耐受性树突状细胞论文-郑超

导读:本文包含了耐受性树突状细胞论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:多发性硬化,实验性自身免疫性脑脊髓炎,耐受性树突状细胞,RelB

耐受性树突状细胞论文文献综述

郑超^[1]（2019）在《沉默RelB诱导的耐受性树突状细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗作用》一文中研究指出研究目的:多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病。其病因尚不明确,可能与遗传、环境及感染等多种因素相关。MS以20~40岁起病多见,全世界共有数百万人受累。目前MS的治疗以药物治疗为主,但这些非特异性的药物治疗方法仅对部分患者有效,仍有不少患者饱受无药可治的痛苦。因此,寻找特异性免疫调节方法治疗MS,是亟待解决的问题。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是MS的经典动物模型,它具有与人类MS相似的临床特点及病理特征,因此被广泛应用于MS发病机制及临床治疗的研究。树突状细胞(Dendritic cell,DC)是能够直接激活T细胞的专职抗原提呈细胞,它在获得性免疫应答的启动和进展中起到重要作用。一方面,DC在MS的发病中能够启动自身反应性免疫应答,另一方面,它还可以促进并维持免疫耐受,而后者可为MS和EAE的特异性免疫治疗提供新的靶点。RelB是核转录因子kappa B(Nuclear factor kappa B,NF-κB)家族成员之一,它在DC中大量表达并参与了DC的生长、分化和凋亡等多个过程。在NF-κB成员中,RelB与DC的分化和成熟关系最为密切,它在DC成熟的过程中表达上调。因此,本研究拟应用RelB短发夹RNA(RelB short hairpin RNA,RelB-shRNA)慢病毒载体转染DC,降低DC中RelB的表达,从而诱导出耐受性DC,并将这些转染后获得的耐受性DC经尾静脉回输给EAE小鼠,探究其对EAE的治疗作用。研究方法:1.将MOG_(35-55)肽段与完全弗氏佐剂的混合乳液皮下注射于C57BL/6小鼠的背部,并在模型建立的当天和48小时后给予每只小鼠300ng百日咳毒素腹腔注射,从而建立EAE动物模型。取小鼠股骨和胫骨中的单个核细胞,在培养基内加入白介素-4(Interleukin-4,IL-4)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF),从而诱导DC;2.于EAE小鼠DC培养的第8天,提取EAE-DC中的RNA和蛋白,检测RelB的表达量;3.在DC培养的第6天,向DC培养基中加入RelB-shRNA慢病毒载体,转染48小时后,获得耐受性DC(RelB-shRNA DC)。提取RNA和蛋白,检测转染后DC中RelB的表达量。通过流式细胞术检测细胞(分为四组:DC、RelB-shRNA DC、DC+脂多糖、RelB-shRNA DC+脂多糖)表面CD80、CD83、CD86、主要组织相容性复合物-II(Major histocompatibility complex-II,MHC-II)和程序性死亡受体-配体1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)的表达情况,并用流式微球分析技术检测细胞培养上清中TNF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-17A等细胞因子的分泌情况。4.于EAE小鼠模型建立后的第10、13、16天,将RelB-shRNA DC回输给EAE小鼠(两个对照组分别给予PBS和正常DC),观察各组的治疗效果,并比较各组小鼠血清中TNF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A等细胞因子分泌水平以及脊髓脱髓鞘情况、炎性细胞浸润情况之间的差异。研究结果:1.MOG_(35-55)肽段与完全弗氏佐剂混合乳液皮下注射,并给予百日咳毒素腹腔注射,可成功建立EAE模型。在培养基中加入IL-4和GM-CSF可将骨髓中的单个核细胞诱导成DC;2.EAE小鼠DC中RelB RNA和蛋白的表达量均较正常小鼠高;3.应用RelB-shRNA慢病毒载体转染DC可显着减少DC中RelB的表达,转染后的DC(RelB-shRNA DC)表面CD83、CD86和MHC-II的表达减少,IFN-γ的分泌水平降低,IL-2和IL-4的分泌水平增加。加入脂多糖刺激后,RelB-shRNA DC表面CD86、MHC-II的表达以及IFN-γ、IL-17A的分泌水平明显低于正常DC;4.与PBS组相比,DC组与RelB-shRNA DC组EAE小鼠的症状均明显减轻,且RelB-shRNA DC的治疗效果明显优于DC。DC组与RelB-shRNA DC组EAE小鼠脊髓中炎性细胞浸润较PBS组显着减少,与DC组相比,RelB-shRNA DC组EAE小鼠脊髓中炎性细胞浸润较少。RelB-shRNA DC组EAE小鼠脊髓脱髓鞘改变较PBS组与DC组轻。DC组EAE小鼠血清中IL-2的水平明显低于PBS组。结论:1.应用MOG_(35-55)肽段免疫C57BL/6小鼠可成功建立EAE模型;2.EAE小鼠DC中RelB的表达较正常DC高;3.体外应用RelB-shRNA慢病毒载体转染DC可诱导出耐受性DC(RelB-shRNA DC);4.RelB-shRNA DC回输能有效减轻EAE小鼠的症状,并减轻EAE小鼠脊髓中炎性细胞浸润和髓鞘脱失。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）

田娅玲^[2]（2019）在《胶原诱导性关节炎大鼠体内输注耐受性树突状细胞微嵌合状态的观察》一文中研究指出目的:观察耐受性树突状细胞(dendritic cells,DC)在输入胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠体内后能否形成微嵌合状态,探讨耐受性DC对CIA大鼠治疗干预的内在机制。方法:以CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠为实验动物。1.核因子-κB(Nuclearfactor-kappa B,NF-κB)寡核苷酸诱骗策略(oligodeoxynucleotidedecoy,ODNDecoy)诱导 CIA 雌性 SD 大鼠和正常雄性SD大鼠来源耐受性DC的构建:(1)正常雌性SD大鼠左足跖部皮内注射200μl牛二型胶原(BIIC)乳剂进行CIA模型制备;(2)取CIA雌性SD大鼠(初次免疫后第13天)和正常雄性SD大鼠脾脏单个核细胞,用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)培养为DC,经NF-κB ODN Decoy诱导为耐受性DC:(3)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源的培养细胞各分为4组;(4)DC生物学性状观察:倒置显微镜、吉姆萨染色观察细胞形态特征,台盼蓝染色计数活细胞率,流式细胞术检测大鼠DC特异性标志OX-62鉴定纯度,检测DC表面CD80、CD86分子表达情况和同种异体混合淋巴细胞反应评估耐受性DC的耐受性及其稳定程度。2.CIA大鼠体内输入耐受性DC微嵌合状态的观察:(1)制备CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源的耐受性DC,并负载BIIC,记为BIIC-Decoy DC,用DiR荧光染料标记,记为BIIC-DecoyDC(?);(2)台盼蓝染色评估细胞标记DiR荧光染料前后活细胞率,MTT实验评价BIIC-Decoy DC(?)对细胞活性的影响;(3)活体成像系统(In Vivo Imaging System,IVIS)观察BIIC-Decoy DC(?)荧光强度;(4)IVIS活体成像实验分组:A组:同种异体正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC(?),于病程第5天,尾静脉输入CIA大鼠(即病程早期CIA)体内;B组:同种异体正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC(?),于病程第20天,尾静脉输入CIA大鼠(即病程中期CIA)体内;C组:CIA大鼠自体来源BIIC-Decoy DC(?)尾静脉输入病程中期CIA大鼠体内。正常雌鼠对照(normal female control,NFc)组:同种异体正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC(?)尾静脉输入正常雌性SD大鼠体内;正常雄鼠对照(normal male control,NMc)组:正常雄性SD大鼠自体来源BIIC-Decoy DC(?)尾静脉输入正常雄性SD大鼠体内。非标记细胞对照(cell control):用无荧光标记的BIIC-Decoy DC代替标记细胞,作为A、B、C组的非标记细胞对照,记为Acc、Bcc、Ccc组。模型空白对照(model control):用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)代替标记细胞,作为A、B、C组的模型空白对照,记为Amc、Bmc、Cmc组。(5)IVIS活体成像:将上述两种来源BIIC-Decoy DC(?)经尾静脉输入各组大鼠体内后4h、24h、5day、10day、20day、25day等时间点,动态观察细胞进入大鼠体内后的迁移、分布及微嵌合状态;(6)活体成像结束后检测指标:取离体脏器进行IVIS成像;取血清检测IL-2和IFN-y;IL-4和IL-10等细胞因子水平;取踝关节作病理切片。结果:(1)耐受性DC的构建:CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源脾脏单个核细胞成功诱导为耐受性DC,其活细胞率均>94%,细胞纯度均>85%;DC表面CD80、CD86分子表达情况和同种异体混合淋巴细胞反应结果显示其耐受性具有较好的稳定程度;(2)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源的耐受性DC负载BIIC,成功构建BIIC-Decoy DC,标记DiR荧光染料,记为BIIC-Decoy DC(?);(3)台盼蓝染色:DiR荧光染料标记前后BIIC-Decoy DC活细胞率均在95%左右;(4)MTT实验:结果显示DiR荧光染料标记上述两种来源BIIC-Decoy DC后,对其细胞活性无影响;(5)IVIS成像检测结果显示DiR荧光染料成功标记上BIIC-Decoy DC,且荧光强度随细胞数量增加而增强;(6)IVIS活体成像结果:荧光信号主要集中在胸腹部,随成像时间延长可向其他部位迁移,如四肢关节;荧光强度随成像时间延长而逐渐降低;荧光信号多以24h达高峰,最长观察至第35天,仍可见荧光信号;(7)离体器官IVIS成像结果:荧光信号主要集中在肺脏、脾脏和淋巴结中,以肺脏荧光信号最强,肝脏、心脏和肾脏荧光信号相对较弱;(8)血清细胞因子水平检测:在病程早期和病程中期CIA大鼠模型组中,IFN-γ、IL-2等Th1型细胞因子表达水平较高,IL-10、IL-4等Th2型细胞因子较低;而在病程早期和病程中期CIA大鼠治疗组中,IFN-γ、IL-2等Th1型细胞因子表达明显降低,IL-10、IL-4等Th2型细胞因子表达明显升高;(9)踝关节病理结果:CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC对病程早期CIA和病程中期CIA大鼠均显示出良好的治疗效果。结论:(1)改良DC提取方法,获得CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源耐受性DC纯度均>85%;(2)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC对病程早期CIA和病程中期CIA大鼠均具有较好的治疗效果;(3)利用IVIS成像系统动态观察DiR荧光染料标记CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC经尾静脉输入CIA大鼠体内后,广泛分布于肺脏、脾脏、淋巴结等组织,持续至第35天仍可检测到荧光信号,初步判断微嵌合状态形成。血清细胞因子水平检测结果显示微嵌合状态形成的同时,体内细胞因子格局由Th1向Th2方向偏移,有利于免疫耐受的形成。(本文来源于《贵州医科大学》期刊2019-05-30）

