1黑龙江省大庆市人民医院；2重庆九龙坡区中医院400000
摘要：[目的]研究端粒酶逆转录酶（hTERT）基因对纤维肉瘤生长的影响。
[方法]应用慢病毒包装的RNAi质粒载体技术设计、构建、筛选靶向hTERT基因及其小干扰RNA（siRNA），转染培养的纤维肉瘤细胞，移植入裸鼠，从实验动物水平上观察其对纤维肉瘤生长的形态、数量和体积影响。应用RT-PCR及Western-blot等技术检测P53、survivin、caspase-3、caspase-7表达水平，探讨其对生长与凋亡相关基因及信号分子PKB信号通路的调节作用。
[结果]过表达hTERT可增加裸鼠体内纤维肉瘤体积，能明显增加survivin而降低caspase-3表达水平，导致PKB表达水平增加。反之，干扰hTERTR基因可减少肿瘤体积，能明显减少survivin而增加caspase-3表达水平，导致PKB表达水平下降。
[结论]hTERT基因的小干扰RNA（siRNA）具有减少裸鼠体内纤维肉瘤体积的作用，可能与其调节caspase-3和survivin基因表达及PKB信号通路有关。
关键词：hTERT纤维肉瘤RNA干扰凋亡信号通路
RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通过RNA调控基因表达的机制。它通过小干扰RNA（smallinterferenceRNA，siRNA）特异地结合并降解一个或多个靶向mRNA而起作用[1]。2001年Tuchl等首次应用长度约为19～23个碱基对的双链小分子干扰RNA（siRNA）在哺乳动物细胞中诱发基因沉默现象，证实RNA干扰的普遍存在性[2]。siRNA具有强大的抑制基因表达的效应和高度的序列特异性，其沉默基因表达的效率较传统方法高达数十到数千倍，是逆基因工具的革命性改进。其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。因此siRNA是一种极具前景的基因靶向药物，可广泛应用于肿瘤等疾病的治疗。本题通过慢病毒包装的RNAi质粒载体技术设计、构建、筛选靶向hTERT基因及其小干扰RNA（siRNA），转染培养的纤维肉瘤细胞，移植入裸鼠，从实验动物水平上观察其对纤维肉瘤生长的形态、数量和体积影响。
材料与方法
1材料
1.1细胞株与质粒载体
细胞株：人纤维肉瘤HT-1080细胞株购自四川大学华西医院移植免疫实验室
质粒载体：广州复能基因有限公司提供的质粒载体
1.2实验动物
裸鼠：四川大学华西医院实验动物中心提供
2方法
2.1裸鼠准备与分组
实验分组：正常组、干扰组和过表达组，裸鼠共24只，鼠龄5-6周，雌雄不拘，体重20克左右，每组8只。
2.2模型建立
复苏纤维肉瘤HT1080细胞，使其浓度达到1x108个/ml，3.6%水合氯醛腹腔注射裸鼠麻醉，固定。分别在裸鼠背侧同时三组分别皮下注射100?l正常、干扰和过表达。细胞按3X106每只的量在裸鼠背侧不同部位注射纤维肉瘤HT1080细胞，注射后14d观察瘤体大小、形态。14d后取材。
2.3PCR检测
应用定量PCR检测P53、survivin，、caspase-3、caspase-7影响纤维肉瘤生长的相关基因表达情况。
2.4WesternBlot检测
应用WesternBlot技术检测hTERT基因干扰影响纤维肉瘤生长的相关信号分子PKB表达情况。
3统计学处理
数据以均数±s表示。采用SPSS13.0统计学软件对所得数据进行单因素方差和t检验进行分析。
结果
1体内hTERT对裸鼠体内纤维肉瘤生长的影响
纤维肉瘤接种于裸鼠，每组接种3×105个细胞，待肿瘤生长14天，测量肿瘤大小，比较其体积，结果发现，与hTERT组比较，hTERT干扰组裸鼠肿瘤体积明显缩小（P<0.05），而hTERT过表达组肿瘤体积明显增大（P<0.01），见图1、2
图4、PKB的表达及统计分析
讨论
