导读:本文包含了瞬时表达系统论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:水稻,miRNA,荧光素酶,靶基因验证
瞬时表达系统论文文献综述
胡积祥,曹雅倩,朱秀梅,余超,田芳[1]（2019）在《基于瞬时表达系统的水稻miRNA靶基因快速验证系统的建立》一文中研究指出旨在建立一种准确且快速的基于瞬时表达系统的水稻mi RNA靶基因验证系统,为研究水稻miRNAs的生物学功能奠定基础。已有研究证实osa-miR169o剪切靶基因OsNF-YA4(LOC_Os03g48970.1)的mRNA,以此为参照,在烟草和水稻原生质体瞬时表达系统中将miR169o前体基因分别与LUC表达载体、LUC-48970和LUC-48970m3融合表达载体瞬时共表达,通过CCD活体成像和Luminometor分析了共表达后LUC活性的动态变化。利用茎环qRT-PCR对miR169o的表达水平进行分析,获得靶基因验证的适合体系。在水稻原生质体体系中,LUC活性和miR169o表达水平在原生质体转化后逐渐增高;24 h时LUC活性最高,相应miR169o表达水平上升10倍左右。综合分析,在原生质体转化后24 h-36 h为适宜检测时间段。在烟草瞬时表达体系中,农杆菌注射72 h后LUC活性最强,而miR169o的表达在48 h后即可上调20倍。因此,农杆菌注射后48 h-72 h为适宜检测时间段。本系统为水稻miRNA靶基因的验证提供了一种简便、快速,且更接近于体内真实情况的实验方法。(本文来源于《生物技术通报》期刊2019年10期）
杨丽萍[2]（2019）在《植物瞬时表达系统的研究进展》一文中研究指出利用植物作为生物反应器是一个新兴的研究领域。本文概述了植物生物反应器的两个主要的表达体系、病毒载体介导的植物瞬时表达系统在表达外源方面的优势,以及植物瞬时表达侵染技术的研究进展,并阐述了植物生物反应器的发展趋势。(本文来源于《现代农业研究》期刊2019年05期）
黄爽,范杰英,韦正乙,邢少辰[3]（2019）在《烟草花叶病毒瞬时表达系统在医药蛋白生产中的应用》一文中研究指出烟草花叶病毒(TMV)是目前研究最为透彻的一种植物病毒。基于烟草花叶病毒的瞬时表达系统是目前发展最迅速、应用最广泛的,具有广阔应用发展前景。该系统以表达速度快、表达量高、安全性高和易于规模化生产为最突出的特点,目前已广泛应用在疫苗、抗体和治疗性蛋白等医药蛋白生产中,有不少产品获得了市场准入或者进入了临床试验。本综述简要介绍了基于烟草花叶病毒的瞬时表达系统的发展历史,回顾和总结了该系统在生产医药蛋白领域最新的研究和应用进展,分析了存在的问题,提出了一些建议,藉此促进中国生物医药产业的发展。(本文来源于《分子植物育种》期刊2019年21期）
曹雅倩[4]（2018）在《水稻miRNAs靶基因验证瞬时表达系统的构建及应用》一文中研究指出MiRNAs是一类内源性非编码小分子RNA,通过剪切靶基因mRNA或抑制蛋白的翻译调控真核生物的基因表达。在植物体内,miRNAs主要参与了生长发育、逆境胁迫反应等多种生物进程。随着测序技术的飞速发展,发现了大量新的miRNAs,miRNA database已经收录了38589个miRNAs,然而大多数miRNA的生物功能及其靶基因仍需要进行进一步的验证。研究miRNA的作用,关键是研究miRNA对靶基因的调控。MiRNAs靶基因的验证常用方法包括Northern Blot,Western Blot,降解组测序(Degradome sequencing),MirTrap,RACE(Rapid amplification of cDNA ends)和荧光素酶报告系统。利用生物信息学预测miRNAs靶基因,采用不同的方法和不同的参数条件都可能会得到不同的靶基因,预测结果存在假阳性和假阴性,因此,对预测的靶基因进行实验验证也是必需的。