导读:本文包含了防御素基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:瓢鸡,沙门菌,防御素基因,双向特异等位基因PCR扩增
防御素基因论文文献综述
黄梦阳,李杨,张林云,陈多珍,富国文[1]（2019）在《瓢鸡3个防御素基因（AvBD4、AvBD5、AvBD14）的Bi-PASA分子标记与沙门菌易感性的相关性研究》一文中研究指出研究以3个防御素基因(AvBD4、AvBD5、AvBD14)为鸡沙门菌易感性候选基因,以瓢鸡成年鸡沙门菌阳性群体与阴性对照群体为研究对象,采用序列测定和双向PCR扩增特异等位基因标记(Bi-PASA)技术,分析了3个防御素基因变异与沙门菌易感性的相关性。结果显示:在瓢鸡每个防御素基因编码区均检测到一个引起氨基酸变异的多态位点,分别建立了3个防御素基因的Bi-PASA分子标记;AvBD5基因A799G位点与瓢鸡沙门菌易感性的相关性达到极显着水平(P=0.0039),AvBD14基因的A2096T位点达到显着水平(P=0.017),而AvBD4相关性不显着(P=0.599);根据比值比(OR)与95%CI确定了每个防御素基因的保护基因型与易感基因型。研究结果对阐明防御素基因与沙门菌易感性的关系以及建立沙门菌抵抗力鸡群具有重要意义。(本文来源于《中国家禽》期刊2019年19期）
唐刻意[2]（2019）在《扬子鳄β防御素基因家族的解析及其肠道微生物冬眠适应性宏基因组学研究》一文中研究指出扬子鳄(Chinese alligator,Alligator sinensis),中国特有的濒危爬行动物,国家一级保护动物,是世界现存的23种鳄类中的一员。作为一种半水生的食肉动物,扬子鳄无时无刻不经受来着环境和肠道病源微生物的潜在威胁。鳄类血清中存在具有广谱抗菌活性的抗菌肽类物质,其中β防御素(β-defensin)即是抗菌肽的一种,其构成动物先天性免疫系统的第一道屏障。不同于在哺乳动物和鸟类中对β防御素的广泛研究,关于爬行动物β防御素的信息则相对有限,在鳄目中甚至还未曾有β防御素的报道。扬子鳄还是一种具有冬眠习性的变温爬行动物。由于寒季环境温度的下降和食物的减少,扬子鳄在冬眠期间保持深度休眠、低代谢率和禁食的生理状态。基于之前16S rRNA扩增子测序的研究表明,冬眠动物的肠道微生物群落组成和结构会随着宿主生理状态和食物摄入量的变化而呈现季节性波动。但从宏基因组水平对冬眠动物肠道微生物组在功能上的季节性变化的研究却鲜有耳闻;此外,冬眠宿主肠道黏膜及其免疫屏障与肠道菌群之间的季节性互作机理也尚不明确。因此,扬子鳄是我们研究冬眠引起的肠道菌群结构、功能改变和肠道免疫应答的天然理想模型。本研究中,我们通过生物信息学手段和RACE-PCR的方法在扬子鳄基因组scaffold687_1上鉴定到一个长390 kb的β防御素基因簇,由20个新的鳄类β防御素基因(AsBDs,Alligator sinensisβ-defensin genes)组成。通过对扬子鳄β防御素的基因结构、氨基酸序列、系统进化以及组织表达的解析,揭示了扬子鳄旁系AsBDs与哺乳动物α防御素在基因演化和功能上具有高度的相似性,为后续进行的β防御素与肠道微生物的关联研究奠定了基础。针对扬子鳄肠道微生物的研究,我们通过对冬眠期和活跃期的扬子鳄消化道各段(胃、小肠和结肠)内容物和粪便样品进行16S rRNA V3-V4高变区扩增子测序,并对粪便样品进行宏基因组de novo测序,以揭示其肠道微生物在优势菌群组成、菌群结构、群落多样性和预测功能上的季节性变化规律;并探讨了扬子鳄AsBDs在肠道组织中的季节性表达模式与肠道菌群的关系。主要的研究结果如下:(1)扬子鳄β防御素基因簇包含6个鸟类同源的直系AsBDs和9个爬行动物特有的旁系同源AsBDs。旁系AsBDs拥有一段较长的(36~60个氨基酸)连接肽段(Pro-piece),与哺乳动物α防御素的长连接肽段序列特征极为相似。