HT-1080移植入裸鼠体内14天后，hTERT基因干扰明显抑制肿瘤生长，而过表达则加速肿瘤生长。其作用机制与调节survivin及caspase-3影响细胞凋亡和PKB信号有关。PKB信号通路是细胞内信号传导的重要环节，参与细胞代谢、生存/凋亡、分化和增殖等过程。细胞内Akt/PKB活性状态依赖于其磷酸化与去磷酸化之间的平衡。蛋白磷酸酶PP2A使Akt/PKB去磷酸化而失活，Akt/PKB信号通路调节异常可见于肿瘤、糖尿病甚至精神分裂症等。肿瘤组织中Akt/PKB活性水平高可以是Akt/PKB信号通路上游调节异常造成的，如PI3K亚基或PTEN的基因突变，或者Akt/PKB基因扩增造成的。Akt/PKB被认为参与了多种肿瘤的发生、发展及侵袭转移。近年Akt/PKB信号通路正逐渐成为肿瘤发生机制及治疗的研究热点。
1hTERT基因调节体内纤维肉瘤生长
hTERT基因过表达或干扰，均对裸鼠体内肿瘤生长有明显影响。与未转染基因的肿瘤比较，hTERT基因干扰后肿瘤体积明显缩小，而过表达者肿瘤体积增大，说明hTERT基因在体内能负向和正向调节肿瘤生长。这可能与hTERT移植和加速肿瘤细胞生长有关。文献显示，体内给予hTERT基因干扰可以明显抑制膀胱癌的生长[3]，还明显抑制前列腺癌的生长[4]。反之，过表达hTERT基因加速了纤维肉瘤细胞的生长[5]。
综上，hTERT基因过表达和干扰能有效调控体内纤维肉瘤生长。从而为应用hTERT基因干预纤维肉瘤提供了科学依据。
2hTERT基因调节纤维肉瘤生长的分子机制
2.1hTERT过表达促进存活
在肿瘤的生长过程中，由于生长速度大于细胞凋亡程度，所以，肿瘤生长过表达hTERT基因，通过抑制细胞凋亡进一步加速了肿瘤的生长。正常肿瘤就有散在凋亡细胞，而大部分细胞为存活细胞。过表达hTERT基因后，凋亡细胞会明显减少。hTERT基因与细胞凋亡有关已经有诸多报道，过表达hTERT基因可明显减少诱导的纤维细胞凋亡[6]。因此，细胞凋亡抑制是hTERT基因过表达促进肿瘤生长的形态基础。本实验中，我们发现hTERT干扰有效减少裸鼠体内肿瘤体积。其形态基础可能与hTERT干扰有效抑制细胞凋亡有关。文献报道，下调hTERT基因明显抑制淋巴细胞的生长[7]。而其机制与hTERT基因干扰的抗凋亡效应相关。如抑生长的抑癌基因P53表达可明显抑制端粒酶活性，从而影响细胞生长。
2.2hTERT干扰调节survivin和caspase-3表达
细胞存活和凋亡主要受生长因子和凋亡调控，本研究中我们主要检测了凋亡相关分子caspase-3，caspase-7和存活因子survivin及抑癌基因P53与hTERT基因干扰和过表达的关系，结果发现，hTERT干扰不影响P53和caspase-7的表达，但影响caspase-3和survivin表达。Survivin是与细胞存活有关的重要分子，有利于维持细胞存活。Survivin对内皮细胞修复有重要作用[8]。
本研究发现hTERT过表达和干扰能影响survivin表达，进而与细胞存活有关。Caspase-3是与细胞命运有关的促凋亡作用，在凋亡信号中发挥重要作用。本研究显示，hTERT过表达和干扰明显抑制和上调caspase-3表达，提示hTERT通过影响caspase-3分子调节细胞命运。文献显示，caspase-3分子与细胞凋亡有关。在肿瘤细胞凋亡中，caspase-3表达明显增加[9]。在脑缺血中皮质神经凋亡引起caspase-3上调[10]，因此，caspase-3是凋亡过程中的重要促进因子。我们的结果支持hTERT对caspase-3的调节作用。
2.4hTERT与p53和caspase-7表达无关
本实验中，我们没有发现P53和caspase-7表达水平改变。这说明，hTERT基因干扰不影响该两因子表达。提示hTERT基因下游通路与P53和caspase-7关系不大。结合hTERT干扰影响caspase-3和survivin表达分析，证明hTERT可能主要通过caspase-3和survivin发挥作用，而与P53和caspase-7无明显关联。
3.5hTERT与PKB信号调节