鉴于miRNA靶基因的实验验证过程较为复杂、耗时,因此,建立一种准确且快速地预测和验证miRNA靶基因的方法对研究miRNA的生物学功能具有非常重要的意义。利用瞬时表达结合荧光素酶报告基因建立的检测系统是靶基因验证的一种快速、简便的方法。本文利用农杆菌所介导的烟草瞬时表达,结合水稻原生质体的瞬时表达,系统研究了不同体系下miRNAs的动态表达,以及靶基因验证的最佳体系。主要结果如下:(1)构建了适用于水稻原生质体瞬时表达的载体,将miR169o过表达载体分别与LUC空白载体,靶基因LOC_Os03g48970.1与LUC的融合载体(后称作LUC-48970)以及LUC-48970m3(及48970突变载体)共转化到水稻原生质体中,miR169o和LUC-48970共转化后的LUC活性显着弱于miR169o和空白融合载体(LUC)共转化,miR169o和LUC-48970m3(即48970的突变)共转化后的LUC活性,表明miR169o可以抑制靶基因LOC_Os03g48970.1的转录表达,而水稻原生质体系统可以用于miRNAs靶基因的检测。(2)在原生质体转化后12h,18h,24h,36h分别检测LUC活性,发现在24h时,LUC的活性最高,表明24h可能是最适宜观察荧光的时期。此外,还利用qRT-PCR检测了这四个时间点成熟miR169o的表达量,整体来看,miR169o的表达量与转化时间具有正相关性,12h表达量最低,在24h表达量上调至十倍。当将miR169o与靶基因融合载体共转化水稻原生质体后,在不同的处理中miR169o的表达具有一定的差异。综合miRNAs表达水平及LUC活性的检测结果,建议在miRNAs靶基因的验证中,水稻原生质体转化后24h-36h作为后续最适宜的检测时间。(3)构建了适用于烟草瞬时表达的载体,将携带miR169o过表达载体与LUC空白载体,LUC-48970融合载体,LUC-48970m3载体的农杆菌分别共注射到烟草叶片中,检测LUC活性,发现miR169o与LUC-48970共表达中的LUC活性明显弱于miR169o与LUC共表达,miR169o与LUC-48970m3共表达中的LUC活性,表明烟草瞬时表达系统可以用于水稻miRNAs的靶基因验证。注射烟草48h,72h,96h检测LUC活性,发现72h LUC活性达到高峰后,又有所降低,表明72h是农杆菌注射后最适宜的检测点。此外,利用qRT-PCR检测了注射后24h,36h,48h,72h成熟miR169o表达量,24h表达量最低,48h时表达量已显着上调,且上调倍数达到近二十倍。综合这两方面的检测结果,建议在miRNAs靶基因验证体系中,烟草注射菌后48h-72h作为后续最适宜的检测时间。(4)利用构建的水稻原生质体瞬时表达系统和烟草瞬时表达系统,检测了mi R812g与其预测靶基因LOC_Os02g07960.4和LOC_Os04g47140.1,miR5076与其预测靶基因LOC_Os02g27594.2,miR818a与其预测靶基因LOC_Os09g36320.1,miR169o与其预测靶基因之间LOC_Os02g53620.1的对应关系,发现除了53620是miR169o的靶基因,其他miRNAs与其预测的靶基因可能不存在剪切或抑制关系。本文通过对miRNAs及荧光素酶报告基因的表达动态分析,建立了水稻miRNAs靶基因的瞬时验证系统,该系统为水稻miRNAs靶基因验证提供了一种简便、快速,且更接近于体内实验的方法,进而为研究miRNAs生物学功能奠定了基础。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2018-05-01）