韩旭^[3]（2019）在《米诺环素通过LPS-TLR4/NF-κB信号通路诱导耐受性树突状细胞产生》一文中研究指出目的:树突状细胞(Dendritic cell,DC)是专职抗原提呈细胞,并且在多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)以及动物模型的发生发展中起关键作用。近来,随着对DCs的深入研究,DCs不仅在启动免疫反应中起着关键作用,它本身也有维持外周免疫耐受、调节免疫反应的作用,因此提出了耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells,tolDCs)的概念。最近研究发现在米诺环素存在的条件下小鼠骨髓源性树突细胞显示出tolDCs的特征,并且其树突细胞的数量高于对照组,尤其表现出不成熟的DCs特征,不易于被脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导成熟。目前米诺环素诱导耐受性树突状细胞的机制不清。在本研究中通过米诺环素诱导tolDCs,检测米诺环素是否是通过阻断LPS-TLR4/NF-κB信号传导通路进而增加树突状细胞耐受性,为米诺环素治疗多发性硬化方面提供更加切实有效的证据。方法:1.将小鼠骨髓源性树突状细胞(bone marrow-derived cell,BMDC)进行体外培养。应用改良Son方法将小鼠BMDC进行体外培养,且分成3组:LPS-DC:于体外培养至第6天的BMDC用LPS(1μg/ml)刺激24h,诱导未成熟树突状细胞成为成熟树突状细胞。Mino-DC:于体外培养至第0天、第2天和第4天的BMDC加入5μm的米诺环素,培养至第6天用LPS(1μg/ml)刺激24h,诱导未成熟树突状细胞成熟。Ctrl-DC:于体外培养至第7天的BMDC,不进行药物干预以获取第7天未成熟的DC。将上述3组细胞培养至第2天时进行半量换液,培养至第4天时进行全量换液,并且每次换液时补充10ng/ml IL-4和GM-CSF。2.单向混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR)。将源于C57BL/6小鼠以上3组细胞作为刺激细胞,应用CD11c MACS进行分离纯化。将Balb/c小鼠的纯化CD4~+T细胞作为反应细胞。将刺激细胞与反应细胞的以不同比例细胞混合培养在96孔板中,混合培养共达72 h,按说明书要求加入CCK-8试剂。3.应用荧光倒置显微镜和扫描电镜观察细胞的形态,应用透射电镜观察细胞内的超微结构。4.进行流式细胞学检测。培养至第7天时分别收集以上3组细胞,调整细胞浓度,分别加入流式抗体进行染色,4℃避光孵育30 min,等待上机检测。5.分别取以上各组细胞,提取细胞总蛋白,用10%SDS聚丙烯酰胺胶进行电泳;低温转膜,封闭,一抗孵育过夜。第二日,二抗孵育1h,扫膜显影,再定影。6.双抗体夹心酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测培养至第7天的各组细胞上清中IL-12p70、TNF-α和IL-10水平。7.应用SPSS 21.0进行统计学分析。结果:1.Ctrl-DC组与Mino-DC组的细胞形态相似,为类圆形,突起稀疏又短小。而LPS-DC组的细胞形态则是不规则,并且表面皱褶层迭多而深大,突起较大、稠密又长,似树枝状。2.与LPS-DC组相比,Mino-DC组细胞胞质内高尔基体、内质网、线粒体等细胞器比较少。3.流式细胞学检测细胞表面分子Mino-DC组中细胞表达的CD80和CD86水平是介于未成熟Ctrl-DC组与成熟LPS-DC组之间(P<0.01)。与LPS-DC组相比Mino-DC组细胞表面分子MHC II表达则类似(P>0.05)。4.使用混合淋巴细胞反应测定法分析Mino-DC组引发同种异体T细胞的能力。结果表明LPS-DC组可有效诱导同种异体T细胞的增殖。在DC与T细胞比率为1:5时观察到最大刺激活性(P<0.01)。然而,Mino-DC的同种刺激活性介于Ctrl-DC与LPS-DC之间(P<0.05)。5.LPS诱导的Mino-DC中TLR4(P<0.01)、NF-κB-p65(P<0.05)蛋白的表达水平低于LPS-DC和Ctrl-DC。而IκB-α(P<0.01)表达水平高于其余两组。6.用ELISA检测3组细胞分泌的细胞因子水平。Mino-DC组分泌致炎性细胞因子如IL-12p70、TNF-α的水平介于LPS-DC组和Ctrl-DC组之间(P<0.01),IL-10比其余两组都高(P<0.01)。结论:1.米诺环素可能抑制BMDC的成熟,使其处于半成熟状态,并抑制T细胞增殖。2.米诺环素通过阻断LPS-TLR4/NF-κB信号传导通路进而增加树突状细胞耐受性。(本文来源于《河北医科大学》期刊2019-03-01）

董斌,张兵,封亚萍,韩彦博,杨新华^[4]（2018）在《VEGF诱导致耐受性树突状细胞对口腔鳞状细胞癌患者T细胞免疫功能的影响》一文中研究指出目的探讨口腔鳞状细胞癌微环境中的血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导致耐受性树突状细胞(DC)对T细胞增殖活性和免疫功能的影响。方法体外培养SCC-4口腔鳞癌细胞株,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测SCC-4细胞培养上清中VEGF的相对表达量;采用流式细胞术(FCM)检测DC表面特异性分子的表达情况;采用混合淋巴细胞反应(MLR)检测各组DC对同种异源T细胞增殖活性的影响;采用FCM检测未成熟DC中总吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)和程序性死亡受体配体1(PDCD1LG1,也称PD-L1)的表达情况。结果培养72 h后,SCC-4细胞培养上清中VEGF的相对表达量高于24、48 h时SCC-4细胞培养上清中VEGF的相对表达量(P﹤0.05)。与空白对照组比较,VEGF组、共培养组和抗VEGF组DC表面特异性分子CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表达水平及细胞培养上清中IL-12的表达水平均有所降低(P﹤0.05);但是,共培养组和抗VEGF组DC表面特异性分子的表达水平却均稍高于VEGF组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。在相同比例下,T细胞对照组和抗VEGF组未成熟DC刺激T细胞的增殖活性均高于VEGF组和共培养组,且T细胞对照组刺激T细胞的增殖能力高于抗VEGF组(P﹤0.05)。与T细胞对照组比较,VEGF组、共培养组和抗VEGF组中未成熟DC表面IDO和PD-L1的表达水平均有所升高(P﹤0.05),而共培养组未成熟DC表面IDO和PD-L1的表达水平最高。抗IDO组、抗PD-L1组和抗IDO+PD-L1组未成熟DC刺激T细胞的增殖活性均高于T细胞对照组(P﹤0.05);其中,抗IDO+PD-L1组未成熟DC刺激T细胞的增殖活性最高。结论肿瘤微环境中的VEGF通过刺激IDO和PDL1的表达,抑制小鼠髓样DC的分化,使其成为致耐受性DC,从而抑制T细胞免疫功能。(本文来源于《癌症进展》期刊2018年09期）

