本文主要研究内容
作者于婉琪（2019）在《CRISPR/Cas9敲除技术在重组动物疱疹病毒构建中的初步应用》一文中研究指出：CRISPR系统是原核生物的一种获得性免疫系统,近年来随着CRISPR/Cas9研究的不断发展,其基因编辑功能逐渐被应用于各个生物学领域。利用CRISPR/Cas9系统对靶标序列的识别,辅助病毒基因的敲除和重组,可提高新毒株的获得效率。疱疹病毒的基因组为线性双链DNA分子,其中伪狂犬病病毒（PRV）和牛疱疹病毒（BHV）的基因组皆能通过sgRNA引导,而被CRISPR/Cas9系统所编辑,可作为其他病毒基因敲除和重组的模式参考。本研究通过构建含敲除目的基因左右同源臂的重组质粒,当目的基因被Cas9蛋白切开后,利用同源重组原理将目的基因替换为eGFP荧光标记蛋白,从而达到基因敲除的目的,并将纯化得到重组的疱疹病毒进行生物学特性分析,建立了高效构建疱疹病毒重组毒株的技术平台。本论文的主要研究结果如下:1.构建PRV TK-/eGFP+毒株利用聚合酶链式反应（PCR）从PRV Bartha-K61株基因组DNA中扩增含TK启动子的TK基因同源臂左臂和TK基因同源臂右臂,与eGFP基因序列一起,顺序克隆至克隆载体pUC19中,构建重组载体pUC19-TKLR-eGFP;同时,设计针对TK基因的sgRNA,构建pX335-sgRNA-TK载体,测序验证后,与PRV Bartha-K61株基因组DNA共同转染BHK-21细胞。出现重组病毒的绿色荧光病变后,利用蚀斑纯化技术,获得PRV Bartha-K61 TK-/eGFP+重组毒株。通过TCID50检测病毒滴度,绘制重组毒株的生长曲线,证明其生长特性无差异性改变。通过小鼠攻毒实验,对比小鼠体重变化和死亡情况,发现TK基因敲除后,病毒致病性降低。2.构建BHV-1 gIgE-/eGFP+毒株利用聚合酶链式反应（PCR）从BHV-1 Bartha株基因组DNA中扩增gI和gE两个基因的左右同源臂,将CMV启动子的eGFP基因表达盒插入同源臂中,之后利用同源重组酶将线性化的pUC19载体与之连接成环,构建重组载体pUC19-gIgELR-eGFP;设计针对gI和gE基因的sgRNA,构建plenti-sgRNA-gIgE载体。将以上质粒转染293T细胞,同时接种BHV-1 Bartha Nu/67病毒,利用293T细胞作为媒介,使BHV株发生基因重组,之后将293T细胞转接MDBK细胞,使重组毒增殖并保持感染性。待出现绿色荧光的病变后,蚀斑纯化得到BHV gIgE-/eGFP+重组毒株。测定重组毒株的生长曲线,证明其生长特性无差异性改变。将重组毒接种小鼠后,用阻断ELISA测定小鼠血清抗体水平,gB抗体呈阳性表明重组毒株保持免疫原性,gE抗体呈阴性表明gE基因被敲除。
Abstract
CRISPRji tong shi yuan he sheng wu de yi chong huo de xing mian yi ji tong ,jin nian lai sui zhao CRISPR/Cas9yan jiu de bu duan fa zhan ,ji ji yin bian ji gong neng zhu jian bei ying yong yu ge ge sheng wu xue ling yu 。li yong CRISPR/Cas9ji tong dui ba biao xu lie de shi bie ,fu zhu bing du ji yin de qiao chu he chong zu ,ke di gao xin du zhu de huo de xiao lv 。pao zhen bing du de ji yin zu wei xian xing shuang lian DNAfen zi ,ji zhong wei kuang quan bing bing du （PRV）he niu pao zhen bing du （BHV）de ji yin zu jie neng tong guo sgRNAyin dao ,er bei CRISPR/Cas9ji tong suo bian ji ,ke zuo wei ji ta bing du ji yin qiao chu he chong zu de mo shi can kao 。ben yan jiu tong guo gou jian han qiao chu mu de ji yin zuo you tong yuan bei de chong zu zhi li ,dang mu de ji yin bei Cas9dan bai qie kai hou ,li yong tong yuan chong zu yuan li jiang mu de ji yin ti huan wei eGFPying guang biao ji dan bai ,cong er da dao ji yin qiao chu de mu de ,bing jiang chun hua de dao chong zu de pao zhen bing du jin hang sheng wu xue te xing fen xi ,jian li le gao xiao gou jian pao zhen bing du chong zu du zhu de ji shu ping tai 。