武亚丹,张秀春,冼淑丽,余乃通,王健华[5]（2017）在《本生烟瞬时表达系统快速检测RNAi载体沉默效果》一文中研究指出RNA干扰(RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法。为快速检测RNAi载体的沉默效果,通过构建木薯eIF4E3基因的过量表达载体pAI-Ca4E3以及靶标木薯eIF4E3基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E3,利用农杆菌注射法将表达载体在本生烟叶片中进行瞬时表达。半定量RT-PCR检测结果显示单独注射过量表达载体pAI-Ca4E3或与表达载体pCAMBIA1300共同注射的样品,农杆菌注射后第4天、第5天和第6天都能检测到木薯eIF4E3基因的高效表达,并且二者木薯eIF4E3基因表达量基本相同,说明木薯eIF4E3基因能在本生烟中高效瞬时表达,但是过量表达载体pAI-Ca4E3与干扰载体p1300-Ca4E3共同注射的样品,农杆菌注射后第4天、第5天还是第6天后都几乎检测不到木薯eIF4E3基因的表达,说明过量表达载体表达的木薯eIF4E3基因已被干扰载体有效沉默。研究结果表明,已建立同时表达靶标基因和干扰靶标基因的干扰载体的本生烟瞬时表达系统,并结合半定量RT-PCR进行RNAi载体沉默效果检测的方法。该方法在农杆菌注射4 d后就能有效的检测RNAi载体的沉默效果,具有快捷、操作简便等特点,为RNAi技术应用于基因功能研究提供简单、快捷、有效的证据。(本文来源于《分子植物育种》期刊2017年12期）
武亚丹,张秀春,冼淑丽,余乃通,王健华[6]（2017）在《本生烟瞬时表达系统快速检测RNAi载体沉默效果》一文中研究指出RNA干扰(RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法。为快速检测RNAi载体的沉默效果,通过构建木薯eIF4E3基因的过量表达载体pAI-Ca4E3以及靶标木薯eIF4E3基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E3,利用农杆菌注射法将表达载体在本生烟叶片中进行瞬时表达。半定量RT-PCR检测结果显示单独注射过量表达载体pAI-Ca4E3或与表达载体pCAMBIA1300共同注射的样品,农杆菌注射后第4天、5天和6天都能检测到木薯eIF4E3基因的高效表达,并且二者木薯eIF4E3基因表达量基本相同,说明木薯eIF4E3基因能在本生烟中高效瞬时表达,但是过量表达载体pAI-Ca4E3与干扰载体p1300-C;a4E3共同注射的样品,农杆菌注射后第4天、第5天还是第6天后都几乎检测不到木薯eIF4E3基因的表达,说明过量表达载体表达的木薯eIF4E3基因已被干扰载体有效沉默。研究结果表明:已建立同时表达靶标基因和干扰靶标基因的干扰载体的本生烟瞬时表达系统,并结合半定量RT-PCR进行RNAi载体沉默效果检测的方法。该方法在农杆菌注射4天后就能有效的检测RNAi载体的沉默效果,具有快捷、操作简便等特点,为RNAi技术应用于基因功能研究提供简单、快捷、有效的证据。(本文来源于《中国植物病理学会2017年学术年会论文集》期刊2017-07-25）
赵郭珍[7]（2017）在《烟草上基于瞬时表达系统的青枯菌UW551的毒力效应蛋白的筛选》一文中研究指出由青枯菌侵染导致的青枯病是植物的一个重要的细菌性病害。青枯菌叁型分泌系统效应蛋白是其致病的重要因子。青枯菌的叁型分泌系统效应蛋白众多,但是关于其致病的分子机制目前还了解的比较少。为了进一步快速切入青枯菌效应蛋白的毒力功能研究,本实验选用了瞬时表达体系对青枯菌的效应蛋白在烟草上进行了细胞死亡的筛选,并初步鉴定其介导的植物免疫途径,同时筛选了其中能够干扰植物ETI及PTI免疫途径的效应蛋白。本研究将为青枯菌效应蛋白的毒力功能的深入探索奠定前期基础,为进一步发掘抗青枯菌基因做好铺垫。结果如下:1.