接种1周后也出现少量黄化和皱缩现象,但尚未发现病毒传递现象,至于转基因烟草是否具有抗病性还有待于进一步观察和分子检测。(2)利用含有pHellsgate-Nib_(IR)载体的农杆菌转化烟草,共获得抗性植株约20株,检测的抗性植株有13株,通过PCR扩增,仅有1株能够扩增出NIB基因的目的条带740bp,阳性率为7.7%。(3)使用含有表达载体pHellsgate-Nib_(IR)的农杆菌侵染拟南芥,将拟南芥T_1代种子进行筛选后发现,对Kan霉素具有抗性的拟南芥幼苗叶片比较大,叶片较绿,根系较发达。而不抗Kan霉素的拟南芥幼苗小,根系不发达,甚至黄化死亡,获得少量拟南芥抗性植株,还有待于进一步进行分子检测。(本文来源于《华中农业大学》期刊2009-06-01）
姜玲,秦长平,伏卉[5]（2008）在《Gateway~(TM)系统快速构建番木瓜环斑病毒CP基因反向重复序列表达载体》一文中研究指出设计含有attB侧翼序列的引物,用于番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus)的外壳蛋白基因(CP)基因的PCR扩增。在BP重组酶的作用下,将CP基因与受体载体pDONRTM221发生重组反应,产生入门克隆。在LR重组酶作用下,将入门克隆与目的载体pHellsgate12发生重组反应,再进行平板培养筛选及PCR扩增和酶切反应。结果证明,用限制性内切酶XhoⅠ酶切消化后,琼脂糖凝胶电泳获得了预期长度为1700bp的重组片段;以启动子和外壳蛋白基因及外壳蛋白基因和终止子序列为基础,分别设计2对引物,经PCR扩增分别获得582和773bp片段。结果表明,获得了含有内含子的CP基因反向重复结构的表达载体。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2008年03期）
陈伟,江彤[6]（2007）在《沉默抑制子HC-Pro基因的克隆及其反向重复植物表达载体的构建》一文中研究指出采集安徽固镇感染马铃薯 Y 病毒(PVY)的烟草病样,Trizol 法提取总 RNA,根据 PVY HC-Pro 基因两侧的保守序列设计嵌套引物 HC/F1、HC/R1和 HC/F、HC/R,以 HC/R1为引物,M-MLV 逆转录得 cDNA 第一链,Nest-PCR 扩增得一特异性条带,克隆至 pMD18-T 载体,转化大肠杆菌 TG1,筛选阳性克隆并测(本文来源于《中国植物病理学会2007年学术年会论文集》期刊2007-08-01）
陈伟[7]（2007）在《CMV和TuMV病毒嵌合基因反向重复表达载体的构建及其遗传转化》一文中研究指出黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus，CMV)和芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus，TuMV)是侵染蔬菜类作物的两种主要病毒，可导致许多蔬菜作物严重减产甚至绝收。由于缺乏优良的抗源，常规育种进展非常缓慢，近年来植物基因工程和分子生物学的迅猛发展为植物抗病毒育种提供了一种有效的途径。最近的研究表明，将病毒核酸基因片段以反向重复的方式导入植物，其转录会形成具有双链结构的发夹RNA(hairpin RNA，hpRNA)，可有效地引发基因沉默现象，不但能将转基因的转录产物降解同时能使入侵的同源病毒基因组RNA降解，从而获得对相应病毒的高度抗性和高比率的抗性转基因植株。本研究首先分析了我国一些CMV分离物的CP的多态性；然后通过分子克隆的手段将CMV-2b和TuMV-CP基因保守区域组成病毒嵌合基因，以反向重复方式插入植物双元表达载体pBI 121中，成功构建了RNA干扰表达载体；随后采用农杆菌介导的Floral Dip法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)，以及组织培养途径转化“四九”菜心(Brassica campestris L．var．Parachinesis)，初步获得拟南芥、菜心转基因植株，为利用植物抗病毒基因工程培育抗多种病毒的蔬菜作物打下了基础，主要结果如下：(1)对来自国内不同地区、不同蔬菜作物8种CMV分离物(BF、BG、BH、BT、CF、GF、JF和SF)CP基因进行了克隆和测序，氨基酸序列同源性比对结果得出本研究中的8个CMV分离物均属于CMV亚组Ⅰ，与先前的血清学鉴定和利用位于RNA2上的2b基因序列进行株系亚组定位的结果相一致。