导读:本文包含了纤维蛋白酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:葡萄糖酸亚铁,固体脂质纳米粒,海藻酸钠,盐酸氨基葡萄糖
纤维蛋白酶论文文献综述
王琳琳[1]（2016）在《葡萄糖酸亚铁固体脂质纳米粒的制备及肌原纤维蛋白酶解多肽对其性质的影响》一文中研究指出铁元素参与生命体物质和能量代谢,是人体需要的必需微量元素之一。膳食中的铁元素绝大多数以非血红素铁的形式存在,但由于食物组分中的植酸、草酸和多酚等抑制剂的存在,非血红素铁的生物利用率低,往往不能满足人体日常所需。因此,制备铁的膳食补充剂,防止铁与其抑制剂的络合是提高铁元素的生物吸收率,改善缺铁现状的重要手段。本文选用葡萄糖酸亚铁作为芯材,探讨了采用固体脂质纳米粒技术对葡萄糖酸亚铁进行包埋,以包埋率为指标,确定了制备过程中的关键因素条件,并考察了叁种多糖或多糖对葡萄糖酸亚铁固体脂质纳米粒包埋率、理化性质和释放率的影响。本课题还提取了猪肉中的肌原纤维蛋白,分析了经不同酶解过程处理得到的酶解产物在分子量分布以及氨基酸组成的差异,旨在探索肌原纤维蛋白提高铁在人体吸收的内在原因,并研究了多肽对葡萄糖酸亚铁制备的影响,以期获得更高生物利用率的铁补充剂。具体研究内容和结果如下:(1)研究了采用多重乳状液的方法制备葡萄糖酸亚铁固体脂质纳米粒(SLN)的工艺,以包埋率为指标,优化了关键制备参数,结果显示,当内相中水相与油相的体积比为0.2,外水相与内相乳状液的体积比为5:1,大豆卵磷脂浓度为5%时,SLN的包埋率取得最大,为52.48%,并分析了大豆卵磷脂对颗粒形态的影响。(2)考察了叁种多糖或单糖,即海藻酸钠(SA)、盐酸氨基葡萄糖(GH)和硫酸葡聚糖(DS)溶液对葡萄糖酸亚铁油水分配系数的影响,发现多糖/单糖的加入提高了葡萄糖酸亚铁的油溶性,并将其和葡萄糖酸亚铁的混合溶液作为内相,考察了叁类物质对固体脂质纳米粒包埋率的影响,结果发现,海藻酸钠、硫酸葡聚糖和盐酸氨基葡萄糖的添加量的不同会导致包埋率的变化,且均在与葡萄糖酸亚铁质量比为1:2时,有最大包埋率,分别为59.03%,54.06%和61.30%,对粒子的平均粒径和多分散系数无太大影响,颗粒zeta电位绝对值增大。差示扫描量热曲线显示,与硬脂酸相比,SLN的熔化焓和峰值温度发生改变,反映了脂质在SLN中的结晶度降低。体外模拟释放实验反映了固体脂质纳米粒在模拟胃液环境下能保持良好稳定性,并在模拟肠液中显示出突释的特点,说明固体脂质纳米粒对葡萄糖酸亚铁有较好的保护及释放效果。(3)提取猪肉中的肌原纤维蛋白,通过SDS-PAGE分析比较不同酶对肌原纤维蛋白的酶解效果,筛选与胃蛋白酶酶解程度相似的酶解途径,比较各酶解产物的多肽得率和水解度,综合选取Protin SD-AY(SD)先酶解4 h,后用细菌蛋白酶Protease P(PP)酶解12 h的两步酶解过程,比较该酶解产物与胃蛋白酶酶解产物的相对分子质量分布和氨基酸组成以及铁络合率,结果发现与两步酶解产物相比,具有更高天冬氨酸和谷氨酸含量的胃蛋白酶酶解产物的铁络合率更高为13.53%。尝试将多肽引入固体脂质纳米粒中,发现亚铁包埋率有下降趋势,粒径显着增大,zeta电位绝对值显着增加,但并未改变固体脂质纳米粒的释放特性,在模拟胃液肠液中的释放率更高。贮藏实验表明,4℃贮藏温度下的药物保留率高于25℃,贮藏期间的平均粒径除多肽和对照组SLN外没有发生明显改变。(本文来源于《江南大学》期刊2016-06-01）
孙志斌[2]（2016）在《产纤维蛋白酶和淀粉酶抑制剂放线菌Streptomyces sp.CC5的筛选及其产物的特性研究》一文中研究指出放线菌是一类具有菌丝、主要以孢子繁殖的革兰氏阳性原核生物,其形态分化是原核生物中最为复杂的一类,具有球状、杆状、分支状等多种形态。放线菌广泛分布于不同的自然环境之中,可产生多种天然活性物质,是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物资源。放线菌产生的活性产物包括抗菌物质、酶、酶抑制剂、抗氧化剂等,广泛应用于医药、农业和工业等领域。本论文经过对不同生境土壤样品中的放线菌进行分离筛选,并通过菌落形态观察、16SrRNA基因酶切分型去重复、16SrRNA基因测序的方法对所分离到的放线菌进行菌属归类,同时从淀粉酶抑制剂和纤维蛋白酶两个主要角度寻找其发酵上清液中具有生物活性的代谢产物。