导读:本文包含了末端肽段论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:心血管病学,心房颤动,迷走神经,Gαi2C末端肽段
末端肽段论文文献综述
蒋华,张健,周贤惠,李耀东,汤宝鹏[1]（2015）在《靶向转导外源性Gα_(i2) C-末端肽段对迷走神经介导心房颤动诱发的影响》一文中研究指出目的探讨外源性Gαi2C末端肽段(Gαi2C-terminal peptide,Gαi2ctp)对迷走神经介导心房颤动(简称房颤)诱发的影响。方法健康成年家犬14只随机分为两组:对照组(n=7),给予单纯的超声微泡造影剂;实验组(n=7),给予制备好的携Gαi2ctp靶向超声造影剂。分别在高位右房(HRA)、左心耳(LAA)及左下肺静脉(LSPV)行Burst刺激,观察基础状态、迷走神经刺激、靶向转导Gαi2ctp后上述部位房颤诱发率及持续时间的变化。结果 1迷走神经刺激可显着增加心房及肺静脉各部位房颤的诱发率和持续时间。2实验组左房靶向转导Gαi2ctp后0.5、1、2 h LAA和LSPV房颤诱发率(分别为15.9%、14.3%、14.3%和17.5%、19.0%、17.5%)较基础状态(分别为31.7%和33.3%)明显下降(P<0.05);与对照组相比,实验组左心房靶向转导Gαi2ctp后LAA、LSPV房颤诱发率下降(P分别﹤0.01、0.05)。3实验组左房靶向转导Gαi2ctp后0.5、1、2 h LAA、LSPV房颤持续时间(分别为16.43±3.59、16.57±2.64、15.14±4.14 s和17.57±4.47、16.85±2.91、17.29±3.40 s)较基础状态(分别为22.01±4.83和23.29±4.27 s)下降(P<0.01)。与对照组相比,实验左房靶向转导Gαi2ctp后LAA、LSPV房颤持续时间下降,差异有显着性(P<0.01或0.05)。结论靶向转导外源性Gαi2ctp可以减少迷走神经介导房颤的发生。(本文来源于《中国心脏起搏与心电生理杂志》期刊2015年04期）
刘忞博[2]（2013）在《基于生物质谱的蛋白质C末端肽段定性与定量新方法》一文中研究指出本论文主要针对蛋白质C末端进行了系统的研究。基于生物质谱技术,发展了一整套蛋白质C末端的富集、鉴定及相对定量的新技术及新方法,用于高效、准确地揭示蛋白质C末端多方面的生命信息,包括准确的C末端序列测定以及C末端肽段的相对定量,由此对蛋白质C末端在生命活动过程中所起的重要生物意义以及蛋白质降解过程有更好的认识。蛋白质的C末端在蛋白进行各项生命活动过程中都起着极其重要的作用。它不仅标志着DNA转录翻译成蛋白质过程的初步完成,更是参与和调控了蛋白质的各种生理功能。但是目前通过组学手段大规模的鉴定蛋白质C末端的方法仍然局限于经典的质谱鉴定策略,并没有一套完善的富集与鉴定蛋白C末端的方法。对于数据库内不存在的蛋白质新C末端的鉴定,以目前的鉴定方法仍然很难实现。所以在蛋白质C末端越来越受到人们重视的同时,目前也亟需在方法学上有进一步的突破。本论文结合恶唑酮化学,使蛋白质C末端可以特异性地带有标签,在此基础上发展了一系列的衍生化试剂,用于蛋白质C末端的富集、定性及相对定量,并且能够对生命体中内源性降解产生的新C末端进行鉴定甚至是De novo测序。此外,对于“自下而上”技术路线中一个关键的步骤---酶解的效率不够高的难题,发展了物理吸附型的酶解反应器并从原理上探讨了其工作机理。所以本论文致力于建立高效、实用的C末端新的分析策略,解决当今蛋白质C末端组学上面临的技术难题。本论文工作的主要成果和突出贡献如下：第一章绪论简要概述了基于大分子生物质谱的蛋白质组学研究对象及其研究意义。对于目前广泛使用的各种定性和定量技术及其中存在的主要问题作了基本的介绍。特别着重对提高酶解环节效率的固定化酶解反应器进行了详尽的描述。论文详细阐述了蛋白质C末端的研究意义以及在研究中所面临的主要困难,并按照各种富集鉴定方法所采用的原理进行了分类并一一作了归纳和总结。最后,提出了本论文选题的目的和意义所在。第二章针对蛋白质C末端难以通过传统的生物质谱鉴定方法确认和鉴定,并且无法在质谱中识别内源性新产生的蛋白质C末端的难题,发展了一种基于恶唑酮化学的同位素标记策略,实现在复杂的生物样品中同时进行蛋白质C末端的鉴定和相对定量。该方法结合了恶唑酮化学法和轻重双标的精氨酸同位素标记。通过恶唑酮反应,精氨酸特异性地与蛋白的α-羧基结合。将蛋白酶解之后,带有同位素标签的C末端肽段在质谱中会以对峰的形式呈现,从而与其他的酶解肽段区分开来。通过进一步的串联质谱分析,得到C末端肽段的序列信息。