何楚琳^[5]（2018）在《神经肽—氧化石墨烯诱导耐受性树突状细胞抑制急性移植物抗宿主病及其机制研究》一文中研究指出目的:构建急性移植物抗宿主病(acute Graft-Versus-Host-Disease,a GVHD)小鼠模型并评价过继性输注雷帕霉素(rapamycin,RAPA)体外诱导的耐受性树突状细胞(dendritic cells,DCs)治疗a GVHD的效果。方法:以BALB/C(H-2Kd)为供体,C57BL/6J(H-2Kb)为受体建立a GVHD小鼠模型(BALB/C→C57BL/6J);以小鼠来源的骨髓细胞经体外培养获得DCs,加入RAPA诱导其为耐受性DCs(RAPA-t DCs);将RAPA-t DCs经尾静脉过继性输注至a GVHD模型小鼠,建立活体荧光成像可观察的DCs体内示踪模型并被研究萤火虫荧光素酶报告基因标记的DCs在a GVHD小鼠体内的迁移、归巢模式;记录各组小鼠的平均体重波动并统计其生存率状况,评价RAPA-t DCs抑制小鼠a GVHD的效果。结果:与PBS对照组比较,RAPA能明显抑制DCs表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCII表达水平,且使表达DCs表面趋化因子受体CCR1(14.5±1.4 vs.10.0±2.1)、CCR5(12.7±2.3 vs.7.2±1.2)表达下调,而对CCR7(7.8±1.3 vs.6.2±2.5)的表达没有显着影响。成像结果显示,RAPA处理对DCs在体迁移能力无显着影响,RAPA-t DCs仍然具有归巢至淋巴结、脾脏等淋巴组织或器官的能力。最后,与PBS-DCs对照组比较,实验组a GVHD小鼠体重下降趋势明显放缓(-2.4±1.5 vs.-1.9±1.2,P<0.05),且其生存期延长(10.1±5.5 vs.16.6±6.7,P<0.05),但整体存活率无显着性差异。结论:a GVHD小鼠模型构建成功。RAPA能通过抑制DCs表面共刺激分子的表达从而诱导DCs耐受,过继性输注的RAPA-t DCs仍具有一定的T细胞富集区归巢能力且能够一定程度缓解a GVHD,延长小鼠的生存期,但没有改善其整体存活率。目的:通过研究纳米材料氧化石墨烯(graphene oxide,GO)对小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,im DCs)共刺激分子、趋化因子受体表达水平及炎症应答能力,探讨GO对im DCs在体迁移及归巢能力的影响并研究其机制,为设计和应用氧化石墨烯-神经肽复合物诱导耐受性DCs治疗a GVHD提供实验数据与理论依据。方法:对叁种不同片径GO进行表征,GO体外与小鼠骨髓来源im DCs共孵育48 h,将不影响细胞增殖的最高剂量确定为GO的工作浓度;酶联免疫吸附法(ELISA)检测GO处理im DCs后细胞因子分泌水平;流式细胞术检测DCs共刺激分子、趋化因子受体表达水平和活性氧(ROS)含量;收集GO处理后的im DCs,并经脚垫过继性输注给小鼠,BLI监测细胞迁移速度及归巢模式;细胞免疫荧光法染色并比较各组im DCs微丝和微管的状态和分布。结果:(1)应用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射仪(DLS)、Zeta电位测试仪和原子力电镜(AFM)对叁种片径尺寸GO纳米材料进行表征,发现叁种GO均为单层氧化石墨烯材料,其厚度约1-2 nm,根据其片径尺寸分别将其命名为S(small,约为50-200 nm)、M(medial,约为200-500 nm)和L(large,约为500-1500 nm)。(2)不同片径GO与DCs共孵育体系中细胞存活率均高于90%的最大GO浓度为15.6μg/ml,因此以15.6μg/ml为本研究中GO处理DCs的工作浓度。(3)TEM下观察到GO能在体外被DCs摄取,不同片径GO被DCs内吞的模式有差异。(4)Ctrl-DCs对照组im DCs表面CD40、CD80及CD86的表达丰度分别为(44.27±3.46)%、(32.67±1.70)%及(32.73±1.52)%;S-DCs组表面CD40、CD80及CD86的表达丰度分别为(53.43±0.55)%、(34.93±1.01)%及(43.83±4.01)%;M-DCs组im DCs的共刺激分子CD40、CD80及CD86的表达丰度分别为(54.43±2.48)%、(45.10±4.19)%及(47.97±0.85)%;L-DCs组则为(57.13±2.70)%、(46.93±0.86)%及(49.97±0.76)%,表明GO刺激im DCs后,其表面共刺激分子CD40、CD80以及CD86表达率均较Ctrl-DCs组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)S-DCs、M-DCs、L-DCs组分泌的IL-6(分别为42617.02±341.24 pg/m L、51709.04±10.78 pg/m L、48080.82±4856.53 pg/m L)均高于Ctrl-DCs组(37361.91±5357.26 pg/m L),S-DCs、M-DCs、L-DCs组分泌的IL-1β(分别为1683.46±74.01 pg/m L、1655.18±24.74 pg/m L、1424.51±95.88 pg/m L均低于Ctrl-DCs组(1958.28±81.75 pg/m L),S-DCs、M-DCs、L-DCs组分泌的TNF-α(分别为75771.43±1924.05 pg/m L、83261.90±1716.77 pg/m L、73084.24±883.93 pg/m L均低于Ctrl-DCs组(81662.73±2249.19 pg/m L),IL-12p70浓度(分别为66.67±2.01 pg/m L、57.54±8.99 pg/m L、64.38±5.97 pg/m L)均低于Ctrl-DCs对照组(80.74±4.11 pg/m L),上述差异均有统计学意义(P<0.05)。(6)S-DCs组和L-DCs组CXCR4表达丰度(分别为35.47±1.92、31.48±1.01)%明显高于Ctrl-DCs组(24.94±0.65)%,S-DCs组、M-DCs组和L-DCs组CCR7表达丰度(分别为20.00±2.53、13.04±1.89、14.43±3.71)%明显高于Ctrl-DCs组(10.45±1.89)%,差异有统计学意义(P<0.05)。(7)脚垫输注迁移模型中,S-DCs组、L-DCs组、M-DCs组及Ctrl-DCs组DCs在48 h迁移到PLN的百分比分别为(0.17±0.02 vs.0.12±0.06 vs.0.11±0.05 vs.0.07±0.01),72 h迁移到PLN的百分比分别为(0.24±0.05 vs.0.16±0.09 vs.0.15±0.05 vs.0.08±0.02),组间均有统计学差异(P<0.05),说明迁移速率顺序为S-DCs>L-DCs>M-DCs>Ctrl-DCs。(8)共聚焦显微镜观察结果显示,GO处理过的im DCs细胞延展性更高,细胞间黏附现象较明显,并伸出大量丝状伪足,呈放射状朝四周排列,其中S-DCs组这一现象更为明显。而对照组细胞支架可变性较差,细胞间缺乏黏附。(9)流式细胞仪检测不同片径GO处理DCs体系ROS产生情况:S-DCs、M-DCs、L-DCs组产生的ROS平均荧光强度分别为274.52±13.44,244.51±7.78,243.53±27.58,均高于Ctrl-DCs组(165.51±10.62),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:采用不同片径GO处理im DCs,其表面共刺激分子CD40、CD80和CD86表达均上调,IL-6分泌明显上调,IL-1β、TNF-α和IL-12p70分泌受到抑制;GO显着上调CXCR4和CCR7的表达;活体成像结果显示,GO处理后DCs自脚垫迁移至腘窝淋巴结的速度相比对照组约提升1.5-3倍,迁移速率最快的是50-200 nm即小尺度GO处理的DCs;共聚焦显微镜下观察到GO处理后DCs微丝、微管重排及黏附现象明显,且能促进共孵育体系中活性氧的产生。由上述实验结果推测,GO促进DCs产生的ROS增强了DCs细胞支架重排和粘附现象,最终提升了DCs迁移及归巢能力。目的:以BALB/C(H-2Kd)为供体,C57BL/6J(H-2Kb)为受体,结合活体成像平台建立可视化a GVHD小鼠模型(BALB/C→C57BL/6J);设计并应用神经肽-氧化石墨烯体外诱导耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells,t DCs),经尾静脉过继性输注至a GVHD模型小鼠,评价其抑制小鼠a GVHD的效果。方法:酶联免疫吸附法(ELISA)检测四种神经肽处理im DCs在低剂量LPS刺激下细胞因子分泌水平,筛选出效果更优的神经肽UCN,并将其与GO偶联,监测复合物抑制DCs分泌促炎细胞因子情况,流式细胞术检测体系共刺激分子表达水平;CFSE标记BALB/C小鼠来源的T细胞,按比例与UCN-DCs或Ctrl-DCs混合培养72 h后,流式细胞仪检测T细胞增殖水平;收集各组UCN-GO处理后的im DCs,并经脚垫过继性输注给小鼠,BLI监测体内DCs细胞分布、迁移及归巢模式;将UCN-GO-DCs经尾静脉过继性输注至a GVHD模型小鼠,活体荧光成像观察萤火虫荧光素酶报告基因标记的T细胞在a GVHD小鼠体内增殖情况即a GVHD治疗效果。结果:(1)低剂量LPS刺激下比较四种神经肽抑制DCs分泌促炎细胞因子的能力:UCN-DCs组分泌的促炎类细胞因子IL-12p70(63.55±9.19pg/m L vs.102.92±10.78 pg/m L)、IL-6(2386.76±524.44 pg/m L vs.27370.14±1640.17 pg/m L)、IL-1β(1248.70±34.33 pg/m L vs.1574.46±37.39 pg/m L)、TNF-α(27568.09±2706.38 pg/m L vs.35040.75±892.64 pg/m L)浓度均低于LPS-DCs对照组,P<0.05,因此选用UCN诱导t DCs。(2)UCN-DCs组相比对照组im DCs表面共刺激分子的表达丰度CD40(55.03±3.87 vs.65.38±1.62)%、CD80(70.38±2.30 vs.77.10±2.56)%、CD86(70.30±2.37vs.73.90±3.49),均明显下调,P<0.05。(3)DCs与T细胞2:1、4:1以及8:1混合培养时UCN-DCs组CFSE标记的T细胞增殖的百分比(22.89±2.49 vs.48.10±1.53)%、(1.92±1.42 vs.59.81±1.86)%、(5.94±0.77 vs.35.40±2.20)%均低于Ctrl-DCs组,P<0.05。(4)偶联UCN后,7.8μg/ml浓度下S-DCs组和L-DCs组的细胞存活率均高于90%,因此本研究中选用7.8μg/ml为GO工作浓度。(5)UCN与小片径GO的偶联效率高于?-MSH、VIP和AM,分别为(89.33±1.53 vs.76.00±2.65 vs.47.33±1.15 vs.36.00±2.01)%,与大片径GO的偶联效率也高于其他组,分别为(86.33±1.53 vs.55.67±0.58 vs.35.33±2.08 vs.32.67±1.73)%,P<0.05。(6)给予低剂量LPS刺激后,UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组分泌的促炎类细胞因子浓度均低于UCN-DCs组,分别为IL-12p70(61.85±4.99 pg/m L vs.61.03±0.52pg/m L vs.68.99±3.91 pg/m L)、IL-6(19935.66±1286.64 pg/m L vs.22733.32±5396.41 pg/m L vs.30440.11±1655.73 pg/m L)、IL-1β(1395.66±62.12pg/m L vs.1394.44±62.12 pg/m L vs.1566.65±13.82 pg/m L)、TNF-α(64292.69±1278.26 pg/m L vs.61986.79±2537.94 pg/m L vs.71771.30±883.27 pg/m L),P<0.05。(7)活体成像软件分析由脚垫迁移至PLN的DCs比例:Ctrl-DCs组DC在24 h、48 h、72 h迁移到PLN的百分比分别为(0.04±0.02)、(0.07±0.02)、(0.09±0.02),UCN-DCs组在24 h、48 h、72 h迁移到PLN的百分比分别为(0.06±0.03)、(0.10±0.05)、(0.11±0.01),UCN-S-DCs组在24 h、48 h、72 h迁移到PLN的百分比分别为(0.10±0.06)、(0.11±0.02)、(0.15±0.02),UCN-L-DCs组在24 h、48 h、72 h迁移到PLN的百分比分别为(0.22±0.07)、(0.23±0.07)、(0.23±0.04);其中UCN-L-DCs组DC在24 h、48 h、72 h迁移到PLN的百分比均高于UCN-DCs组和Ctrl-DCs组,且其在72 h百分比高于UCN-S-DCs组;UCN-S-DCs组在48 h、72 h迁移到PLN的百分比高于UCN-DCs组和Ctrl-DCs组,P<0.05。综上,脚垫迁移模型中,不同处理方式DCs的迁移速率顺序为:UCN-L-DCs>UCN-S-DCs>UCN-DCs>Ctrl-DCs/S-DCs/L-DCs(ns:叁者无明显差异)。(8)T细胞可视化a GVHD小鼠模型监测UCN-DCs抑制T细胞增殖的效果:在移植第6天时,各组小鼠体内总荧光强度均低于BM+Tc组(8.18?108±3.06?107),Ctrl-DCs组、S-DCs组、L-DCs组受鼠体内总荧光强度分别为(1.23?108±1.54?107)、(1.29?108±1.41?107)、(1.47?108±1.41?107),UCN-DCs组、UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组受鼠体内总荧光强度分别为(5.19?107±1.47?106)、(1.28?107±4.00?105)、(2.33?107±2.25?106);其中,UCN-DCs组总荧光强度低于Ctrl-DCs组,UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组总荧光强度低于UCN-DCs组,差异有统计学意义,P<0.05,Ctrl-DCs组、S-DCs组和L-DCs组间无统计学差异,P>0.05。结论:UCN抑制DCs分泌促炎细胞因子能力显着高于另外3种神经肽,故选用UCN诱导t DCs进行后续实验。进一步研究发现UCN能明显抑制DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达,即UCN-DCs成熟度降低,暗示其激活T淋巴细胞的能力可能下降。CFSE-T细胞增殖实验表明UCN-DCs能诱导T细胞沉默,抑制其增殖。采用不影响DCs增殖的工作浓度即7.8?g/ml的GO与UCN高效偶联(偶联率约89%)后处理im DCs,体系细胞因子表达水平分析表明不同片径GO载体能有效递送UCN,并进一步增强其抑制DCs分泌促炎细胞因子的能力。后续脚垫输注模型及可视化模型数据显示,UCN-GO促进了DCs的局部迁移能力,初步证明其能有效地抑制T细胞在a GVHD小鼠体内增殖。综上,本研究为UCN-GO复合物诱导耐受性DCs抑制a GVHD提供了基础的实验数据和科学依据,具备潜在应用价值,可为临床转化提供参考。(本文来源于《广西医科大学》期刊2018-05-01）