最终从来源于全国40个土样中一共分离出10个属,406株放线菌,包括:链霉菌属(Streptomyces),野野村菌属(Nonomuraea),小单孢菌属(Micromonospora),小双孢菌属 (Microbispora),诺卡氏菌属(Nocardia),假诺卡氏菌属(Pseudonocardia ),马杜拉菌属(Actinomadura),动单孢菌属(Planomonospora),分支杆菌属(Mycobacterium) 和小链孢菌属(Caaellatospora)。通过碘和淀粉显色法、α-gal-G2-CNP法以及纤维蛋白平板法分别从中筛选出18株放线菌发酵液具有纤维蛋白水解活性和10株放线菌发酵液具有淀粉酶抑制活性。其中Streptomyces sp. CC5可以同时产生高活性的纤维蛋白酶和α-淀粉酶抑制剂,并产生纤溶酶原激活剂和抗菌物质等天然活性产物。纤维蛋白酶可以直接快速溶解血栓,用于心血管疾病的治疗,其中对急性心肌梗塞、肺栓塞等急性血栓效果更加明显。通过大孔树脂吸附、凝胶离子交换树脂脱色素、硫酸铵分级沉淀和Superdex 200凝胶层析等方法从CC5菌株发酵液中分离纯化到一种对纤维蛋白具有较强水解活性的碱性丝氦酸蛋白酶AfeE,其分子量为29984 Da。通过肽指纹图谱分析和基因克隆技术获得全长为1305 bp的基因(afeE)。结合高分辨率质谱和信号肽分析,发现AfeE可能存在翻译后加工的现象。afeE共编码434个氨基酸,前36个氨基酸为信号肽,在尾部320G-321T位之间被未知蛋白酶特异切割,成熟肽AfeE由中间的284个氨基酸组成,与源于 S. griseus的氨肽酶(SGAP)有80%的相似性,但部分生化性质与SGAP存在明显不同。AfeE的最适反应条件范围为40℃, pH 7.0-12.0,表明AfeE为碱性蛋白酶。苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、N-甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲基酮(TLCK)和甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)对AfeE均有很强的抑制效果,说明AfeE为丝氨酸蛋白酶;此外,AfeE可以使蛋白酶抑制剂亮肽素失活,说明AfeE可能属于亮肽素失活蛋白酶。Cu2+, Co2+和Zn2+可以部分抑制酶活。AfeE具有一定的底物水解特异性,对纤维蛋白的水解速率明显快于对纤维蛋白原、牛血清蛋白、血红蛋白和卵清蛋白的水解速率,对纤维蛋白原的水解方式为Aα链>Bβ链>γ链。AfeE在含有纤溶酶原的纤维蛋白平板上呈现的水解活性大于在纤溶酶原失活的纤维蛋白平板上的活力,说明AfeE可能还存在纤溶酶原激活活性。利用动物实验对AfeE抗血栓性能进行评估。通过角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓模型溶栓实验结果表明:剂量为0.5 mg/kg AfeE的溶栓效果强于剂量为20 mg/kg尿激酶的溶栓效果,说明AfeE具有很强的溶栓活力。在抗凝实验中,AfeE对大鼠血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)均有明显的时间延长,8μgAfeE可使PT凝血时间超出计时范围(>180s),4μgAfeE可使APTT凝血时间超出计时范围,TT只需2 μgAfeE即可超出凝血时间计时范围,表明AfeE具有很强的抗凝血能力。小鼠出血时间实验表明,注射剂量为1 mg/kg的AfeE对小鼠断尾出血时间没有明显影响,而阳性对照尿激酶组(20 mg/kg)出血时间显着延长,有40%的小鼠出血时间超出1800 s。这一结果表明相比尿激酶,AfeE可能存在较低的出血风险。细胞毒性实验表明,320μg/孔AfeE (大约相当于单只小鼠溶栓剂量的32倍)对所培养的人脐带静脉内皮细胞没有剧烈毒性。一系列初步的抗血栓评估实验表明AfeE具有较强的溶栓活性,对出血时间和细胞活性无明显影响,具有成为一种新型溶栓药物的潜能。