使用精氨酸作为衍生化试剂,可以增强C末端肽段的碱性,大大提高了肽段在质谱中的离子化效率。此外,轻重双标的同位素标记还可以实现蛋白C末端肽段的相对定量。当标有轻重同位素标记的样品混合后进行质谱分析,同位素峰的信号强度之比即代表了来源于不同样本之间C末端肽段的相对含量比例。通过标准肽段以及标准蛋白定量方法的检验,显示出该方法有着良好的动态线性范围。研究表明在2个数量级的范围内都保持一致的线性和很高的重现性。相关系数(R2)都在0.99以上,且变异常数(CV)控制在11%以内。随后该方法运用于腾冲嗜热菌的研究之中,用于考察在不同温度条件培养下的腾冲嗜热菌的蛋白C末端的表达水平的差异。共有68条C末端肽段被成功鉴定到,其中有53条在两个温度下的腾冲嗜热菌中都被鉴定到并有相对定量信息。在有表达差异的C末端肽段中,大部分都归属于各种酶蛋白,所以我们推想,温度确实是一个影响腾冲嗜热菌生物活性的重要因素。此外,该方法同样可以去寻找和验证生命体内的内源性新C末端(neo-C-termini).总共有24条非C末端肽段作为可能是内源性新产生的C末端肽段被成功鉴定。大部分都定位于完整蛋白的N末端或者C末端附近,说明了蛋白的N端和C端有着非常高的反应活性,在生命活动中也起着非常重要的作用。第叁章作为第二章工作的延续和深入,针对C末端肽段在整个样品中的相对含量较低,并且蛋白质丰度动态范围过大,不利于质谱鉴定等问题,发展了与目前应用的反向富集相反的正向富集策略。在恶唑酮化学的基础上,使一端连有生物素(biotin),一端连有精氨酸的双功能化试剂与蛋白的C末端特异性的结合。标记的蛋白在酶解后,通过链霉亲和素(streptavidin)与生物素之间的亲和作用,将C末端肽段进行特异性的富集。这样的富集策略,可以大大减少样品的复杂程度,提高C末端的鉴定效率以及鉴定通量。首先在标准肽段和标准蛋白层面上,对恶唑酮反应条件以及链霉亲和素富集的条件进行了摸索和优化,标记反应的效率能够提高到90%以上,并且富集的特异性也得到了保证,在标记肽段和非标记肽段1：50混合的情况下,仍然能够达到很好的富集效果。衍生化试剂中由于含有精氨酸,可以增强C末端肽段的碱性,这大大提高了肽段在质谱中的离子化效率。此外针对于标记肽段在二级谱图中一些特殊的碎裂结果,对蛋白数据库检索方式也进行了优化。标记上的精氨酸和生物素在二级质谱图中也会呈现出类似于b,y离子的子离子峰,但是在搜库中并没有加以利用,所以我们设置了生物素作为第21种氨基酸,并修改了蛋白的数据库,在蛋白C末端之后人为的加上了精氨酸和生物素的序列,以提高C末端肽段的质谱鉴定效率。随后我们将该方法应用于实际样品的C末端检测中,选取腾冲嗜热菌为模式生物,经过叁次的技术重复后,总共有183条C末端肽段被成功的鉴定到,比先前鉴定得到的数据规模有了极大的提高。第四章针对传统的酶解过程中较低的酶解效率以及自降解现象导致整个技术流程的灵敏度和效率过低的问题,从固定化酶解反应器角度入手,系统而深入地讨论了物理吸附类型的酶解反应器的工作过程。我们同时考虑了静电相互作用和亲疏水性作用对物理吸附带来的不同效应。首先为此合成了一系列由不同高分子层包裹的纳米硅球,详细地评估了不同纳米硅球在催化酶解过程中发挥的效率问题。我们合成了外层分别包覆聚二烯丙基二甲基氯化铵(poly diallyldimethylammonium chloride, PDDA)和聚苯乙烯磺酸(poly styrene sulfonate, PSS)的纳米硅球。这两种硅球表面聚合物的电荷性质不同,在酶解体系(25 mM碳酸氢铵,pH约为8)中分别带有正电荷及负电荷,而聚合物包裹又保证了纳米硅球的尺寸和形貌的一致性。此外还合成了表面连有疏水性有机长链的纳米硅球,该类硅球在酶解体系中保留了原硅球表面所带的负电荷,同时在水溶液体系中又具有疏水性的特点。不同材料分别用于标准蛋白细胞色素C和卵清白蛋白的酶解实验研究。这两种蛋白在酶解溶液体系中带有不同的电荷,但都属于疏水性蛋白。我们发现不同的材料对于具有不同等电点的蛋白有着明显差异的酶解效率。所以静电作用确实在吸附过程中是作为决定性的驱动力作用,在静电相互作用的存在下,亲疏水性作用只是一个次要因素。如果蛋白酶和待酶解的底物蛋白都带有与材料相反的电荷,那么在静电相互作用的影响下,它们能够同时被吸附在固相载体的表面,在材料周围局部范围内提高了蛋白酶以及蛋白的浓度,从而使得酶解过程在较短的时间内达到平衡,提高了酶解效率。另一方面,如果酶和底物两者带有异种电荷,那么它们始终不能同时被一种材料吸附,所以相比于传统的溶液酶解,此类的吸附酶解反应器的效率并不能有所提高。除了确定物理吸附型酶解反应器中起决定作用的吸附因素之外,对于吸附-酶解的动力学过程也尝试了基本的研究。