利用青枯菌UW551对本氏烟、3种栽培种烟草(N.tabacum D101、N.tabacum云烟87、N.tabacum K326)、及4种野生型烟草(N.langsdorffii、N.repanda、N.alata、N.goodspeedii)进行根部及叶片接种,结果表明,青枯菌UW551无法导致以上几种烟草发病萎蔫,但能够致使叶片出现细胞死亡。UW551的T3SS突变体△hrpB在烟草叶片上并无细胞死亡反应。说明UW551产生的细胞死亡现象是由T3SS介导的。2.从青枯菌UW551中克隆了47个效应子,并利用马铃薯病毒双元表达载体pGR106成功构建了其中42个效应子基因的瞬时表达载体。3.利用农杆菌介导的瞬时表达系统在本氏烟及7种烟草上对这些效应子进行鉴定发现,效应子Rip5可在所有的测试植物上诱导叶片组织的细胞死亡;Rip6可在本氏烟及4种野生型烟草上诱导叶片组织的细胞死亡;另外,Rip25、Rip26、Rip32、Rip 40、Rip 55、Rip 56、Hyp9可引起本氏烟叶片组织的不同程度的细胞死亡。4.对Rip5、Rip6、Rip25、Rip26、Rip55、Rip56在本氏烟上的免疫途径中的功能研究,分别沉默植物免疫途径的关键基因NbBAK1、NbNDR1、NbEDS1、NbSGT1、NbWIPK、NbCoi1,发现Rip26在NbBAK1沉默植株中诱导的细胞死亡增强,而在NbNDR1的沉默植株中则明显减弱。5.在UW551的效应子对本氏烟叶片ETI与PTI介导细胞死亡的抑制分析中发现,有7个能够完全抑制INF1激发的HR,分别是Rip6、Rip10、Rip13、Rip28、Rip30、Rip32、Rip47、Hyp11;有9个能够抑制PiCRN2激发的HR,分别是Rip6、Rip10、Rip13、Rip30、Rip31、Rip32、Rip36、Rip53、Hyp11;Rip6能够部分抑制Avr3a/R3a、Avr4/Cf4激发的HR。青枯菌UW551的部分效应子对PCD具有相同的抑制作用,其在病原菌侵染中可能抑制PTI、ETI的免疫反应。(本文来源于《华中农业大学》期刊2017-06-01）
王海涛,张晓峰,谢云杰,王娟,陈红燕[8]（2016）在《利用叶蝉细胞瞬时表达系统研究水稻瘤矮病毒在介体细胞内的增殖机制》一文中研究指出很多动植物病毒以昆虫作为媒介进行传播,由此引发的病毒病害严重影响人畜健康和粮食生产安全。由于昆虫介体本身体积小,寿命短,各种器官组织非常精细复杂,而且很多病毒基因组结构复杂,目前尚不易得到侵染性克隆,不能利用反向遗传学的手段进行研究。因此,昆虫细胞系结合相应的瞬时表达载体系统,是研究无侵染性克隆病毒在细胞内增殖必不可少的技术手段。目前,叶蝉细胞系广泛地应用于植物呼肠孤病毒的研究中,然而缺少叶蝉细胞特异的瞬时表达载体,导致无法更深入地探索水稻病毒在叶蝉细胞内的增殖机制。本研究通过定位和克隆黑尾叶蝉actin基因的promoter序列,首次开发建立了能在叶蝉细胞中高效瞬时表达的载体系统。通过优化转染条件,该系统目前可以转染飞虱、叶蝉以及sf9等昆虫细胞并表达多种外源蛋白。同时利用该系统验证水稻瘤矮病毒RGDV非结构蛋白Pns7、Pns9和Pns12的细胞定位以及它们与主要的结构蛋白P3、P5、P8之间的互作情况,进一步完善了RGDV病毒原质(Viroplasm)形成的分子机制以及其招募结构蛋白的机理。该系统扩宽了昆虫细胞系的平台优势,为研究水稻病毒和昆虫互作机制提供了有力的工具。(本文来源于《中国植物病理学会2016年学术年会论文集》期刊2016-08-05）