α-淀粉酶抑制剂可以特异抑制α-淀粉酶的活力,可作为生物杀虫剂控制以谷物等淀粉类作物为食的害虫;在医药上可以用于减缓餐后肠道对淀粉的消化,从而减慢机体对糖分吸收,降低血糖,普遍用于II型糖尿病和肥胖的预防与治疗。通过大孔吸附树脂、离子交换、硫酸铵分级沉淀和Superdex 75凝胶层析等一系列分离纯化手段从CC5菌株中分离到一种蛋白源α-淀粉酶抑制剂AAI-CC5。MALDI-TOF分析显示AAI-CC5分子量为8212Da; N端前15个氨基酸序列为DTGSPAPECVEYFQS,和已报道的蛋白源淀粉酶抑制剂序列不同。AAI-CC5可以特异抑制哺乳动物来源的α-淀粉酶活力,未检测到对链霉菌、解淀粉芽孢杆菌、粘细菌和大蜡螟源淀粉酶的抑制活性。AAI-CC5对热及酸碱环境稳定,在pH 2.0-10.0处理24 h或80℃处理1 h均未检测到明显抑制活力丧失;在沸水浴20分钟内依然可以保持一半的抑制活性。根据N端序列分析和数据库相关蛋白序列比对分析,利用染色体步移技术克隆到AAI-CC5的编码基因aaiE,aaiE共编码110氨基酸,前34个为信号肽,后76个为成熟肽AAI-CC5,与来源于S.parvulus的Parvulustat有82%的相似性,属于WRY修饰的蛋白类淀粉酶抑制剂,这一类淀粉酶抑制剂的抑制活力是已报道的淀粉酶抑制剂中抑制活性最强的类群之一。AAI-CC5对猪胰腺淀粉酶的半抑制浓度IC50和抑制常数Ki分别为6.43×10-11和4.45×10-11。AAI-CC5成功在大肠杆菌中异源表达,重组淀粉酶抑制剂rAAI-CC5分子量为9404 Da,其抑制活性和稳定性与野生菌中分离获得的基本一致。(本文来源于《南京农业大学》期刊2016-03-01）
王浩[3]（2016）在《高压电烧伤大鼠血清脂联素、纤维蛋白酶变化及乌司他丁干预作用》一文中研究指出目的：高压电烧伤不仅对机体造成热力损伤,电流经过身体,电场作用对机体血管、神经各组织均造成不同程度的损伤。目前,国内外专家学者对高压电烧伤后毛细血管血流动力学改变的研究已经广泛的开展。研究表明,电烧伤后血管内皮损伤,局部及全身的炎症反应造成血流动力学异常改变,以及血栓形成造成微循环出现障碍。电烧伤后导致全身炎症反应及血流动力学改变的因素有很多,其中血浆中的脂联素(Adiponectin,ADP)、纤维蛋白酶(Brinase)在调节炎症反应及血流动力学方面有着重要的作用。脂联素是脂肪细胞分泌的一种具有多种生物学效应的蛋白类物质,它以内分泌方式循环于血液中,在机体内参与多种生命活动的调节。纤维蛋白酶以往是从米曲霉中提取的蛋白酶,能够分解血凝块的纤维蛋白和降低血浆中纤溶酶抑制物的浓度。电烧伤后对于大鼠血清纤维蛋白酶的定性及定量变化,并无相关性的研究。通过此次试验检测高压电烧伤后大鼠血清ADP、Brinase的变化,并通过乌司他丁(Ulinastatin UTI)干预,旨在进一步探索高压电后血清ADP、Brinase变化及其介导的炎症反应及对凝血机制的影响和干预办法。方法：1实验动物分组:本实验采用健康的成年SD大鼠做为实验研究对象,大鼠由河北医科大学动物实验中心提供(合格证编号1411023),共计180只,按随机区组设计法将其分为叁组,这样每组分别有60只大鼠,即假高压电烧伤组(对照组)(60只)、高压电烧伤组(电伤组)(60只)、高压电烧伤乌司他丁(UTI)治疗组(治疗组)(60只)。每一组又按观察时间的长短不同分成6个时相组,即电伤前15min、电伤后5min、电伤后1h、2h、4h、8h六个时相组,每一时相组包含10只大鼠。2实验前准备：①大鼠称重并将其编号②按药品说明配置实验药品使其达到实验所需浓度③准备采血管、采血针,记录实验数据。3高压电烧伤模型制作：将实验变压器和调压器电线连接,使其成为一个闭合回路。10%的水合氯醛(0.3ml/100g)溶液腹腔注射以麻醉实验大鼠,麻醉成功后,将大鼠四肢固定,仰卧位于专用的电击实验台上,大鼠的左上肢(电流人口)脱毛区、右下肢(电流出口)脱毛区分别连接两个1cm×1cm电极片。确保所有实验人员远离电击可波及的区域,这时再接通电源,调节调压器旋钮,使升压器的输出电压达到2千伏,打开电源开关,使高压电流通过大鼠身体,达到电击的效果,电击时间为3s,释放闭合线路内残留的电流,将大鼠分笼放好,待采血。空白对照组(假电组)则不给于接通高压电流,其余步骤与电伤组及治疗组的处理相同。