我们发现不管是异种电荷相吸还是同种电荷相斥,基于静电相互作用的吸附平衡总是能够在很短的时间内达到,所以如果将酶解反应器看做是一个吸附-酶解的二级反应的话,蛋白的酶解过程是整个吸附酶解反应中的决速步骤。这对今后进一步的研究酶解动力学问题起着很好的指导作用,为发展下一代的吸附型酶解反应器建立了一定的理论基础和指导帮助。综上所述,本论文围绕蛋白C末端研究中鉴定和富集方面的热点、难点问题,以恶唑酮化学结合各种标记试剂为技术手段,以发展相关的蛋白质组学C末端研究新技术新方法并进行实际的应用研究为目标,建立了将化学衍生标记应用于质谱分析的策略,为解决蛋白质组学中C末端肽段的富集、识别、质谱鉴定以及相对定量提供了新颖有效的研究手段和方法。(本文来源于《复旦大学》期刊2013-10-01）
孔倩倩,廖红,李芳秋,马春芳,史利宁[3]（2012）在《白念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Set1-208p的原核细胞表达及鉴定》一文中研究指出目的原核细胞表达白念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Set1-208p,鉴定重组蛋白质的抗原性。方法用比对软件对白念珠菌H3K4甲基转移酶与其他物种甲基转移酶进行比对。选择与人类无同源性的抗原特异性片段,以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,PCR扩增Set1-208p的编码基因,以pET28a(+)为载体,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白质表达。用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊侵袭性白念珠菌感染(IC)患者血清进行抗原性鉴定。结果成功克隆了白念珠菌抗原特异性H3K4甲基转移酶片段Set1-208p基因并诱导表达,获得了纯化的重组肽段,所得蛋白质分子量(Mr)约为29 000,带有His标签,经western blot鉴定,诱导的重组蛋白可与IC患者血清特异性反应。结论成功诱导表达了具有良好抗原反应性的Set1-208p重组蛋白质,为建立相应的抗原、抗体ELISA检测方法提供基础。(本文来源于《临床检验杂志》期刊2012年11期）
肖卓妮,徐望明,杨菁[4]（2012）在《哺乳动物极性蛋白mInscuteable-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达与纯化》一文中研究指出目的:构建哺乳动物极性蛋白mInscuteable C末端257～532位氨基酸结构域与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白GST-mInsc 257～532的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:将已经构建好的mInsc 257～532位氨基酸序列克隆至原核表达载体pGEX-4T中,构建重组的质粒pGEX-4T/mInsc 257～532;将重组质粒转化感受态细菌BL21,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST蛋白;经谷胱甘肽-琼脂糖球珠分离纯化;产物经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。结果:获得高表达及纯化的pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白。结论:成功构建重组pGEX-4T/mInsc 257～532原核表达载体;诱导表达pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白并纯化。(本文来源于《神经损伤与功能重建》期刊2012年04期）
