吕立华１吕林华２（通讯作者）（１邵阳医学高等专科学校药学系湖南邵阳４２２０００）（２中山大学附一院广东广州５１００８０）
【中图分类号】Ｒ７３０．５【文献标识码】Ａ【文章编号】１５５０－１８６８（２０１４）１０
【摘要】目的：探讨姜黄素对Ｐ糖蛋白介导的胃癌多药耐药的逆转作用及其可能的分子机制。方法：采用二苯基溴化四氮唑蓝法检测人胃癌细胞株加药后的增殖，碘化丙啶染色法检测细胞凋亡率，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测Ｐ－ＡＫＴ和Ｐ－ｇｐ的表达量。结果：姜黄素合用阿霉素处理细胞４８ｈ，阿霉素的浓度在０．０５～５ｕｇ／ｍｌ时，加入姜黄素２５ｕｍｏｌ／ｌ，耐药细胞生存率下降明显（Ｐ＜０．０５），尤以阿霉素０．２５ｕｇ／ｍｌ和姜黄素２５ｕｍｏｌ／ｌ二者联合使用时耐药细胞生存率下降最明显。单用阿霉素组细胞的凋亡率为（１３．２±１．９）％，采用在阿霉素基础上联合使用姜黄素后细胞凋亡率为（２１．３±２．８）％，与单独使用阿霉素相比，阿霉素与姜黄素联合使用诱导细胞凋亡的作用显著增强（Ｐ＜０．０５）。与单用阿霉素０．２５ｕｇ／ｍｌ相比，联合使用姜黄素后ｐ－Ａｋｔ和Ｐ－ｇｐ的表达量明显降低（Ｐ＜０．０１），２组间Ａｋｔ的表达量差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论：姜黄素不增加阿霉素对ＳＧＣ７９０１细胞毒性作用；对于ＳＧＣ７９０１细胞株，姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性；姜黄素明显抑制了ｐ－Ａｋｔ和Ｐ－ｇｐ蛋白的表达。姜黄素可能通过抑制Ａｋｔ信号通路降低Ｐ－ｇｐ的表达进而逆转多药耐药。
【关键词】姜黄素；Ｐ糖蛋白；阿霉素；多药耐药；逆转胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位［１］，然而肿瘤多药耐药性的出现严重影响了胃癌的治疗效果，抑制或者逆转胃癌多药耐药对于胃癌的治疗具有重要意义［２］。研究肿瘤ＭＤＲ及其预防与逆转是肿瘤化疗中函待解决的问题，亦是目前肿瘤研究的难点及热点领域。如何让化疗药物增效减毒是目前肿瘤化疗中函待解决的另一个问题。姜黄素前期研究发现，具有良好的抗肿瘤作用。
１材料与方法１．１材料姜黄素、二苯基溴化四氮唑蓝、二甲基亚砜均购自美国Ｓｉｇｍａ公司，阿霉素购自深圳万乐药业公司。ＤＭＥＭ培养基购自Ｇｉｂｃｏ公司，胃癌耐药株Ｋ５６２／Ａ０２由上海拜力生物科技有限公司提供。细胞在３７℃，５％ＣＯ２条件下培养，初始时在含０．５ｍｇ／ｌ浓度的阿霉素、１０％胎牛血清的ＤＭＥＡ培养基中培养，实验前２ｄ换无药培养基培养。
１．２方法１．２．１药物配制姜黄素溶解在ＤＭＳＯ后，采用无血清培养基配成药物浓度５×１０ｍｏｌ／Ｌ储备液，使ＤＭＳＯ终浓度＜０．１％（Ｖ／Ｖ），贮存液置于－２０℃冰箱中避光保存。用５％葡萄糖溶液将阿霉素配成１０ｍｇ／ｍｌ的稀释液，置于－４℃冰箱中保存，使用前用１０％小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基稀释成所需药物浓度。
１．２．２ＭＴＴ法将对数生长期的细胞以２×１０个／ｍＬ浓度接种于９６孔培养板中，每孔体积２００μｇ／Ｌ。培养箱中培养２４ｈ后，吸尽每孔培养液，实验组Ⅰ分别加入不同浓度的阿霉素，实验组Ⅱ在加入不同浓度的阿霉素后联合使用姜黄素。阿霉素终浓度分别为０．０５，０．１，０．２５，１．５，５ｕｇ／ｍｌ，姜黄素终浓度为２５ｕｍｏｌ／ｌ。对照组Ⅰ为不加细胞仅含培养液的空白对照，对照组Ⅱ为仅加细胞的阴性对照，培养４８ｈ后，每孔加入２０μｌ的ＭＴＴ液（浓度为５ｍｇ／ｍｌ），继续培养４ｈ后终止培养，吸弃上清液后，每孔加１５０μｌ的ＤＭＳＯ，振荡器上振荡１０ｍｉｎ使结晶物充分溶解。在酶标仪４９０ｎｍ处的检测光吸收值（Ａ），空白孔较零。以上各浓度组设３个复孔，取平均值，细胞存活率（ＩＣ）＝实验组平均Ａ值／阴性对照组平均Ａ值。