电伤组电后5min内于大鼠腹腔内注射生理盐水5ml/kg,乌司他丁治疗组电后5min内于大鼠腹腔内注射1%UTI(5ml/kg)。每组样品按时相进行采血、分离血清。4标本采集与保存：将高压电烧伤后的大鼠再次麻醉,后开胸充分暴露心脏,于心脏内直接抽血,血量约6mL,将抽出的血液注入促凝管中,静置30min,待血清析出后,离心机3000转/分钟,离心10分钟,取上清液置于Eppendorf管中于-70℃条件下保存。5指标检测：采用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)双抗体夹心法,分别检测、计算每组大鼠的六个时相组血清ADP、Brinase含量。6实验数据处理：采用SPSS 13.0统计软件,行两因素析因设计的方差分析。以P<0.05为显着性检验水准。结果：1大鼠血清ADP含量变化高压电烧伤组大鼠血清ADP含量与空白对照组有显着差异,总体低于空白对照组(主效应F=17.336,P<0.05);高压电伤组血清ADP含量各时相变化有显着差异(主效应F=20.094,P<0.05),伤后5min-4h各时相均低于本组伤前值(P<0.005),且呈逐渐降低那趋势,在4h时相时达到最低,并在4-8h血清ADP水平开始升高,但电伤组ADP水平仍低于空白对照组相应时相时ADP的水平。治疗组血清ADP含量与电伤组有显着差异,总体高于电伤组(主效应F=5.419,P<0.05);治疗组ADP含量各时相变化有显着差异(主效应F=20.708,P<0.05),治疗组伤后5min-8h各时相均低于本组伤前值(P<0.05)。2大鼠血清Brinase含量变化高压电伤组血清Brinase含量与空白对照组有显着差异,总体高于对照组(主效应F=60.241,P<0.05);电伤组Brinase含量各时相变化有显着差异(主效应F=59.298,P<0.05),伤后5min～8h各时相均高于本组伤前值(P<0.05),且呈逐渐增高趋势。治疗组血清Brinase含量与电伤组有显着差异,总体低于电伤组(主效应F=34.613,P<0.05);治疗组Brinase含各时相变化有显着差异(主效应F=81.736,P<0.05),治疗组伤后5min～8h各时相均高于本组伤前值(P<0.05)。结论：高压电烧伤可影响机体ADP、Brinase的表达,从而诱导过度的炎症反应,同时使机体处于高凝状态。高压电烧伤后,早期UTI治疗可以促使Brinase的表达降低,ADP表达增加,说明UTI可以抑制过度的炎症反应,调节凝血平衡,改善微循环血流状态,利于创面的修复。(本文来源于《河北医科大学》期刊2016-03-01）
白腾辉,马亚萍,康壮丽,潘润淑,马汉军[4]（2016）在《响应面法优化鸡胸肉肌原纤维蛋白酶法水解工艺条件》一文中研究指出以鸡胸肉为原料,提取肌原纤维蛋白,测定其蛋白质浓度及氨基酸组成;以水解度为测定指标,利用响应面法优化该肌原纤维蛋白酶解工艺条件,并考察其产物肽分子量分布。结果表明:提取的肌原纤维蛋白浓度为59.27%;该蛋白氨基酸种类齐全,组成比例均衡,必需氨基酸含量高达40.90%;碱性蛋白酶是肌原纤维蛋白酶解的最佳用酶;在单因素实验基础上,经Box-Behnken实验优化得到碱性蛋白酶水解肌原纤维蛋白最佳工艺条件为:加酶量3500 U/g、p H7.8、温度44℃,此条件下经6 h酶解,水解度达33.17%;肽分子量分布分析知,最佳水解条件下酶解液中<1000 u的小肽含量高达61.5%,说明碱性蛋白酶能较高程度的水解肌原纤维蛋白。(本文来源于《食品工业科技》期刊2016年01期）
刘红彦,张坤生,任云霞[5]（2011）在《鲤鱼肌原纤维蛋白酶解及产物抗氧化性的研究》一文中研究指出从鲤鱼肌肉中提取肌原纤维蛋白,以水解度(DH)和邻苯叁酚自由基(DPPH)清除率为指标,探讨了木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶水解鲤鱼肌原纤维蛋白的酶解效果。研究表明,木瓜蛋白酶是制备鲤鱼肌原纤维蛋白酶解物的优选蛋白酶,通过单因素及正交试验获得了最佳酶解条件:温度55℃、pH7、酶用量1 000 U/g、底物浓度4%、酶解时间2 h;在此优化条件下鲤鱼肌原纤维蛋白酶解物对DPPH清除率为82.73%,表现出较强的抗氧化活性水平。(本文来源于《食品研究与开发》期刊2011年08期）