陆意[5]（2009）在《C末端肽段在RON/RON△160所介导的信号传导及致瘤活性中的作用》一文中研究指出背景：受体酪氨酸激酶RON在上皮细胞的生长、分化、增殖等过程中发挥着一定的作用。RON在乳腺，结肠，肺，甲状腺，皮肤，膀胱和胰腺肿瘤等组织中呈高度表达，而在正常上皮组织中呈低表达或不表达。RON的异常表达常伴随变异体产生。变异体RON△160的过度表达是结肠癌细胞的一个特征。RON含有多个功能性的结构域，如胞外的SEMA结构域、PSI基团、IPT单位和胞内的邻膜区、激酶区和C-末端磷酸化位点等。不同的结构域在RON介导的生物学活性中发挥着不同的作用。缺失或截断都会导致RON受体磷酸化活性改变。变异体RON△160缺失胞外段第一个IPT单位，使它具有致瘤性。C-末端位于RON第20外显子，在调节RON活性中发挥两个作用。一方面，其包含一个多功能结合位点—Y~(1353)VQL-PAT-Y~(1360)序列。该位点能招募下游的信号分子，如PI-3K，Smad，Grb2，STAT3等。当RON与特异性配体结合后，该位点的酪氨酸残基发生磷酸化、传导信号。但是包含两个突变位点Y~(1353)和Y~(1360)的突变体RON~(M1254T)显示这个多功能位点对致瘤活性不是必需的。另一方面，体外实验显示整个C-末端对RON激酶活性有自我抑制作用，主要通过是C-末端Tyr1353／1360残基与激酶区Tyr1238／1239残基之间的结合起作用。研究发现C-末端的Tyr1353／1360残基发生突变或被Phe替代后，C-末端与激酶区的结合更加紧密，进一步抑制RON活性。因此，C末端在RON介导的生物学活性中的作用有待于进一步研究。目的：本课题旨在研究RON蛋白在正常人消化道上皮组织及其癌变细胞中的表达状态，同时着重探讨RON-C末端肽段在RON及其变异体RON160所介导的信号传导及致瘤活性中的作用。材料与方法：采用单克隆抗体杂交瘤技术，制备并鉴定数个具有生物学活性的特异性抗RON单克隆抗体。通过免疫组织化学的方法，用抗RON单抗(2F2)，检测了RON在正常人消化道及癌症组织中的表达。所用的组织芯片类型包括：正常成人、胚胎及多种消化道肿瘤组织。利用PCR方法构建了C末端缺失的两个RON变异体——RON-CF和RON△160-CF。通过细胞表达、蛋白化学分析、生物学功能及动物体内实验等实验方法，研究了C末端在RON及RON△160在促进细胞侵袭性生长中的一些作用及机理。结果：1、成功制备了特异性抗RON单克隆抗体Zt／g4、2F2和2C6，初步鉴定了它们在免疫组化、ELISA、免疫沉淀、免疫荧光等方面的性状。其中Zt／g4和2F2主要识别RON胞外段，两者都具有激活RON磷酸化的活性。2C6主要识别胞内段，没有明显抑制或激活RON的生物学活性；2、组织芯片的免疫组化结果显示，RON在消化系统的胚胎和成人组织中几乎不表达或呈低水平表达，两者的表达和分布没有明显差异；在食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌组织中，RON蛋白呈异常表达，其中50％以上的结直肠癌组织中RON为过度表达：3、C末端缺失的RON蛋白呈现明显的生化及生物学功能的异常，主要表现为：1) C末端缺失后导致RON受体无法发生二聚体化，蛋白磷酸化的作用消失；2)在RON介导的信号通路中，C末端缺失后RON／RON△160的自体磷酸化功能丧失、下游信号蛋白(Erk1／2、AKT)的磷酸化也抑制，RON△160介导的细胞浆内β-catenin的积聚的功能减弱；3)C末端去除后导致RON△160介导的细胞增殖、形态改变、迁移和动物体内致瘤效应等活性明显丧失。结论：RON蛋白在正常人胚胎和成人消化道上皮组织中呈微量表达状态，而在部分消化道肿瘤组织，特别是在大肠癌中呈过度表达，提示RON的过表达可能和大肠癌的发生和进展有一定的病理联系。RON蛋白C末端是调节RON生物学功能的重要结构组成部分，通过影响RON受体的磷酸化，调节胞内信号蛋白途经的激活，从而调节细胞的生物学功能。(本文来源于《浙江大学》期刊2009-05-14）
彭冰,岳军,杜彩萍,侯筱宇[6]（2008）在《L型电压门控钙通道α_(1C)亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达》一文中研究指出目的构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的L型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channels,L-VGCCs)α1C亚基羧基末端肽段(CT,1587-2169)的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法采用RT-PCR方法扩增CT的cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1;采用PCR方法扩增标签蛋白EGFP的cDNA,克隆至重组体pcDNA3.1-CT,EGFP位于CT的羧基末端;采用脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞,通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达。