何楚琳,周欠欠,张玉龙,赵嫚,马聪^[6]（2018）在《雷帕霉素诱导耐受性树突状细胞抑制急性移植物抗宿主病的动物实验》一文中研究指出目的探讨雷帕霉素(RAPA)诱导过继性输注的耐受性树突状细胞(DCs)对急性移植物抗宿主病(a GVHD)的治疗效果。方法分离15只BALB/C雄性小鼠(MHC为H-2Kd)的骨髓细胞及脾细胞,输注入经8.5Gy辐射处理(TBI照射)的30只雄性C57BL/6J小鼠(MHC为H-2Kb)中建立a GVHD模型(BALB/C→C57BL/6J);为验证a GVHD造模是否成功,将C57BL/6J小鼠分为MHC不合移植组、MHC相合移植组及单纯TBI照射组(10只/组),3组小鼠经8.5 Gy TBI照射后分别输入BALB/C来源骨髓细胞及脾细胞、C57BL/6J来源骨髓细胞及脾细胞及同等体积PBS对照,采用流式细胞术检测供鼠植入比例并观察受鼠存活情况。体外培养受鼠骨髓来源DCs,加入RAPA以诱导耐受性DCs(RAPA-t DCs),加入PBS作为对照DCs(PBS-DCs)。将a GVHD模型鼠随机分为3组(10只/组),分别是RAPA-t DCs实验组(静脉输注RAPA-t DCs 4!106/只)、PBS-DCs对照组(静脉输注PBS-DCs 4!106/只)及PBS对照组(静脉输注PBS);采用活体荧光成像观察DCs在a GVHD小鼠体内的迁移、分布情况;同时监测3组小鼠的平均体重波动并统计生存率,评价RAPA-t DCs对小鼠a GVHD的抑制效果。结果流式细胞术检测:与PBS-DCs组小鼠比较,RAPA-t DCs组小鼠DCs表面的CD40、CD80、CD86和MHCII表达丰度明显受到抑制(P<0.05);2组小鼠DCs表面趋化因子受体CCR1平均荧光强度(MFI)为14.5±1.4 vs.10.0±2.1,表面趋化因子受体CCR5为12.7±2.3 vs 7.2±1.2(P<0.05),表面趋化因子受体CCR7为7.8±1.3 vs.6.2±2.5(P>0.05)。活体成像分析:RAPA处理不影响DCs在体迁移能力,RAPA-t DCs仍可归巢至淋巴结、脾脏等淋巴组织或器官。PBS-DCs组和RAPA-t DCs组a GVHD小鼠在移植后19 d体重(g)下降-2.4±1.5 vs-1.9±1.2(P<0.05),生存期(d)延长10.1±5.5 vs 16.6±6.7(P<0.05),但各组小鼠最终均全部死亡,整体生存率无差异。结论 RAPA可通过抑制小鼠DCs表面共刺激分子的表达诱导DCs耐受,过继性RAPA-t DCs仍具备一定的T细胞富集区归巢能力;过继性输注RAPAt DCs可一定程度缓解小鼠a GVHD,延长小鼠生存期,但对其整体存活率无明显改善。(本文来源于《中国输血杂志》期刊2018年03期）