刘娜,张坤生,任云霞[6]（2011）在《鸡肉肌原纤维蛋白酶解产物的抗氧化活性研究》一文中研究指出以鸡肉肌原纤维蛋白为原料,在pH为7的条件下用木瓜蛋白酶对其进行水解,在单因素的基础上,运用正交试验对水解条件进行优化,以期获得具有较好抗氧化活性的酶解产物。由实验得出,最优化的水解条件是:加酶量为0.6%,固液比为1∶5(g/mL),反应温度为50℃,反应时间为3 h。此条件获得的水解产物的DPPH自由基清除率为84.7%。通过SDS-聚丙酰胺凝胶电泳可以看出肌原纤维蛋白在水解过程中水解为具有抗氧化活性的低分子肽链。(本文来源于《食品研究与开发》期刊2011年07期）
黄敏,周程,严奉伟[7]（2008）在《鲢鱼中肌原纤维蛋白酶法水解的研究》一文中研究指出通过测定水解度及对水解液进行感官评价,研究了鲢鱼肌原纤维蛋白的酶水解条件与脱苦脱腥味条件。结果表明:胰蛋白酶单酶水解的最佳条件为:酶用量1.5%,pH8.0,温度45℃,水解时间5h;木瓜蛋白酶单酶水解的最佳条件为:酶用量1.0%,pH7.0,温度50℃,水解时间6h。双酶水解的最佳组合为先加木瓜蛋白酶水解3h,后加胰蛋白酶水解2h。在水解液中添加2.0%～2.5%活性炭,于40℃保温0.5h的脱苦脱腥效果较佳。(本文来源于《江西食品工业》期刊2008年03期）
Kuhli,C.,Jochmans,K.,Scharrer,I.,熊蕾[8]（2006）在《继发于新的G9840C错义突变的抗纤维蛋白酶缺乏相关的视网膜静脉阻塞》一文中研究指出Objective: To describe a novel missense mutation in the antithrombin gene associated with antithrombin deficiency type I in a 40-year-old man with retinal vein occlusion. Design: Investigational case report. Results: Ophthalmoscopy of the right eye showed hemicentral retinal vein occlusion. The patient's medical history was negative for glaucoma or cardiovascular risk factors. Screening for thrombophilic disorders revealed antithrombin deficiency type I. Based on a genetic analysis, a novel missense mutation of a transition of guanosine to cytosine at nucleotide position 9840 was detected, predicting the replacement of aspartic acid by histidine encoded by codon 366 (D366H) in exon 5. Conclusions: Selective screening may be helpful in identifying patients with retinal vein occlusion with thrombophilic defects. When ordering laboratory tests in patients with retinal vein occlusion, antithrombin deficiency type I should be considered in the differential diagnosis. Clinical Relevance: Our results contribute to a better understanding of the molecular bases of antithrombin deficiency, adding a novel entry for the molecular defects causing antithrombin deficiency type I. Moreover, the identification of this thrombophilic disorder in retinal vein occlusion may be relevant to the issue of the initiation and duration of oral anticoagulant therapy.(本文来源于《世界核心医学期刊文摘.眼科学分册》期刊2006年12期）