刘雪梅[9]（2015）在《棉花子叶瞬时表达系统的建立及人工合成诱导型启动子的活性分析》一文中研究指出植物瞬时表达系统是指外源基因转染植物后,与宿主细胞染色体DNA不发生整合,但外源基因在宿主细胞中短期而快速表达,产生瞬时效应。瞬时表达系统在研究基因产物的亚细胞定位、蛋白互作、启动子活性等方面具有重要作用。另外,瞬时表达系统操作简单无需特殊仪器设备、外源基因的表达效率高、安全,不易产生基因漂移,可有效避免基因沉默等,在基因功能研究、转基因工程中应用广泛。启动子是与转录起始复合物及多种转录因子相互作用的一段DNA序列,控制基因表达(转录)的起始时间和表达程度。根据不同的转录模式,启动子分为3类:组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子驱动基因在植物不同时间和空间范围内均能表达;组织特异性启动子驱动下的基因在某个组织部位特异性表达;诱导型启动子在各种环境胁迫条件下可诱导基因大量表达,而在正常情况下基因不表达或表达量很低。本实验中,我们利用棉花子叶为实验材料,建立了以eGFP为报告基因的棉花子叶瞬时表达系统。以本实验室确定的长为247 bp的D-7序列为基础,构建了具有不同干旱元件的系列棉花诱导型启动子和添加了 28 bp SynJ(人工合成的1个增强子序列)的启动子,以及棉花干旱胁迫响应蛋白1基因(DREBl)启动子,利用棉花子叶瞬时表达系统分析了上述启动子活性及其诱导特异性。在此基础上,将上述各类含eGFP标记的启动子转入拟南芥中,进一步分析各类启动子活性及瞬时表达系统的可信度。实验取得结果如下:1.本实验以棉花子叶为材料,利用农杆菌注射法建立了 eGFP为标记基因的瞬时表达系统,确定了子叶的最佳生长时期,注射菌量,共培养时间等,结果表明利用萌发6天的棉花子叶注射50 μL OD600为0.5的含目的基因的农杆菌LBA4404,共培养3天后,eGFP表达效率最高。2.构建了DREB 启动子,系列人工合成的D-7干旱启动子及添加了 28 bp SynJ的启动子与eGFP融合载体,命名为:pDREBl-eGFP、pDrought 1、pDrought 3、pDrought5、pDrought7、p28nt-eGFP。利用建立的棉花子叶瞬时表达系统检测eGFP表达量,分析启动子活性,干旱诱导显示pDREBl-eGFP、pDrought 1、pDrought 3、pDrotught 5、pDrought 7载体对干旱有响应,可能为诱导型启动子,而p28nt-eGFP,为强的适合在棉花中表达的组成型启动子。3.将 pDREBl-eGFP、pDrought 1、pDrought 3、pDrought 5、pDrought7 载体通过农杆菌GV3101转化拟南芥,采集拟南芥不同组织检测eGFP表达量,分析启动子活性,干旱胁迫发现各载体对干旱有响应。4.利用转基因拟南芥表达分析各类诱导型启动子的结果与棉花子叶的瞬时表达系统分析的结果有一致性,说明以eGFP为标记基因的棉花子叶瞬时表达系统可以成功应用于启动子的研究。但是,改造后的启动子活性仍然较弱,因此,在后续实验中可考虑在启动子上游区添加其他侧翼序列,将D-7启动子改造成为一个强的诱导型启动子。(本文来源于《陕西师范大学》期刊2015-05-01）
梁童瑶[10]（2015）在《农杆菌介导的瞬时表达系统在烟草、丹参、夏枯草中的建立》一文中研究指出遗传转化一直以来都是研究药用植物次生代谢物调控的重要手段。其中,稳定转化具有重现性好的优势。但是,获得稳定转化的毛状根体系或转基因植株往往费时费力,无法满足大量药用植物次生代谢调控相关基因的研究需求。农杆菌介导的瞬时转化以其易操作、低成本、短周期的优势,已被广泛应用于植物功能基因的研究中。然而目前,药用植物的功能基因研究还常使用稳定遗传转化,或一些高成本、高难度的瞬时转化方法(如基因枪、原生质体转化等)。因此,本研究试图在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和药用植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)、夏枯草(Prunella vulgaris L.)