结果扩增了CT和EGFP的cDNA;构建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;荧光显微镜下转染重组质粒的COS-7细胞中观察到绿色荧光,免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带。结论成功构建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到表达。(本文来源于《徐州医学院学报》期刊2008年07期）
赵丽艳[7]（2008）在《基于生物质谱技术和蛋白质化学的蛋白质N-末端肽段分离分析新方法研究》一文中研究指出蛋白质组学研究已经成为生命科学研究领域的前沿课题。它的主要研究内容包括分离和分析细胞及组织中的全部蛋白质,探索其表达与细胞功能的关系,发现具有诊断价值的疾病标志物和可作为药物靶标的功能蛋白质。蛋白质的N-末端包含许多有价值的信息。首先,蛋白质的叁维结构特征对其生物学功能有着巨大的影响,而蛋白质的空间构象直接取决于其一级结构。因此,一级结构即氨基酸序列的测定已经成为研究蛋白质性质和功能的重要途径,而N-末端肽的鉴定更是其中的关键组成部分。所有蛋白质的合成都起始于N端(通常为Met或N-甲酰化的Met),所以这个区域提供了蛋白质加工最初的、并且重要的位点,对其生物学功能有着巨大的影响。例如蛋白质的半衰期与N端氨基酸的特异性有关,即N端氨基酸残基对蛋白质的寿命有控制作用(N-end rule)。而N端乙酰化、豆蔻酰化等修饰造成蛋白质N-末端的封闭,这些修饰都可能与蛋白质的稳定性、功能和降解相关。另外,蛋白质的末端序列特异性很高,通过末端少数的几个氨基酸残基就可以实现对大多数蛋白质的可靠鉴定。根据对SWISS-PROT数据库的统计,N-末端5个氨基酸残基长度的序列对蛋白质鉴定的特异性,依据物种不同,平均达到了78~97%。生物质谱已经成为蛋白质组学研究中蛋白质鉴定和定量的关键技术,基于质谱技术的肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF)和串联质谱(MS/MS)方法(包括肽序列标签(peptide sequence tag, PST)和从头测序(de novo sequencing)技术)结合生物信息学的数据检索和分析工具,已经建立了蛋白质组研究中规模化蛋白质鉴定的通用策略。由于末端序列的高特异性和高信息量,基于N-端和C-端氨基酸序列分析的蛋白质组学(terminal proteomics)将会对蛋白质的鉴定和功能分析提供更有价值的信息。随着翻译后修饰蛋白质组研究的深入开展,也有必要对蛋白质N端修饰进行系统研究。但是由于蛋白质肽段混合物高度的复杂性,且N-末端发生修饰的多样性和不均一性,都使目前蛋白质N端肽的针对性研究较少,还没有一种简便可靠的方法可以规模化地将末端肽从蛋白质肽段混合物中选择性地分离并鉴定出来,基于N端肽的蛋白质组定量方法也鲜有报道。基于此,本研究采用纳米级Fe3O4为载体,首次制备了表面键合异硫氰酸苯酯官能团的磁性纳米材料,建立了基于新型纳米材料的操作简便、快捷的封闭N端肽分离鉴定新方法,并用于人肝癌细胞系HepG2的蛋白质N-末端肽的分离鉴定中,获得了满意的结果。在此基础上,又发展了一种N端肽酸酐同系物标记结合质谱技术的蛋白质组相对定量新方法,该方法有效避免了大部分常用同位素试剂因质量差别小,易产生同位素峰重迭,造成定量不准确的问题;论文最后探索了磺酸化修饰结合离子交换色谱-质谱技术的方法在大肠杆菌N-末端肽富集鉴定中的应用。研究分为以下几部分:第一章,主要综述了目前蛋白质组学分离鉴定研究中的关键技术——电泳、色谱等高效的分离技术、软电离的质谱技术、生物信息学及其它新技术的发展和应用;特别是具有重要生物学意义的蛋白质N端序列的研究方法进展,并依此提出了本课题的研究方向。第二章,针对目前蛋白质组学中对蛋白质N-末端的研究方法较少、操作繁琐及缺乏针对性分离鉴定方法的问题,首次合成了一种新型异硫氰酸苯酯(DITC)键合的磁性纳米粒子(MNPs),并将其用于蛋白质封闭N-末端肽的分离鉴定中。首先通过化学共沉淀法合成了四氧化叁铁的磁性核心,并在核心外包裹硅氧烷,然后通过中间交联体将苯异硫氰酸酯官能团连接到材料表面,最终得到异硫氰酸苯酯键合的磁性纳米材料,并进行了材料的电镜及红外表征。蛋白质经过变性、还原、烷基化、酶切处理后,用氧-甲基异脲封闭肽段侧链的ε-氨基;然后与DITC-MNPs混合反应。