（1徐州医科大学附属徐州临床学院泌尿外科江苏徐州221009）
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（3徐州医科大学附属徐州临床学院中心实验室江苏徐州221009）
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【摘要】目的：研究放射性碘标记前列腺癌特异性溶瘤重组腺病毒对前列腺癌细胞增殖抑制作用可能的机制。方法：放射性碘标记前列腺癌特异性溶瘤重组腺病毒作用于前列腺癌细胞后，MTT法检测前列腺癌细胞增殖抑制率变化，流式细胞术检测前列腺癌细胞凋亡情况。结果：放射性碘标记前列腺癌特异性溶瘤重组腺病毒能够明显抑制前列腺癌细胞的生长;放射性碘标记前列腺癌特异性溶瘤重组腺病毒给药后，可以导致前列腺癌细胞的凋亡。结论：放射性碘标记前列腺癌特异性溶瘤重组腺病毒能明显抑制前列腺癌细胞生长，并促前列腺癌细胞凋亡。
【关键词】溶瘤腺病毒;前列腺癌;125碘
【中图分类号】R737.25【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）08-0174-02
虽然亚洲地区为前列腺癌发病的低危人群，但随着我国社会老龄化和饮食结构的不断改变，前列腺癌近年来其发病率呈逐年上升趋势，因此，对其诊治也成了现代医学的一项重要研究内容[1-2]。我们在前期实验中构建了放射性碘标记前列腺癌特异性溶瘤重组腺病毒。在本次实验中，我们125I-RSOAds-hTERT-PSA抑制前列腺癌细胞生长的机制作进一步探讨。
1.材料及方法
1.1试剂
人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3，小鼠雄激素非依赖性前列腺腺癌细胞株RM-1购于上海中国科学院细胞库。MTT试剂盒购自Sigma公司，AnnexinV-FITC流式凋亡试剂盒购自BD公司，细胞培养用DMEM培养基含10%胎牛血清和1%的青、链霉素，购自杭州四季青生物工程材料有限公司，无噬菌体，低内毒素，培养条件为5%的CO2及37℃。
1.2实验分组
本实验共分为4组，生理盐水空白对照组，单纯核素125I组，未核素标记RSOAds-hTERT-PSA组及病毒-核素复合物组（125I-RSOAds-hTERT-PSA）。
1.3MTT检测细胞增殖
分别取经对数生长期的RM-1和PC3细胞，计数调整细胞浓度至1×105/ml。分别接种于96孔板中，每孔200μL，每组细胞设3个复孔。将96孔板移入培养箱中培养，培养细胞到适当时间。本实验共2种细胞，每种细胞4个分组，共设置8个组，根据实验要求适时分别加入各实验组以下2种类型的体外培养的前列腺癌细胞。向每孔加入20μL5mg/mlMTT溶液。将培养板在培养箱内孵育4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ulDMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，计算抑制率。相对抑制率＝（1－转染组/对照组）×100﹪。
1.5细胞凋亡实验
用6孔板培养细胞每组3个重复，待细胞生长达到60%～70%，吸出旧培养基，根据实验分组rcdtB处理后，继续培养。根据实验处理时间，把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。加入上步骤中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意：加入步骤c中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的AnnexinV-FITC导致染色失败。取5～10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μlAnnexinV-FITC，轻轻混匀。
1.6统计学分析
采用SPSS12.0软件包处理数据，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义，实验数据均重复测定3次以上。
2.实验结果
2.1MTT结果显示单纯核素125I组，未核素标记RSOAds-hTERT-PSA组及病毒-核素复合物组（125I-RSOAds-hTERT-PSA）均可抑制人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3，小鼠雄激素非依赖性前列腺腺癌细胞株RM-1的增殖，其中以病毒-核素复合物组的抑制作用最强，并且这种抑制作用呈时间依赖性增强。
2.2流式细胞检测显示，单纯核素125I组，未核素标记RSOAds-hTERT-PSA组及病毒-核素复合物组（125I-RSOAds-hTERT-PSA）均可促进人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3，小鼠雄激素非依赖性前列腺腺癌细胞株RM-1的凋亡，其中以病毒-核素复合物组的促凋亡作用最强，并且这种抑制作用呈时间依赖性增强。
3.讨论
碘-125（125I）粒子是一种人工合成放射性核素，植入体内后可以持续发出低能量的γ射线，放射距离短，仅为1.7mm，低剂量照射可以抑制肿瘤的有丝分裂，当肿瘤细胞分裂时，由于DNA完整性受损，无法进行细胞分裂而死亡。由于近距离放射治疗使肿瘤局部达到高剂量照射，对周围正常组织影响较小，可明显提高临床效果，降低并发症发生率，因此，125I已成为国外治疗前列腺癌的重要手段之一。
因此，我们推断，溶瘤腺病毒和放射性核素结合起来应用，除了彼此直接对肿瘤细胞的杀伤作用外，可能会对肿瘤微环境产生靶向治疗作用，相互弥补单独治疗时的不足之处：溶瘤腺病毒靶向感染肿瘤细胞后，能够增加肿瘤组织对放射治疗的敏感性；而辐射同样可以增加溶瘤腺病毒的溶瘤作用能力，两者具有协同作用，使得对放射治疗产生抵挡作用和通常溶瘤腺病毒难以杀伤的肿瘤干细胞得到有效抑制，达到完全治疗肿瘤的目的。本实验结果显示，核素125I标记hTERT/PSA双调控增殖型溶瘤腺病毒可以抑制前列腺癌细胞增殖并促进前列腺癌细胞凋亡作用。我们将在后期实验中建立小鼠前列腺癌模型，研究核素125I标记hTERT/PSA双调控增殖型溶瘤腺病毒在体内对前列腺癌细胞增殖抑制作用及促肿瘤细胞凋亡作用的机制。
【参考文献】
[1]陈智飞,李一权,胡宁宁,等.携Apoptin和PEG3启动子双特异性溶瘤腺病毒对结直肠癌的抑制作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2015,22（1）:16-21.
[2]付成伟,王洛夫,江军,等.rPB-DR(6)调控的溶瘤腺病毒对前列腺癌细胞的杀伤作用[J].第三军医大学学报,2013,35（24:）2659-2664.
基金项目：江苏省重点研发计划（BE2015623）、国家自然科学基金（81272557）、江苏省自然科学基金（BK2012647）、江苏六大人才高峰项目（WSW-185）、江苏省“科教兴卫”工程医学重点人才科研项目（RC2011046）、徐州市医学领军人才基金（2010001）