中,建立农杆菌介导的瞬时转化体系,为丹参、夏枯草功能基因的进一步研究提供新的方法与参考。本研究以本氏烟草、丹参、夏枯草为材料,尝试建立农杆菌介导的病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)体系;利用pEAQ载体高效表达次生代谢合成相关基因,异源构建次生代谢合成途径;构建农杆菌介导的幼苗瞬时转化体系。主要得到了以下结论:(1)本试验中,VIGS体系未能在丹参中成功建立。这可能与介导的农杆菌株、菌液侵染浓度、植物材料的生长状态、构建载体病毒株系及植物对病毒的防御机制等因素有关;从丹参的病样叶片中成功鉴定出黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV),为丹参中病毒沉默载体的构建及进一步研究提供了材料与依据。(2)通过pEAQ载体在本氏烟草叶片中高效表达了一个或多个外源基因。这为在烟草中快速有效的表达外源基因,并进一步探究其功能提供了有力方法。多个外源基因的高效共表达也为在本氏烟草中异源构建次生代谢途径提供了可能。(3)农杆菌介导的瞬时转化体系在不同的植物幼苗材料中有着不同的侵染效率。在本试验中,以丹参作为材料在农杆菌介导的VIGS、pEAQ载体的瞬时转化及幼苗瞬时转化这几种瞬时体系中都没能成功。这可能与丹参对外源基因的瞬时表达防御机制有关。夏枯草与烟草幼苗的瞬时转化结果也暗示,这种植物幼苗瞬时侵染效率的差异可能与幼苗个体大小差异与组织致密性等原因有关。(4)利用“FAST+机械损伤”的方法,初步建立了夏枯草幼苗瞬时遗传转化体系,为夏枯草中功能基因的研究提供了有效手段。但是,该体系在胁迫相关的功能基因研究中并不适用。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2015-05-01）
瞬时表达系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
利用植物作为生物反应器是一个新兴的研究领域。本文概述了植物生物反应器的两个主要的表达体系、病毒载体介导的植物瞬时表达系统在表达外源方面的优势,以及植物瞬时表达侵染技术的研究进展,并阐述了植物生物反应器的发展趋势。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
瞬时表达系统论文参考文献
[1].胡积祥,曹雅倩,朱秀梅,余超,田芳.基于瞬时表达系统的水稻miRNA靶基因快速验证系统的建立[J].生物技术通报.2019
[2].杨丽萍.植物瞬时表达系统的研究进展[J].现代农业研究.2019
[3].黄爽,范杰英,韦正乙,邢少辰.烟草花叶病毒瞬时表达系统在医药蛋白生产中的应用[J].分子植物育种.2019
[4].曹雅倩.水稻miRNAs靶基因验证瞬时表达系统的构建及应用[D].中国农业科学院.2018
[5].武亚丹,张秀春,冼淑丽,余乃通,王健华.本生烟瞬时表达系统快速检测RNAi载体沉默效果[J].分子植物育种.2017
[6].武亚丹,张秀春,冼淑丽,余乃通,王健华.本生烟瞬时表达系统快速检测RNAi载体沉默效果[C].中国植物病理学会2017年学术年会论文集.2017
[7].赵郭珍.烟草上基于瞬时表达系统的青枯菌UW551的毒力效应蛋白的筛选[D].华中农业大学.2017
[8].王海涛,张晓峰,谢云杰,王娟,陈红燕.利用叶蝉细胞瞬时表达系统研究水稻瘤矮病毒在介体细胞内的增殖机制[C].中国植物病理学会2016年学术年会论文集.2016
[9].刘雪梅.棉花子叶瞬时表达系统的建立及人工合成诱导型启动子的活性分析[D].陕西师范大学.2015
[10].梁童瑶.农杆菌介导的瞬时表达系统在烟草、丹参、夏枯草中的建立[D].西北农林科技大学.2015