郑超,谢忠祥,吴静,朱珊,金涛^[7]（2017）在《1,25(OH)2D3诱导的耐受性树突状细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗作用及机制》一文中研究指出背景:树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一种是专职的抗原提呈细胞,它在在多发性硬化(multiple sclerosis,MS)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的发病过程中起重要。耐受性的DC是一种特殊类型的DCs,具有免疫调节作用。耐受性DCs可由多种免疫调节因子在体外诱导而成,对MS具有潜在的治疗价值。维生素D缺乏是导致MS发病的环境危险因素之一。因此,本研究中我们应用维生素D的活性形式1,25(OH)_2D_3诱导出耐受性DCs,并将其回输给已发病的EAE小鼠,探究其对EAE小鼠的治疗效果及机制。目的:观察1,25(OH)_2D_3诱导的耐受性DCs对EAE小鼠的治疗作用并探究其治疗机制。方法:本研究在培养DCs的过程中加入了1,25(OH)_2D_3,并将诱导出的耐受性DCs回输给已发病的EAE小鼠。我们通过对EAE小鼠的症状评分来观察耐受性DCs的治疗效果。在探究治疗机制方面,我们应用免疫荧光技术检测Th1和Th17细胞在小鼠脊髓中的浸润情况,并通过流式细胞术检测脾脏和淋巴结中Treg细胞、Breg细胞、CD4~+IL-10~+T细胞、Th1和Th17细胞的比例。此外,我们还分别应用了CBA、ELISA检测了血清中细胞因子和IgG的分泌水平。结果:我们发现,回输1,25(OH)_2D_3诱导的耐受性DCs能够明显减轻EAE小鼠的发病症状。与此同时,耐受性DCs回输治疗后的EAE小鼠脊髓中Th1和Th17细胞的浸润显着减少,脾脏和淋巴结中Treg细胞、Breg细胞和CD4~+IL-10~+T细胞的比例有所上升。然而,耐受性DCs治疗组的EAE小鼠脾脏和淋巴结中Th1和Th17细胞的比例、血清中炎性细胞因子和IgG的分泌水平均较对照组有显着高。结论:1,25(OH)_2D_3诱导的耐受性DCs能够有效地减轻EAE小鼠的发病症状。回输耐受性DCs后,EAE小鼠脾脏和淋巴结中Treg细胞、Breg细胞和CD4~+IL-10~+T细胞的比例上升。然而,虽然耐受性DCs治疗组小鼠脊髓中Th1和Th17细胞的浸润减少,但其脾脏和淋巴结中Th1和Th17细胞的比例却有明显升高,因此,我们推测耐受性DCs可能通过抑制外周的Th1和Th17细胞向中枢迁移来减轻EAE小鼠症状。(本文来源于《第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编》期刊2017-10-26）

曹青青^[8]（2017）在《Breg、PD1、PDL1通过耐受性树突状细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的治疗作用及机制》一文中研究指出研究背景及目的意义:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是中枢神经系统慢性炎症性自身免疫疾病,以脑和脊髓的轴突破坏及髓鞘脱失为主要病理特点。MS患者临床表现的严重程度不一,重者可致身体残疾,极大程度地降低患者的生活质量。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是MS基础实验研究常用的动物模型。树突状细胞(dendritic cell,DC)作为专职的抗原提呈细胞,在MS的发病过程中起重要作用。耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cell,t DC)是一种特殊类型的DC,通过诱导调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的形成和促进抑炎因子的分泌,对MS具有潜在的治疗价值。程序性死亡受体(programmed death 1,PD1)和程序性死亡配体1(programmed death ligand 1,PDL1)属于B7超家族,通过发挥负性调节的作用在MS的发病过程中起一定的治疗作用。调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)是B细胞的一种,可通过分泌抑炎因子在MS的发病过程中起抑制疾病发展的作用。1,25(OH)2D3是一种免疫调节剂,能够有效诱导t DC(VD3-DC)的形成,并将所诱导VD3-DC回输给发病的EAE小鼠后可发挥一定的治疗作用。本实验课题拟在体外先诱导骨髓来源的单核细胞成为DC,后经过具有免疫调节作用的1,25(OH)2D3诱导形成VD3-DC,检测正常DC和VD3-DC表面PDL1的表达,后将正常DC和VD3-DC回输给已发病的EAE小鼠:(1)观察回输治疗后EAE小鼠临床症状的变化;(2)检测脾脏和淋巴结T细胞表面PD1的表达;(3)检测脾脏和淋巴结B细胞中Breg的比例;(4)采用HE和LFB染色观察小鼠脊髓内炎性细胞浸润以及脱髓鞘病变情况。进而探究Breg、PD1、PDL1通过1,25(OH)2D3诱导的VD3-DC在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的治疗作用及机制。研究方法:(1)用MOG35-55加完全弗氏佐剂(complete freund's adjuvant,CFA)的混合乳液,经背部皮下注入C57BL/6小鼠中,于免疫当天和2天后分别经腹腔注射百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)建立EAE动物模型;(2)培养基内分别加入白介素-4(interleukin-4,IL-4)和粒细胞巨噬细胞刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)(各10ng/ml)来刺激小鼠股骨和胫骨骨髓来源的单个核细胞诱导DC。诱导DC的同时在其培养基内加入1,25(OH)2D3(10-8M)来诱导形成VD3-DC。然后分别向正常DC、VD3-DC中加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激24h,促进其成熟,通过流式细胞术检测DC和VD3-DC表面PDL1的表达;(3)将EAE小鼠分为叁组,在DC/VD3-DC诱导的第8天,用MOG抗原孵育4小时后,将MOG抗原洗尽,分别将PBS、DC和VD3-DC经尾静脉回输给EAE小鼠(EAE小鼠诱导第10、13、16天),观察各组小鼠临床症状变化;(4)在回输治疗发病高峰期,分离经过回输治疗后的EAE小鼠脾脏和淋巴结细胞,通过流式细胞术检测细胞表面PD1的表达及Breg的比例;(5)在回输治疗发病高峰期,分离小鼠脊髓,通过苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)和卢克斯快蓝染色(luxol fast blue,LFB),观察对比治疗前后EAE小鼠脊髓炎性细胞的浸润和髓鞘脱失情况。研究结果:(1)根据我们前期实验可知,通过相同的实验方法可以成功诱导出EAE小鼠动物模型和VD3-DC。本实验通过流式细胞术检测可知与正常DC相比,VD3-DC表面PDL1的表达增多,且差异具有统计学意义;(2)与PBS对照组相比,DC和VD3-DC回输给EAE小鼠,可有效减轻其临床症状,且VD3-DC的效果更显着;(3)与PBS对照组相比,VD3-DC组和DC组脾脏和淋巴结T细胞表面PD1的表达均增加,且有统计学意义;但VD3-DC组和正常DC组之间PD1的表达差异无统计学意义;(4)与PBS对照组相比,VD3-DC组脾脏B细胞表面Breg(CD19+CD5+CD1d+)的比例显着增加,而正常DC组脾脏B细胞中Breg的比例减少,差异无统计学意义;同时VD3-DC组和正常DC组淋巴结B细胞中Breg的比例均有所增加,但差异无统计学意义;(5)根据HE和LFB染色可知,与PBS对照组相比,DC和VD3-DC回输EAE小鼠后,可降低小鼠脊髓炎性细胞浸润和髓鞘脱失程度,且以VD3-DC作用更显着。结论:(1)VD3-DC细胞表面PDL1的表达增加;(2)VD3-DC回输EAE后可有效减轻其临床症状;(3)VD3-DC回输可增加EAE小鼠脾脏和淋巴结B细胞中Breg的比例以及脾脏和淋巴结T细胞表面PD1的表达;(4)VD3-DC回输EAE后可显着降低脊髓内炎性细胞浸润和髓鞘脱失程度。(本文来源于《吉林大学》期刊2017-05-01）