在偏碱性的环境中,含有自由氨基的肽段共价结合到磁性材料上,通过外加磁场的作用,封闭的N端肽段留在溶液中被分开进而进行质谱鉴定。与现有的方法相比,DITC-MNPs与肽段的氨基是共价作用,比一些亲和方法的作用力更强,因此可以对封闭的N端肽有更特异的分离;而与使用微米级的功能材料相比,纳米级磁性材料极大的比表面积使其具有更大的负载量;并且DITC-MNPs材料制备方便、消耗少、分离操作简便快捷。此方法为不能进行Edman测序的N端封闭蛋白质的N端测序提供了操作方便、快速的鉴定方法;并将其用于复杂体系——人肝癌HepG2细胞系的蛋白质封闭N-末端肽的分离鉴定中。第叁章,针对使用稳定同位素标记进行蛋白质相对定量研究时同位素峰易重迭影响定量结果的准确性,以及同位素试剂价格昂贵的问题,进行了N-末端酸酐同系物标记结合质谱技术在蛋白质相对定量中的初步研究。通过酸酐同系物标记蛋白质的N-末端,经过凝胶电泳分离,使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行鉴定,建立了一种基于化学标记和质谱技术相结合的蛋白质N-末端鉴定和相对定量新方法。标记后的N-末端肽以相差14 Da的成对峰形式在质谱中出现,而非N-末端肽则是单峰呈现,从而实现了末端肽的特异性识别;通过对叁种蛋白质进行同系物标记,然后按不同比例混合的溶液进行相对定量,其定量误差分别为16.16%、4.75%和-24.18%。与同位素试剂类似,同系物化合物有着相似的物理化学性质而质量数不同,因此可以用于分别标记样品和定量;此外,酸酐同系物试剂比同位素试剂价格便宜,降低了实验消耗;同时14 Da的质量差避免了大部分同位素试剂之间较小质量差所带来的质谱图上同位素簇峰的重迭,还不易与其它常见的质量差(如18 Da的脱水、17 Da的脱氨及16 Da的甲硫氨酸氧化)混淆;最后,酰化标记反应可以在常用的蛋白质溶解缓冲液中高效进行,并允许尿素、SDS等变性剂或去污剂的存在。此方法适用于所有N-末端未封闭的蛋白质的相对定量分析。第四章,由于蛋白质的N-末端是可以修饰的,而发生在生物体内的蛋白质N端修饰状态是不清楚的,即使是注释信息最可靠的蛋白质数据库SWISS-PROT,有关蛋白质N-末端的信息也很贫乏,因此这对所有基于数据库检索的蛋白质N-端分析方法造成困难。磺酸化修饰后的肽段在MS/MS中会有连续的y系列离子出现,有利于进行肽段的de novo测序。因此,本章探索了磺酸化修饰结合离子交换色谱分离和质谱鉴定的方法在大肠杆菌N-末端肽富集鉴定中的应用。鉴定到的末端序列特征与已知信息有很好的一致性,研究发现与氨基端Met残基毗邻的氨基酸残基为Ala、Gly等时,蛋白质更容易发生Met剪切;并找到了一条去除23个氨基酸残基的信号肽的端肽。总之,本论文发展了功能化磁性材料并建立了结合化学方法的叁种有效的分离分析方法,为蛋白质的N-末端肽的分离富集和鉴定提供了简捷、通量化的研究手段,无论是对其一级结构的分析还是对蛋白质的末端加工、修饰研究,都具有参考价值和意义。(本文来源于《中国人民解放军军事医学科学院》期刊2008-05-30）
李晓萌,李江,杨南扬,关新刚,张淑芝[8]（2008）在《水通道蛋白1-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达(简报)》一文中研究指出水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是一类选择性高效转运水分子的细胞膜通道蛋白,广泛存在于原核和真核生物细胞的细胞膜上,主要介导自由水分子的被动跨膜转运,对保持细胞内外液环境的稳态平衡起着重要的作用。AQP1是第一个被发现鉴定的水通道蛋白,它是1988年Agre等从红细胞膜分(本文来源于《分子细胞生物学报》期刊2008年01期）
耿芳宋,静国忠,许小幸,段建华,王秀丽[9]（1997）在《葡萄球菌核酸酶去C-末端的肽段52和79的分离纯化》一文中研究指出①目的建立金黄色葡萄球菌核酸酶（ＳＮａｓｅ）去Ｃ－末端的肽段５２（ＳＮ５２）和７９（ＳＮ７９）的提纯方法，并鉴定其纯度。②方法应用低温乙醇沉淀，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－１００柱层析分离纯化；十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）和高效液相层析（ＨＰＬＣ）鉴定其纯度。③结果纯化的ＳＮ５２和ＳＮ７９经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定均为单一区带；ＨＰＬＣ鉴定均为一个峰。④结论纯化的ＳＮ５２和ＳＮ７９已达电泳纯和层析纯，可用于其构象的比较研究。(本文来源于《青岛医学院学报》期刊1997年03期）