PKB又名AKT，是细胞凋亡和存活相关的信号分子，损伤修复中发挥重要作用[11-12]。本实验中，hTERT过表达和干扰相应调节了PKB表达，即hTERT的生物学效应与PKB通路有关。文献显示，AKT/PKB信号广泛参与了细胞周期，细胞死亡[13-15]，细胞存活[16-18]，细胞生长与蛋白合成新过程[19-22]。在外来刺激因素作用下，信息通过TrK受体，整合素（integrin），细胞因子受体等接受、传递进入到细胞。在细胞质中，首要经过的中继站即是AKT即PKB。以AKT为核心经过GSK3β[23-25]抑制cyclinD来促进细胞周期，通过抑制P21，加速细胞死亡[26]。而AKT也可直接抑制P53加速细胞死亡[27]，AKT还可通过mTOR信号移植44-BP和elf-4来促进蛋白的合成，mTOR也可直接激活P20S4K促进细胞生长[28]。AKT还可直接激活ERK信号，再刺激P70S6K加速细胞生长[29]。AKT还通过抑制BAD和进一步抑制调节Bcl-XL来影响细胞存活[30]。一些资料还显示AKT通过抑制ASK1和JLP1影响JNK信号通路[31].可见PKB即AKT在诸多细胞生物现象中发挥关键作用，本实验中，我们发现hTERT过表达和干扰相应地上调了PKB的表达，即hTERT通过PKB信号影响纤维肉瘤生长和细胞存活与凋亡。
综上所述，本实验通过建立了纤维肉瘤细胞培养模型，构建了hTERT过表达及干扰病毒载体转染纤维肉瘤细胞，通过RNA干扰和过表达技术，研究hTERT对纤维肉瘤细胞生长的影响。发现hTERT调节肿瘤生长于调节survivin，caspase-3及PKB信号有关。研究结果为应用hTERT干扰技术治疗纤维肉瘤及未来骨巨细胞瘤治疗奠定了基础。
参考文献：
[1]HarleyCB，FutcherAB，GreiderCW，Telomeresshortenduringageingofhumanfibroblasts，Nature，1990；345（6274）：458-60.
[2]HastieND，DempsterM，DunlopMG，ThompsonAM，GreenDK，AllshireRC，Telomerereductioninhumancolorectalcarcinomaandwithageing，Nature，1990；346（6287）：866-8.
[3]LinZou，PenghuiZhang，ChunliLuoetal.shRNA-targetedhTERTsuppresscellproliferationofbladdercancerbyinhibitingtelomeraseactivity.CancerChemotherapyandPharmacologyMarch2006，Volume57，Issue3，pp328-334
[4]PaoloGandellini，MarcoFolini，RobertoBandieraetal.Down-regulationofhumantelomerasereversetranscriptasethroughspecificactivationofRNAipathwayquicklyresultsincancercellgrowthimpairment.BiochemicalPharmacology.1June2007，Pages1703–1714.
[5]ChunhuiXuPh.D，JianjieJiang，VirginieSottile.ImmortalizedFibroblast-LikeCellsDerivedfromHumanEmbryonicStemCellsSupportUndifferentiatedCellGrowth.STEMCELLS，NOV2004DOI：10.1634/stemcells.22-6-972.
[6]VeraGorbunova，AndreiSeluanov，OliviaM.Pereira-Smith.ExpressionofHumanTelomerase（hTERT）DoesNotPreventStress-inducedSenescenceinNormalHumanFibroblastsbutProtectstheCellsfromStress-inducedApoptosisandNecrosis.TheJournalofBiologicalChemistry，277，38540-38549.
注：本文为黑龙江省大庆市科技局指导立项项目