张明明^[9]（2017）在《γδTreg诱导免疫耐受性树突状细胞在移植物抗宿主病中的作用及机制研究》一文中研究指出背景:异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗恶性血液系统疾病的有效手段,急性移植物抗宿主病(aGVHD)成为阻碍移植成功的关键因素之一。目前aGVHD的最主要预防和治疗手段为免疫抑制药物,但容易导致移植后感染风险增加;体内外去除T细胞是另一种常用的策略,但也伴随着植入失败、移植后复发率增高等风险。近年来越来越多的免疫细胞亚群被发现在aGVHD调控中起重要作用,过继免疫细胞输注调控aGVHD具有较好的临床应用前景。调节性γδT细胞(γδTreg)是新发现的γδT细胞亚群,该细胞亚群具有与Foxp3+αβTreg细胞相似的生物学特性,发挥负向免疫调控功能。我们前期建立了高效的γδTreg体外诱导扩增富集体系,并发现该群细胞能负向调控小鼠allo-HSCT后aGVHD但不影响GVL效应,但机制尚未完全明确。通过细胞间接触的方式抑制T细胞的增殖活化是其中的机制之一。进一步阐明γδTreg负向调控aGVHD的完整机制将为其临床应用奠定基础。抗原提呈细胞树突状细胞(DC)在aGVHD发生发展的病理生理过程中起重要作用。DC在预处理后活化,活化后的DC处理并递呈宿主抗原给供者来源的T细胞,并进一步通过共刺激分子信号使得T细胞活化和增殖,这是aGVHD起始阶段的关键事件。近年来通过诱导免疫耐受性DC的生成是aGVHD治疗中重要的研究方向。αβTreg与免疫耐受性DC之间有互相诱导生成的作用,两者共同参与维持移植后的免疫耐受。因此,我们推测γδTreg诱导免疫耐受性DC的生成是其发挥负向调控aGVHD的机制之一。在本研究的前两部分,我们首先在体外研究了γδTreg诱导免疫耐受性DC的生成,包括对DC成熟、吞噬、刺激活化T细胞、黏附、迁移等功能影响,并探讨了可能的机制;进一步在人源化小鼠aGVHD模型体内环境中验证了 γδTreg诱导免疫耐受性DC是其发挥负向调控aGVHD作用的机制之一。另一方面,目前关于Foxp3+γδTreg的研究都是采用富集了 γδTreg的γδT混合细胞,但这不能完整反映Foxp3+γδTreg的真实生物学功能。目前尚未发现Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT之间具有差异表达的膜蛋白可供分选纯化,这也大大限制了对Foxp3+γδTreg的生物学功能的进一步研究和相应的临床应用。因此,本研究的第叁部分通过单细胞转录组测序技术探索了 Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT的转录组差异,为寻找两者之间差异表达的膜蛋白从而进一步能纯化分离Foxp3+γδTreg提供新的思路。具体研究内容分为3部分:1)γδTreg细胞体外诱导免疫耐受性DC生成的作用及机制研究;2)γδTreg细胞体内诱导免疫耐受性DC的生成发挥负向免疫调控aGVHD的作用;3)γδTreg细胞表面特异性分子标记的筛选和纯化。第一章γδTreg细胞体外诱导免疫耐受性DC生成的作用及机制研究目的:研究γδTreg体外诱导免疫耐受性DC生成的作用,包括对DC成熟、吞噬、迁移、黏附、活化T细胞等功能的负向免疫调控作用,并阐明相应的机制。方法:从健康成年人外周血中分离单个核细胞(PBMCs),分别进行DC和yδTreg的诱导培养。γδTreg与iDC或mDC共培养48h后磁珠分选去除γδTreg,通过流式细胞术检测共刺激分子荧光强度,采用FITC-Dextran的胞吞实验,混合淋巴细胞反应,与内皮细胞的黏附实验,Transwell下趋化因子的迁移实验等检测DC吞噬、黏附、迁移等功能,并在共培养过程中加用Transwell或阻断抗体来进一步阐明γδTreg诱导免疫耐受性DC生成的机制。结果:γδTreg与iDC共培养后能显着抑制LPS促进的iDC成熟,CD80、CD86、CD40、HLA-DR表达水平显着下调,该抑制作用依赖于ICOS/ICOSL的结合,同时还能显着抑制iDC的吞噬功能。yδTreg与mDC共培养后能显着抑制mDC的黏附功能,以及向CXCL12的迁移功能,相应的CXCR4表达下调,而对CCR7无影响,对黏附功能的抑制同样依赖于ICOS/ICOSL的结合。与yδTreg共培养后iDC和mDC刺激活化T细胞的能力均显着降低。结论:γδTreg体外可通过抑制DC成熟、吞噬、迁移、黏附、活化T细胞等功能诱导免疫耐受性DC的作用,γδTreg对DC的负向免疫调控功能部分依赖于ICOS/ICOSL 的结合。第二章 γδTreg细胞体内诱导免疫耐受性DC的生成发挥负向免疫调控aGVHD的作用目的:在第一章中我们在体外已经明确了 γδTreg可诱导免疫耐受性DC的生成,本章通过构建人源化小鼠aGVHD模型验证γδTreg在aGVHD体内环境下对DC的调控作用。方法:采用NOG小鼠辐照后回输PHA活化的hPBMCs与体外培养的iDC构建人源化小鼠aGVHD模型,其中一组同时回输γδTreg细胞,比较两组小鼠的aGVHD症状、生存时间、aGVHD靶器官损伤;移植后第7天检测比较两组小鼠人细胞的嵌合程度,以及脾脏、外周血中DC共刺激分子表达水平、DC的黏附迁移能力。结果:1)小鼠异体移植模型中,aGVHD组的DC共刺激分子水平显着高于无aGVHD组;2)γδTreg对人源化小鼠aGVHD模型具有保护作用,小鼠aGVHD症状减轻,生存时间延长,靶器官损伤小;3)γδTreg对小鼠aGVHD体内环境中外周血、脾脏的人DC免疫调控功能不同。γδTreg显着下调外周血人DC的共刺激分子表达水平,但对脾脏中人DC的共刺激分子抑制作用不明显;相反,γδTreg能显着抑制脾脏中人DC的迁移黏附功能,但对外周血中人DC的黏附迁移功能无显着影响。结论:γδTreg对人源化小鼠aGVHD模型具有保护作用。γδTreg在aGVHD体内环境下可诱导免疫耐受性DC的生成,但对外周血和脾脏DC的调控功能不同。γδTreg诱导免疫耐受性DC是其发挥负向调控aGVHD作用的机制之一。第叁章 γδTreg细胞表面特异性分子标记的筛选和纯化目的:探索比较Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT之间的转录组差异,筛选Foxp3+γδTreg表面特异性分子标记。方法:采用流式细胞术检测常见的可能分子标记在Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT两群细胞中的表达;采用单细胞转录组测序在单细胞水平比较Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT的转录组差异,多种策略对比筛选出在两群细胞间差异表达基因,并通过蛋白定位数据库筛选出其中定位于膜的蛋白基因,进一步通过高通量单细胞qPCR验证筛选。结果:常见的可能分子标记CD127、CD45RA、CD49d、CTLA-4、GITR、ICOS、CD27、CD69在Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT两群细胞中均未见显著差异表达,不能用于Foxp3+γδTreg的纯化分选;Foxp3在诱导培养体系中是不稳定表达的,诱导培养早期迅速增高,高峰期维持约15天,40天左右小于5%,但Foxp3+比例小于5%时细胞状态差,难以用于转录组测序比较分析;单细胞水平Foxp3 mRNA转录水平呈现连续分布,单细胞转录组测序对比筛选出278差异表达基因,通过蛋白定位数据库筛出膜蛋白差异表达基因35个,进一步通过高通量单细胞qPCR验证筛选出8个可能在两群细胞间差异表达的分子标记。结论:我们首次通过单细胞转录组测序在单细胞水平揭示了 Foxp3+γδTreg与Foxp3-γδT细胞的转录组差异,并通过筛选验证获得了 8个潜在的Foxp3+γδTreg特异性分子标记。(本文来源于《浙江大学》期刊2017-04-01）