但是本研究中BF和BG的CP基因序列同源性为92.8％，而在BF和BG的2b基因片段(300bp)100％同源，说明CMV的CP基因比2b基因具有较高的自然变异。为此后续研究采用CMV 2b基因来进行。(2)分别克隆CMV-2b基因保守区序列片段和TuMV-CP基因保守区序列片段，组成嵌合病毒基因片段并以反向串联重复方式转入到植物双元表达载体pBI 121，得到CMV和TuMV双抗的植物RNAi表达载体pBI TC3，并采用叁亲融合方法导入农杆菌AGL0菌株中。(3)将植物RNAi表达载体pBI TC3农杆菌菌液采用Floral Dip法转化拟南芥，得到56株阳性植株，经PCR鉴定证明外源基因成功整合到转基因植株的基因组中，从而也印证了Floral Dip法转化拟南芥有着快捷、高效和低成本的优势。(4)利用常规的农杆菌介导法将，CMV和TuMV双抗的植物表达载体转化“四九”菜心，共获得8株转基因菜心植株，平均转化率为1.6％。进一步的病毒抗性检测正在进行之中。(本文来源于《首都师范大学》期刊2007-05-25）
罗静,陈伟,庄木,李艳红,王晓武[8]（2007）在《芜菁花叶病毒CP基因反向重复植物表达载体的构建及遗传转化》一文中研究指出针对芜菁花叶病毒外壳蛋白基因构建反向重复表达载体,利用农杆菌介导法将其导入四九菜心,PCR检测共获得13个阳性转化株,遗传转化效率为2%。(本文来源于《中国蔬菜》期刊2007年02期）
反向重复表达载体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
从安徽亳州采集表现明显CMV症状的烟草样本,取ELISA检测阳性反应最强的样本提取总RNA。设计特异性引物扩增CMV RNA2部分片段,克隆并测序。其中包含的2b基因全长336个核苷酸,编码111个氨基酸。将来源于安徽烟草的CMV 2b基因与其它CMV 2b基因进行序列比对,结果表明,来源于安徽烟草的CMV2b基因与来源于韩国的2b基因AF033667的核苷酸序列相似性最高,达98.8%。构建2b基因系统关系树,也表明来源于安徽烟草的CMV 2b基因与AF033667亲缘关系最近。以安徽CMV 2b为模板,分别扩增大小约为300 bp的正向片段CMV 2b(r)和反向片段CMV 2b(i)。先后将反向片段CMV 2b(i)和正向片段CMV 2b(r)分别插入载体pSK-In所含intron两侧,获得重组质粒pSK-2b(r)-In-2b(i)。再将含intron的正反向片段插入pBIN438,最终得到含CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b(r)-In-2b(i)。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
反向重复表达载体论文参考文献
[1].胡恒.番木瓜环斑病毒（PRSV）ci和nib反向重复结构表达载体的转化研究[D].华中农业大学.2011
[2].宋培培,李爽,檀根甲,贾琳,丁菲.沉默抑制子CMV2b基因的克隆及其反向重复植物表达载体的构建[J].激光生物学报.2010
[3].王莉.番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因反向重复结构表达载体的转基因研究[D].华中农业大学.2009
[4].刘卓.农杆菌介导的番木瓜环斑病毒CI和NIB反向重复结构表达载体的转基因研究[D].华中农业大学.2009
[5].姜玲,秦长平,伏卉.Gateway~(TM)系统快速构建番木瓜环斑病毒CP基因反向重复序列表达载体[J].农业生物技术学报.2008
[6].陈伟,江彤.沉默抑制子HC-Pro基因的克隆及其反向重复植物表达载体的构建[C].中国植物病理学会2007年学术年会论文集.2007
[7].陈伟.CMV和TuMV病毒嵌合基因反向重复表达载体的构建及其遗传转化[D].首都师范大学.2007
[8].罗静,陈伟,庄木,李艳红,王晓武.芜菁花叶病毒CP基因反向重复植物表达载体的构建及遗传转化[J].中国蔬菜.2007