静国忠,刘利军,刘志革,邹强,蒋美岩[10]（1995）在《金黄色葡萄球菌核酸酶去C-末端肽段在E.coli中的高效表达》一文中研究指出报道了7个金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)C-末端缺失突变体在E. coli细胞中的高效表达,其表达量可占细胞总蛋白量的16.90％～57.7％,即使仅由52个残基组成的小肽段,也能在细胞中稳定积累,然而,SNase的C-末端缺失明显地影响到肽段的分泌表达水平乃至越膜分泌。实验指出,7个肽段都能同抗SNase多克隆抗体呈特异性免疫反应,较长的肽段仍保留着不同程度的SNase的催化活性。(本文来源于《自然科学进展》期刊1995年05期）
末端肽段论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本论文主要针对蛋白质C末端进行了系统的研究。基于生物质谱技术,发展了一整套蛋白质C末端的富集、鉴定及相对定量的新技术及新方法,用于高效、准确地揭示蛋白质C末端多方面的生命信息,包括准确的C末端序列测定以及C末端肽段的相对定量,由此对蛋白质C末端在生命活动过程中所起的重要生物意义以及蛋白质降解过程有更好的认识。蛋白质的C末端在蛋白进行各项生命活动过程中都起着极其重要的作用。它不仅标志着DNA转录翻译成蛋白质过程的初步完成,更是参与和调控了蛋白质的各种生理功能。但是目前通过组学手段大规模的鉴定蛋白质C末端的方法仍然局限于经典的质谱鉴定策略,并没有一套完善的富集与鉴定蛋白C末端的方法。对于数据库内不存在的蛋白质新C末端的鉴定,以目前的鉴定方法仍然很难实现。所以在蛋白质C末端越来越受到人们重视的同时,目前也亟需在方法学上有进一步的突破。本论文结合恶唑酮化学,使蛋白质C末端可以特异性地带有标签,在此基础上发展了一系列的衍生化试剂,用于蛋白质C末端的富集、定性及相对定量,并且能够对生命体中内源性降解产生的新C末端进行鉴定甚至是De novo测序。此外,对于“自下而上”技术路线中一个关键的步骤---酶解的效率不够高的难题,发展了物理吸附型的酶解反应器并从原理上探讨了其工作机理。所以本论文致力于建立高效、实用的C末端新的分析策略,解决当今蛋白质C末端组学上面临的技术难题。本论文工作的主要成果和突出贡献如下：第一章绪论简要概述了基于大分子生物质谱的蛋白质组学研究对象及其研究意义。对于目前广泛使用的各种定性和定量技术及其中存在的主要问题作了基本的介绍。特别着重对提高酶解环节效率的固定化酶解反应器进行了详尽的描述。论文详细阐述了蛋白质C末端的研究意义以及在研究中所面临的主要困难,并按照各种富集鉴定方法所采用的原理进行了分类并一一作了归纳和总结。最后,提出了本论文选题的目的和意义所在。第二章针对蛋白质C末端难以通过传统的生物质谱鉴定方法确认和鉴定,并且无法在质谱中识别内源性新产生的蛋白质C末端的难题,发展了一种基于恶唑酮化学的同位素标记策略,实现在复杂的生物样品中同时进行蛋白质C末端的鉴定和相对定量。该方法结合了恶唑酮化学法和轻重双标的精氨酸同位素标记。通过恶唑酮反应,精氨酸特异性地与蛋白的α-羧基结合。将蛋白酶解之后,带有同位素标签的C末端肽段在质谱中会以对峰的形式呈现,从而与其他的酶解肽段区分开来。通过进一步的串联质谱分析,得到C末端肽段的序列信息。使用精氨酸作为衍生化试剂,可以增强C末端肽段的碱性,大大提高了肽段在质谱中的离子化效率。此外,轻重双标的同位素标记还可以实现蛋白C末端肽段的相对定量。当标有轻重同位素标记的样品混合后进行质谱分析,同位素峰的信号强度之比即代表了来源于不同样本之间C末端肽段的相对含量比例。通过标准肽段以及标准蛋白定量方法的检验,显示出该方法有着良好的动态线性范围。研究表明在2个数量级的范围内都保持一致的线性和很高的重现性。相关系数(R2)都在0.99以上,且变异常数(CV)控制在11%以内。随后该方法运用于腾冲嗜热菌的研究之中,用于考察在不同温度条件培养下的腾冲嗜热菌的蛋白C末端的表达水平的差异。共有68条C末端肽段被成功鉴定到,其中有53条在两个温度下的腾冲嗜热菌中都被鉴定到并有相对定量信息。在有表达差异的C末端肽段中,大部分都归属于各种酶蛋白,所以我们推想,温度确实是一个影响腾冲嗜热菌生物活性的重要因素。此外,该方法同样可以去寻找和验证生命体内的内源性新C末端(neo-C-termini).