１．２．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法将处于对数生长期的ＳＧＣ７９０１细胞调整细胞终浓度为１×１０个／ｍＬ后，接种于２５ｃｍ２培养瓶，分为２组：阿霉素组（０．２５ｕｇ／ｍｌ）、阿霉素及姜黄素组（０．２５ｕｇ／ｍｌ、２５ｕｍｏｌ／ｌ）培养４８ｈ后，收集２组细胞，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ｐＡＫＴ、Ａｋｔ和Ｐ－ｇｐ的表达量。
１．２．４凋亡的检测将对数生长期的ＳＧＣ７９０１细胞调整细胞浓度为１×１０个／ｍＬ后，接种在６孔板中，分组方法：一组加入阿霉素，使其终浓度为血浆峰值浓度２．５ｇ／ｍＬ；另外一组加入０．２５ｇ／ｍＬ阿霉素和２．０ｍｏｌ／ｍＬ姜黄素，培养箱中培养４８ｈ。收集各组细胞，预冷７５％乙醇固定，然后吹打成单细胞悬液，４℃放置３０ｍｉｎ后，在离心机上采用１０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ；加磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）离心，去除固定液，加入２００ＬＩＲＮａｓｅＡ（１ｍｇ／ｍＬ）３７℃水浴箱中孵育３０ｍｉｎ，然后每孔加入５００ｕｌＰＩ（１０ｇ／ｍＬ）染色液，充分混匀，４℃条件下避光３０ｍｉｎ，上机检测，记录激发波４８８ｎｍ处红色荧光。用亚Ｇ１期法分析凋亡细胞，测定细胞的凋亡率，以ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ软件分析检测结果。公式计算细胞凋亡率：细胞凋亡率＝凋亡细胞数／总细胞数×１００％。
１．３统计学方法采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行统计学处理，计量数据以（ｘ±ｓ）表示，采用独立样本ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结果２．１姜黄素合用阿霉素对细胞生长的影响作用处理４８ｈ，阿霉素的浓度在０．０５～５ｕｇ／ｍｌ时，加入姜黄素２５ｕｍｏｌ／ｌ，耐药细胞生存率下降明显（Ｐ＜０．０１），尤以阿霉素０．２５ｕｇ／ｍｌ和姜黄素２５ｕｍｏｌ／ｌ作用时耐药细胞生存率下降最明显，见图１。
３讨论前期大量研究显示磷脂酰肌醇－３－激酶／丝苏氨酸蛋白激酶信号转导通路，通过诱导肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、促进肿瘤血管的形成及拮抗放化疗等作用在肿瘤的演变过程中起着重要的作用，ｐ－Ａｋｔ在多种肿瘤组织中表达明显升高，靶向作用于Ａｋｔ的药物对于肿瘤的治疗具有重要意义，本研究阐明了姜黄素逆转胃癌ＭＤＲ可能的分子作用机制，为寻找安全、高效、低毒、天然的肿瘤靶向治疗药物提供重要实验依据，将为开拓姜黄素抗肿瘤治疗的新领域提供了新的思路，临床应用前景广阔。
［基金项目］湖南省科技厅科研项目（项目编号：２０１３ＳＫ３２７８）参考文献［１］ＺａｈｅｄｉＰ，ＤｅＳｏｕｚａＲ，ＨｕｙｎｈＬ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＭｏｌＰｈａｒｍ，２０１１，８（１）：２６０－２６９．［２］Ａｄａｍｕｓｇ，ＣｈｏｉＤ，ＲａｇｈｕｎａｔｈＡ，ｅｔａｌ．ＳｉｇｎｉｃａｎｃｅｏｆＡｎｔｉ－ｒｅｔｉｎａｌＡｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎＣａｎｃｅｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄＲｅｔｉｎｏｐａｔｈｙｗｉｔｈＧｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｉｃａｌＣａｎｃｅｒｓ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＥｘｐｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２０１３，４（６）：３０７．