吕辉^[10]（2016）在《抑制性寡核苷酸诱导致耐受性浆细胞样树突状细胞治疗实验性性自身免疫性神经炎的实验研究》一文中研究指出研究目的:吉兰-巴雷综合征是神经系统发病率相对较高、致残疾相对较重的自身免疫性疾病,目前发病机制尚未十分明确。一般认为,机体免疫稳态的破坏始动吉兰-巴雷综合症的发生并参与了疾病发展过程。研究吉兰-巴雷综合征患者免疫耐受失衡的具体机制,将有助于了解吉兰-巴雷综合征及其它自身免疫性疾病的发病机制,并能够为这些现有治疗方法不佳的自身免疫性疾病的治疗提供更好的临床干预方法。实验性自身免疫性神经炎(Experimental autoimmune neuritis,EAN)是CD4+T细胞介导的周围神经系统自身免疫性疾病,通过利用优势肽段P0或P2加完全弗氏佐剂主动免疫易感动物而建立,是研究吉-兰巴雷综合征的经典动物模型,广泛用于针对吉兰-巴雷综合征发病机制及治疗策略的研究中。树突状细胞是体内功能最强的抗原提呈细胞,浆细胞样树突状细胞是其亚群之一,能够通过自身表达的固有免疫受体——Toll样受体9(Toll like receptors 9,TLR9)识别抗原而活化,进而发挥介导免疫反应或调解免疫耐受的作用。研究表明TLR9主要识别的配体为寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN),包括刺激性(Cp G ODN)和抑制性(s ODN)两类。目前已证实浆细胞样树突状细胞经TLR9识别不同ODN可以启动或抑制Th1型免疫反应。既往研究发现,EAN中TLR9的表达上升。既往曾有尝试应用s ODN缓解类风湿关节炎模型病情的研究报道。因此在本实验中,我们设定不同ODN干预培养浆细胞样树突状细胞的分组,通过荧光定量PCR检测共刺激分子m RNA的表达;通过蛋白免疫印迹法检测相关通路上关键蛋白的表达;利用酶联免疫法测定浆细胞样树突状细胞分泌的炎性因子量的表达变化,同时尝试应用这些预干预细胞对实验性自身免疫性神经炎进行干预并观察其行为学变化情况,旨在探究s ODN能否诱导致耐受浆细胞样树突状细胞的产生及其可能机制,并探究s ODN诱导的浆细胞样树突状细胞能否促进实验性自身免疫性神经炎临床症状的恢复,从而为临床寻找新的有效治疗吉兰-巴雷综合征的方法提供理论支持。研究方法:本实验包括体内、体外实验两部分,其中体外实验部分如下:健康6-8W的雄性C57BL/6小鼠,在无菌条件下分离脾脏,采用免疫磁珠分选法获得脾脏浆细胞样树突状细胞,流式细胞计数检测所得浆细胞样树突状细胞纯度。将所得细胞按照0.5×10^5/孔种植于24孔板中,分别设为空白组、P0180-199组、P0180-199+Cp G ODN组、P0180-199+s ODN组、P0180-199+control ODN(c ODN)组。加入10%FBS-1640培养基,培养48小时后提取m RNA及蛋白并收集上清。利用荧光定量PCR检测各组CD40、CD80、CD86和IDO的m RNA表达水平变化,利用蛋白免疫印迹法检测各组TLR9、MyD 88、NF-κB p65、ERK/p-ERK、p38/p-p38、JNK/p-JNK、Akt/p-Akt、PI3K蛋白表达水平变化。利用酶联免疫吸附试验检测各组IL-12、IL-6、IL-4和TNF-ɑ的表达水平变化。体内实验部分:采用P0180-199肽段联合完全弗氏佐剂制备抗原乳剂,通过免疫C57BL/6小鼠双足足垫建立实验性自身免疫性神经炎动物模型。在免疫后第10天,将模型随机分为空白对照组、Cp G ODN组、s ODN组和cO DN组,对后叁组模型分别尾静脉注射已分别预干预培养48h的浆细胞样树突状细胞,剂量为4×10^5细胞/0.1 ml/每只小鼠(n=6,每组)。每日进行评分以评估各组模型的临床症状恢复程度直至免疫后28天。比较28天时各组死亡率情况,比较28天时各组临床缓解(临床评分≤0.5分)情况。研究结果:1.流式抗体标记经免疫磁珠法分选所得细胞,采用流式细胞法检测分离细胞纯度。3次重复流式检测结果显示所得浆细胞样树突状细胞比例为90-93%,所得纯度能够支持后续实验研究。2.蛋白免疫印迹结果显示同空白组相比,P0180-199组TLR9及NF-κB p65的表达水平升高,而相比较P0180-199组,P0180-199+Cp G ODN组TLR9及NF-κB p65的表达量明显增加,P0180-199+s ODN组TLR9及NF-κB p65表达量则明显下降。各组间ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-38、Akt、p-Akt表达量无明显差异。相比较空白组,P0180-199组及P0180-199+Cp G ODN组MyD 88的表达量明显增加,但P0180-199组及P0180-199+Cp G ODN组两组间MyD 88表达量无明显差异,p=0.76,而P0180-199+s ODN组同P0180-199+Cp G ODN组相比MyD 88表达量则减少。以上结果均有统计学意义,p<0.001。3.荧光定量PCR检测结果显示相比空白组,P0180-199组CD40、CD80和CD86的m RNAs表达水平升高。相比P0180-199组,P0180-199+Cp G ODN组CD40、CD80和CD86 m RNA的表达量明显增高,而P0180-199+s ODN组CD40、CD86的m RNAs表达量减少;另一方面IDO m RNA检测结果显示,P0180-199+s ODN组IDO的m RNA水平则显着高于其它各组,且相比空白组差异具有统计学意义;而相比空白组,P0180-199组中IDO的m RNA表达水平则出现下降,而P0180-199+Cp G ODN组同P0180-199组相比IDO的m RNA表达量则明显减少,以上结果均有统计学意义,p<0.001。4.酶联免疫吸附试验检测结果表明相比空白组,P0180-199组上清中细胞因子IL-12p40、IL-6和TNF-α的表达水平均增高,同P0180-199组相比,P0180-199+Cp G ODN组各因子水平增高显着;而同P0180-199组相比,P0180-199+s ODN组细胞分泌的IL-12p40、IL-6和TNF-α水平显著降低,以上结果均有统计学意义,p<0.001。5.行为学观察结果显示自免疫后第7日起,各组小鼠最先可出现精神不振等非特异性性表现,在免疫第9天后各组小鼠均开始发病,出现尾部无力,活动受限等临床表现。整个病程呈单相病程,除s ODN组外各组发病高峰多集中在17天左右,而s ODN组发病高峰在14天左右。观察结果显示Cp G ODN组中第16天、第17天分别出现1只、3只小鼠死亡,至28天时Cp G ODN组共有四只小鼠死亡。生存曲线结果显示相比EAN组,Cp G ODN组的生存率明显下降(p=0.02);而s ODN及cO DN组生存率同EAN组比较无明显差异。每日临床评分结果显示,s ODN组评分呈现出早期下降且高分减低的特点,相比较EAN组,s ODN组评分降低具有统计学差异(p<0.05)。统计学结果显示免疫28天后s ODN组模型临床缓解(评分<0.5或者更低)的比例要高于EAN组,p<0.001。结论:(1)TLR9调控p DCs发挥促炎作用参与EAN的发病过程。(2)s ODN能够通过TLR9/NF-κB通路诱导致耐受性浆细胞样树突状细胞的产生。(3)s ODN诱导的浆细胞样树突状细胞能够减轻EAN小鼠临床症状,缓解疾病的严重程度。以TLR9抑制剂如s ODN为干预靶点可以为未来吉兰-巴雷综合征及相关自身免疫性疾病的治疗提供新方向。(本文来源于《天津医科大学》期刊2016-05-01）