总共有24条非C末端肽段作为可能是内源性新产生的C末端肽段被成功鉴定。大部分都定位于完整蛋白的N末端或者C末端附近,说明了蛋白的N端和C端有着非常高的反应活性,在生命活动中也起着非常重要的作用。第叁章作为第二章工作的延续和深入,针对C末端肽段在整个样品中的相对含量较低,并且蛋白质丰度动态范围过大,不利于质谱鉴定等问题,发展了与目前应用的反向富集相反的正向富集策略。在恶唑酮化学的基础上,使一端连有生物素(biotin),一端连有精氨酸的双功能化试剂与蛋白的C末端特异性的结合。标记的蛋白在酶解后,通过链霉亲和素(streptavidin)与生物素之间的亲和作用,将C末端肽段进行特异性的富集。这样的富集策略,可以大大减少样品的复杂程度,提高C末端的鉴定效率以及鉴定通量。首先在标准肽段和标准蛋白层面上,对恶唑酮反应条件以及链霉亲和素富集的条件进行了摸索和优化,标记反应的效率能够提高到90%以上,并且富集的特异性也得到了保证,在标记肽段和非标记肽段1：50混合的情况下,仍然能够达到很好的富集效果。衍生化试剂中由于含有精氨酸,可以增强C末端肽段的碱性,这大大提高了肽段在质谱中的离子化效率。此外针对于标记肽段在二级谱图中一些特殊的碎裂结果,对蛋白数据库检索方式也进行了优化。标记上的精氨酸和生物素在二级质谱图中也会呈现出类似于b,y离子的子离子峰,但是在搜库中并没有加以利用,所以我们设置了生物素作为第21种氨基酸,并修改了蛋白的数据库,在蛋白C末端之后人为的加上了精氨酸和生物素的序列,以提高C末端肽段的质谱鉴定效率。随后我们将该方法应用于实际样品的C末端检测中,选取腾冲嗜热菌为模式生物,经过叁次的技术重复后,总共有183条C末端肽段被成功的鉴定到,比先前鉴定得到的数据规模有了极大的提高。第四章针对传统的酶解过程中较低的酶解效率以及自降解现象导致整个技术流程的灵敏度和效率过低的问题,从固定化酶解反应器角度入手,系统而深入地讨论了物理吸附类型的酶解反应器的工作过程。我们同时考虑了静电相互作用和亲疏水性作用对物理吸附带来的不同效应。首先为此合成了一系列由不同高分子层包裹的纳米硅球,详细地评估了不同纳米硅球在催化酶解过程中发挥的效率问题。我们合成了外层分别包覆聚二烯丙基二甲基氯化铵(poly diallyldimethylammonium chloride, PDDA)和聚苯乙烯磺酸(poly styrene sulfonate, PSS)的纳米硅球。这两种硅球表面聚合物的电荷性质不同,在酶解体系(25 mM碳酸氢铵,pH约为8)中分别带有正电荷及负电荷,而聚合物包裹又保证了纳米硅球的尺寸和形貌的一致性。此外还合成了表面连有疏水性有机长链的纳米硅球,该类硅球在酶解体系中保留了原硅球表面所带的负电荷,同时在水溶液体系中又具有疏水性的特点。不同材料分别用于标准蛋白细胞色素C和卵清白蛋白的酶解实验研究。这两种蛋白在酶解溶液体系中带有不同的电荷,但都属于疏水性蛋白。我们发现不同的材料对于具有不同等电点的蛋白有着明显差异的酶解效率。所以静电作用确实在吸附过程中是作为决定性的驱动力作用,在静电相互作用的存在下,亲疏水性作用只是一个次要因素。如果蛋白酶和待酶解的底物蛋白都带有与材料相反的电荷,那么在静电相互作用的影响下,它们能够同时被吸附在固相载体的表面,在材料周围局部范围内提高了蛋白酶以及蛋白的浓度,从而使得酶解过程在较短的时间内达到平衡,提高了酶解效率。另一方面,如果酶和底物两者带有异种电荷,那么它们始终不能同时被一种材料吸附,所以相比于传统的溶液酶解,此类的吸附酶解反应器的效率并不能有所提高。除了确定物理吸附型酶解反应器中起决定作用的吸附因素之外,对于吸附-酶解的动力学过程也尝试了基本的研究。我们发现不管是异种电荷相吸还是同种电荷相斥,基于静电相互作用的吸附平衡总是能够在很短的时间内达到,所以如果将酶解反应器看做是一个吸附-酶解的二级反应的话,蛋白的酶解过程是整个吸附酶解反应中的决速步骤。这对今后进一步的研究酶解动力学问题起着很好的指导作用,为发展下一代的吸附型酶解反应器建立了一定的理论基础和指导帮助。综上所述,本论文围绕蛋白C末端研究中鉴定和富集方面的热点、难点问题,以恶唑酮化学结合各种标记试剂为技术手段,以发展相关的蛋白质组学C末端研究新技术新方法并进行实际的应用研究为目标,建立了将化学衍生标记应用于质谱分析的策略,为解决蛋白质组学中C末端肽段的富集、识别、质谱鉴定以及相对定量提供了新颖有效的研究手段和方法。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
末端肽段论文参考文献
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