郭军,杨雨平,仁庆考日乐[9]（2003）在《枯草杆菌溶血纤维蛋白酶发酵培养基配方的确定》一文中研究指出采取有交互作用的正交试验设计了枯草杆菌HL986菌株溶血纤维蛋白酶发酵的培养基成分 ,用试管表面培养法和摇瓶培养法进行发酵 ,利用牛血纤维蛋白琼脂平皿法测溶血纤维蛋白酶的活性 ,分析确定的最佳培养基配方为 :进口酵母浸出粉OXOID2 % ,麦芽糖 0 .2 % ,NaH2 PO4·2H2 O 0 .7%。(本文来源于《内蒙古农业大学学报(自然科学版)》期刊2003年01期）
张爱霞,张佳程,生庆海[10]（2003）在《牛乳中纤维蛋白酶及其酶原活性测定方法的比较》一文中研究指出牛乳中纤维蛋白酶及其酶原活性的测定,以合成色谱底物(V7127)进行的分光光度比色法为最佳方案,因此利用该方法进行研究的也较多。SDS-PAGE、ELISA技术、TCA可溶性氮等各方法,虽然具有一定的局限性,但可作为分光光度法的辅助手段,以更好的对纤维蛋白酶进行研究。(本文来源于《中国乳业》期刊2003年02期）
纤维蛋白酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
放线菌是一类具有菌丝、主要以孢子繁殖的革兰氏阳性原核生物,其形态分化是原核生物中最为复杂的一类,具有球状、杆状、分支状等多种形态。放线菌广泛分布于不同的自然环境之中,可产生多种天然活性物质,是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物资源。放线菌产生的活性产物包括抗菌物质、酶、酶抑制剂、抗氧化剂等,广泛应用于医药、农业和工业等领域。本论文经过对不同生境土壤样品中的放线菌进行分离筛选,并通过菌落形态观察、16SrRNA基因酶切分型去重复、16SrRNA基因测序的方法对所分离到的放线菌进行菌属归类,同时从淀粉酶抑制剂和纤维蛋白酶两个主要角度寻找其发酵上清液中具有生物活性的代谢产物。最终从来源于全国40个土样中一共分离出10个属,406株放线菌,包括:链霉菌属(Streptomyces),野野村菌属(Nonomuraea),小单孢菌属(Micromonospora),小双孢菌属 (Microbispora),诺卡氏菌属(Nocardia),假诺卡氏菌属(Pseudonocardia ),马杜拉菌属(Actinomadura),动单孢菌属(Planomonospora),分支杆菌属(Mycobacterium) 和小链孢菌属(Caaellatospora)。通过碘和淀粉显色法、α-gal-G2-CNP法以及纤维蛋白平板法分别从中筛选出18株放线菌发酵液具有纤维蛋白水解活性和10株放线菌发酵液具有淀粉酶抑制活性。其中Streptomyces sp. CC5可以同时产生高活性的纤维蛋白酶和α-淀粉酶抑制剂,并产生纤溶酶原激活剂和抗菌物质等天然活性产物。纤维蛋白酶可以直接快速溶解血栓,用于心血管疾病的治疗,其中对急性心肌梗塞、肺栓塞等急性血栓效果更加明显。通过大孔树脂吸附、凝胶离子交换树脂脱色素、硫酸铵分级沉淀和Superdex 200凝胶层析等方法从CC5菌株发酵液中分离纯化到一种对纤维蛋白具有较强水解活性的碱性丝氦酸蛋白酶AfeE,其分子量为29984 Da。通过肽指纹图谱分析和基因克隆技术获得全长为1305 bp的基因(afeE)。结合高分辨率质谱和信号肽分析,发现AfeE可能存在翻译后加工的现象。afeE共编码434个氨基酸,前36个氨基酸为信号肽,在尾部320G-321T位之间被未知蛋白酶特异切割,成熟肽AfeE由中间的284个氨基酸组成,与源于 S. griseus的氨肽酶(SGAP)有80%的相似性,但部分生化性质与SGAP存在明显不同。AfeE的最适反应条件范围为40℃, pH 7.0-12.0,表明AfeE为碱性蛋白酶。苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、N-甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲基酮(TLCK)和甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)对AfeE均有很强的抑制效果,说明AfeE为丝氨酸蛋白酶;此外,AfeE可以使蛋白酶抑制剂亮肽素失活,说明AfeE可能属于亮肽素失活蛋白酶。Cu2+, Co2+和Zn2+可以部分抑制酶活。AfeE具有一定的底物水解特异性,对纤维蛋白的水解速率明显快于对纤维蛋白原、牛血清蛋白、血红蛋白和卵清蛋白的水解速率,对纤维蛋白原的水解方式为Aα链>Bβ链>γ链。AfeE在含有纤溶酶原的纤维蛋白平板上呈现的水解活性大于在纤溶酶原失活的纤维蛋白平板上的活力,说明AfeE可能还存在纤溶酶原激活活性。利用动物实验对AfeE抗血栓性能进行评估。通过角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓模型溶栓实验结果表明:剂量为0.5 mg/kg AfeE的溶栓效果强于剂量为20 mg/kg尿激酶的溶栓效果,说明AfeE具有很强的溶栓活力。在抗凝实验中,AfeE对大鼠血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)均有明显的时间延长,8μgAfeE可使PT凝血时间超出计时范围(>180s),4μgAfeE可使APTT凝血时间超出计时范围,TT只需2 μgAfeE即可超出凝血时间计时范围,表明AfeE具有很强的抗凝血能力。小鼠出血时间实验表明,注射剂量为1 mg/kg的AfeE对小鼠断尾出血时间没有明显影响,而阳性对照尿激酶组(20 mg/kg)出血时间显着延长,有40%的小鼠出血时间超出1800 s。这一结果表明相比尿激酶,AfeE可能存在较低的出血风险。细胞毒性实验表明,320μg/孔AfeE (大约相当于单只小鼠溶栓剂量的32倍)对所培养的人脐带静脉内皮细胞没有剧烈毒性。一系列初步的抗血栓评估实验表明AfeE具有较强的溶栓活性,对出血时间和细胞活性无明显影响,具有成为一种新型溶栓药物的潜能。α-淀粉酶抑制剂可以特异抑制α-淀粉酶的活力,可作为生物杀虫剂控制以谷物等淀粉类作物为食的害虫;在医药上可以用于减缓餐后肠道对淀粉的消化,从而减慢机体对糖分吸收,降低血糖,普遍用于II型糖尿病和肥胖的预防与治疗。通过大孔吸附树脂、离子交换、硫酸铵分级沉淀和Superdex 75凝胶层析等一系列分离纯化手段从CC5菌株中分离到一种蛋白源α-淀粉酶抑制剂AAI-CC5。MALDI-TOF分析显示AAI-CC5分子量为8212Da; N端前15个氨基酸序列为DTGSPAPECVEYFQS,和已报道的蛋白源淀粉酶抑制剂序列不同。AAI-CC5可以特异抑制哺乳动物来源的α-淀粉酶活力,未检测到对链霉菌、解淀粉芽孢杆菌、粘细菌和大蜡螟源淀粉酶的抑制活性。AAI-CC5对热及酸碱环境稳定,在pH 2.0-10.0处理24 h或80℃处理1 h均未检测到明显抑制活力丧失;在沸水浴20分钟内依然可以保持一半的抑制活性。根据N端序列分析和数据库相关蛋白序列比对分析,利用染色体步移技术克隆到AAI-CC5的编码基因aaiE,aaiE共编码110氨基酸,前34个为信号肽,后76个为成熟肽AAI-CC5,与来源于S.parvulus的Parvulustat有82%的相似性,属于WRY修饰的蛋白类淀粉酶抑制剂,这一类淀粉酶抑制剂的抑制活力是已报道的淀粉酶抑制剂中抑制活性最强的类群之一。AAI-CC5对猪胰腺淀粉酶的半抑制浓度IC50和抑制常数Ki分别为6.43×10-11和4.45×10-11。AAI-CC5成功在大肠杆菌中异源表达,重组淀粉酶抑制剂rAAI-CC5分子量为9404 Da,其抑制活性和稳定性与野生菌中分离获得的基本一致。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
纤维蛋白酶论文参考文献
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