耐受性树突状细胞论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

目的:观察耐受性树突状细胞(dendritic cells,DC)在输入胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠体内后能否形成微嵌合状态,探讨耐受性DC对CIA大鼠治疗干预的内在机制。方法:以CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠为实验动物。1.核因子-κB(Nuclearfactor-kappa B,NF-κB)寡核苷酸诱骗策略(oligodeoxynucleotidedecoy,ODNDecoy)诱导 CIA 雌性 SD 大鼠和正常雄性SD大鼠来源耐受性DC的构建:(1)正常雌性SD大鼠左足跖部皮内注射200μl牛二型胶原(BIIC)乳剂进行CIA模型制备;(2)取CIA雌性SD大鼠(初次免疫后第13天)和正常雄性SD大鼠脾脏单个核细胞,用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)培养为DC,经NF-κB ODN Decoy诱导为耐受性DC:(3)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源的培养细胞各分为4组;(4)DC生物学性状观察:倒置显微镜、吉姆萨染色观察细胞形态特征,台盼蓝染色计数活细胞率,流式细胞术检测大鼠DC特异性标志OX-62鉴定纯度,检测DC表面CD80、CD86分子表达情况和同种异体混合淋巴细胞反应评估耐受性DC的耐受性及其稳定程度。2.CIA大鼠体内输入耐受性DC微嵌合状态的观察:(1)制备CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源的耐受性DC,并负载BIIC,记为BIIC-Decoy DC,用DiR荧光染料标记,记为BIIC-DecoyDC(?);(2)台盼蓝染色评估细胞标记DiR荧光染料前后活细胞率,MTT实验评价BIIC-Decoy DC(?)对细胞活性的影响;(3)活体成像系统(In Vivo Imaging System,IVIS)观察BIIC-Decoy DC(?)荧光强度;(4)IVIS活体成像实验分组:A组:同种异体正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC(?),于病程第5天,尾静脉输入CIA大鼠(即病程早期CIA)体内;B组:同种异体正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC(?),于病程第20天,尾静脉输入CIA大鼠(即病程中期CIA)体内;C组:CIA大鼠自体来源BIIC-Decoy DC(?)尾静脉输入病程中期CIA大鼠体内。正常雌鼠对照(normal female control,NFc)组:同种异体正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC(?)尾静脉输入正常雌性SD大鼠体内;正常雄鼠对照(normal male control,NMc)组:正常雄性SD大鼠自体来源BIIC-Decoy DC(?)尾静脉输入正常雄性SD大鼠体内。非标记细胞对照(cell control):用无荧光标记的BIIC-Decoy DC代替标记细胞,作为A、B、C组的非标记细胞对照,记为Acc、Bcc、Ccc组。模型空白对照(model control):用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)代替标记细胞,作为A、B、C组的模型空白对照,记为Amc、Bmc、Cmc组。(5)IVIS活体成像:将上述两种来源BIIC-Decoy DC(?)经尾静脉输入各组大鼠体内后4h、24h、5day、10day、20day、25day等时间点,动态观察细胞进入大鼠体内后的迁移、分布及微嵌合状态;(6)活体成像结束后检测指标:取离体脏器进行IVIS成像;取血清检测IL-2和IFN-y;IL-4和IL-10等细胞因子水平;取踝关节作病理切片。结果:(1)耐受性DC的构建:CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源脾脏单个核细胞成功诱导为耐受性DC,其活细胞率均>94%,细胞纯度均>85%;DC表面CD80、CD86分子表达情况和同种异体混合淋巴细胞反应结果显示其耐受性具有较好的稳定程度;(2)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源的耐受性DC负载BIIC,成功构建BIIC-Decoy DC,标记DiR荧光染料,记为BIIC-Decoy DC(?);(3)台盼蓝染色:DiR荧光染料标记前后BIIC-Decoy DC活细胞率均在95%左右;(4)MTT实验:结果显示DiR荧光染料标记上述两种来源BIIC-Decoy DC后,对其细胞活性无影响;(5)IVIS成像检测结果显示DiR荧光染料成功标记上BIIC-Decoy DC,且荧光强度随细胞数量增加而增强;(6)IVIS活体成像结果:荧光信号主要集中在胸腹部,随成像时间延长可向其他部位迁移,如四肢关节;荧光强度随成像时间延长而逐渐降低;荧光信号多以24h达高峰,最长观察至第35天,仍可见荧光信号;(7)离体器官IVIS成像结果:荧光信号主要集中在肺脏、脾脏和淋巴结中,以肺脏荧光信号最强,肝脏、心脏和肾脏荧光信号相对较弱;(8)血清细胞因子水平检测:在病程早期和病程中期CIA大鼠模型组中,IFN-γ、IL-2等Th1型细胞因子表达水平较高,IL-10、IL-4等Th2型细胞因子较低;而在病程早期和病程中期CIA大鼠治疗组中,IFN-γ、IL-2等Th1型细胞因子表达明显降低,IL-10、IL-4等Th2型细胞因子表达明显升高;(9)踝关节病理结果:CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC对病程早期CIA和病程中期CIA大鼠均显示出良好的治疗效果。结论:(1)改良DC提取方法,获得CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源耐受性DC纯度均>85%;(2)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC对病程早期CIA和病程中期CIA大鼠均具有较好的治疗效果;(3)利用IVIS成像系统动态观察DiR荧光染料标记CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠来源BIIC-Decoy DC经尾静脉输入CIA大鼠体内后,广泛分布于肺脏、脾脏、淋巴结等组织,持续至第35天仍可检测到荧光信号,初步判断微嵌合状态形成。血清细胞因子水平检测结果显示微嵌合状态形成的同时,体内细胞因子格局由Th1向Th2方向偏移,有利于免疫耐受的形成。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

耐受性树突状细胞论文参考文献

[1].郑超.沉默RelB诱导的耐受性树突状细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗作用[D].吉林大学.2019

[2].田娅玲.胶原诱导性关节炎大鼠体内输注耐受性树突状细胞微嵌合状态的观察[D].贵州医科大学.2019

[3].韩旭.米诺环素通过LPS-TLR4/NF-κB信号通路诱导耐受性树突状细胞产生[D].河北医科大学.2019

[4].董斌,张兵,封亚萍,韩彦博,杨新华.VEGF诱导致耐受性树突状细胞对口腔鳞状细胞癌患者T细胞免疫功能的影响[J].癌症进展.2018

[5].何楚琳.神经肽—氧化石墨烯诱导耐受性树突状细胞抑制急性移植物抗宿主病及其机制研究[D].广西医科大学.2018

[6].何楚琳,周欠欠,张玉龙,赵嫚,马聪.雷帕霉素诱导耐受性树突状细胞抑制急性移植物抗宿主病的动物实验[J].中国输血杂志.2018

[7].郑超,谢忠祥,吴静,朱珊,金涛.1,25(OH)2D3诱导的耐受性树突状细胞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗作用及机制[C].第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编.2017

[8].曹青青.Breg、PD1、PDL1通过耐受性树突状细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的治疗作用及机制[D].吉林大学.2017

[9].张明明.γδTreg诱导免疫耐受性树突状细胞在移植物抗宿主病中的作用及机制研究[D].浙江大学.2017

[10].吕辉.抑制性寡核苷酸诱导致耐受性浆细胞样树突状细胞治疗实验性性自身免疫性神经炎的实验研究[D].天津医科大学.2016

标签：多发性硬化;  实验性自身免疫性脑脊髓炎;  耐受性树突状细胞;  RelB;