ben lun wen de zhu yao yan jiu jie guo ru xia :1.gou jian PRV TK-/eGFP+du zhu li yong ju ge mei lian shi fan ying （PCR）cong PRV Bartha-K61zhu ji yin zu DNAzhong kuo zeng han TKqi dong zi de TKji yin tong yuan bei zuo bei he TKji yin tong yuan bei you bei ,yu eGFPji yin xu lie yi qi ,shun xu ke long zhi ke long zai ti pUC19zhong ,gou jian chong zu zai ti pUC19-TKLR-eGFP;tong shi ,she ji zhen dui TKji yin de sgRNA,gou jian pX335-sgRNA-TKzai ti ,ce xu yan zheng hou ,yu PRV Bartha-K61zhu ji yin zu DNAgong tong zhuai ran BHK-21xi bao 。chu xian chong zu bing du de lu se ying guang bing bian hou ,li yong shi ban chun hua ji shu ,huo de PRV Bartha-K61 TK-/eGFP+chong zu du zhu 。tong guo TCID50jian ce bing du di du ,hui zhi chong zu du zhu de sheng chang qu xian ,zheng ming ji sheng chang te xing mo cha yi xing gai bian 。tong guo xiao shu gong du shi yan ,dui bi xiao shu ti chong bian hua he si wang qing kuang ,fa xian TKji yin qiao chu hou ,bing du zhi bing xing jiang di 。2.gou jian BHV-1 gIgE-/eGFP+du zhu li yong ju ge mei lian shi fan ying （PCR）cong BHV-1 Barthazhu ji yin zu DNAzhong kuo zeng gIhe gEliang ge ji yin de zuo you tong yuan bei ,jiang CMVqi dong zi de eGFPji yin biao da he cha ru tong yuan bei zhong ,zhi hou li yong tong yuan chong zu mei jiang xian xing hua de pUC19zai ti yu zhi lian jie cheng huan ,gou jian chong zu zai ti pUC19-gIgELR-eGFP;she ji zhen dui gIhe gEji yin de sgRNA,gou jian plenti-sgRNA-gIgEzai ti 。jiang yi shang zhi li zhuai ran 293Txi bao ,tong shi jie chong BHV-1 Bartha Nu/67bing du ,li yong 293Txi bao zuo wei mei jie ,shi BHVzhu fa sheng ji yin chong zu ,zhi hou jiang 293Txi bao zhuai jie MDBKxi bao ,shi chong zu du zeng shi bing bao chi gan ran xing 。dai chu xian lu se ying guang de bing bian hou ,shi ban chun hua de dao BHV gIgE-/eGFP+chong zu du zhu 。ce ding chong zu du zhu de sheng chang qu xian ,zheng ming ji sheng chang te xing mo cha yi xing gai bian 。jiang chong zu du jie chong xiao shu hou ,yong zu duan ELISAce ding xiao shu xie qing kang ti shui ping ,gBkang ti cheng yang xing biao ming chong zu du zhu bao chi mian yi yuan xing ,gEkang ti cheng yin xing biao ming gEji yin bei qiao chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西北农林科技大学的于婉琪，发表于刊物西北农林科技大学2019-07-11论文，是一篇关于动物疱疹病毒论文,伪狂犬病病毒论文,牛疱疹病毒论文,基因敲除论文,西北农林科技大学2019-07-11论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西北农林科技大学2019-07-11论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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