由于二者拥有长度相当的氨基酸序列,致使旁系AsBDs和哺乳动物α防御素在电荷数和疏水性等理化性质上也保持高度的相似性。(2)旁系和直系AsBDs的“信号肽-连接肽”区段所受选择压力无明显差异(旁系:ω=0.759;直系:ω=0.604,p=0.471),二者ω值均小于1,经受纯化选择。旁系AsBDs成熟肽的ω值则显著高于直系AsBDs成熟肽(旁系:ω=1.208;直系:ω=0.499;p=0.034),表明旁系AsBDs成熟肽经历了更强烈的正选择压力;与哺乳动物α防御素成熟肽的进化方向一致。进化树结果显示旁系AsBDs与哺乳动物α防御素聚为一枝,暗示α防御素在进化上可能起源于爬行动物旁系AsBDs。(3)扬子鳄β防御素基因在各器官组织中的表达具有普遍性和差异性的特征。总体上,各AsBDs在消化道、脾、肝和肾等部位的表达量较高,在肌肉、胆囊和心脏中表达水平相对较低。旁系AsBDs在肠道各段的表达水平显着高于直系AsBDs在肠道相同部位的表达量,与同样在肠道中具有高表达特点的α防御素相似,暗示二者在表达和功能上也具有一定的相似性。(4)通过16S rRNA扩增子测序我们在扬子鳄肠道中鉴定到41个细菌门类和3215个OTUs。其中,变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和硬壁菌门(Firmicutes)为扬子鳄肠道微生物门水平的四大优势菌门,共同占比超过80%。基于宏基因组de novo测序,我们在扬子鳄粪便样本中共鉴定到51个细菌门和3907个细菌种,优势菌群在门和属水平上的分布情况与16S rRNA扩增子测序结果一致。(5)通过对不同季节的所有24个肠道微生物样本进行主成分分析(PCoA)、聚类分析(UPGMA)、相似性检验(ANOSIM)和典型相关性分析(CCA),结果均显示冬眠期和活跃期的扬子鳄肠道菌群在组成和结构上存在明显季节差异。环境温度和冬眠禁食是塑造扬子鳄肠道微生物群落的两个主要环境驱动因子。此外,考虑到活跃期扬子鳄的粪便与结肠处微生物群落在组成和结构上具有的较高相似度,我们提出在对濒危动物的肠道微生物进行研究时,建议使用粪便样本替代结肠样品的非损伤性取样策略。(6)拟杆门菌(Bacteroidetes)及其分类下的拟杆菌属(Bacteroides)是冬眠期扬子鳄肠道中显着大量富集的冬眠特异微生物群落,占比分别达到57.95%和55.82%。该门类的微生物具有强大的降解利用宿主来源底物——粘蛋白糖苷(Mucin glycan)的能力。基于CAZy数据库注释结果,我们总共在扬子鳄肠道宏基因组中鉴定到193个碳水化合物酶家族(CAZymes families)和458个碳水化合物酶(CAZymes)。其中有14个涉及降解和结合粘蛋白糖苷的碳水化合物酶家族和28种粘蛋白寡糖降解酶(Mucin oligosaccharide-degrading enzymes)在冬眠期显着富集,且其相对丰度显着高于活跃期。我们在细菌和宏基因组水平揭示了冬眠期肠道特异性微生物通过降解利用宿主来源的粘蛋白糖苷维持生命,以适应宿主冬眠禁食期间肠道内食物匮乏的分子机制。(7)活跃期扬子鳄消化道后段聚集着高丰度的梭杆菌门(Fusobacteria)微生物(20.37%~41.22%),具有典型的食肉动物肠道微生物群落特征。梭杆菌门(Fusobacteria)分类下贡献了95%占比的是一种具有蛋白水解功能的细菌——Cetobacterium somerae,该菌在活跃期消化道后段大量富集,其相对丰度显着高于冬眠期(活跃期vs.冬眠期:小肠:17.81%vs.0.09%,p=0.05;结肠:31.40%vs.0.35%,p=0.002;粪便:33.91%vs.0.81%,p=0.038)。除了高丰度的C.somerae,我们还检测到其它20种同样具有水解蛋白质、多肽和发酵氨基酸能力的细菌在活跃期扬子鳄肠道内显着富集,表明活跃期正常进食的扬子鳄肠道内大量聚集的蛋白质降解微生物以适应宿主高蛋白的饮食结构,对动物源性食物的细菌性降解和发酵有利于宿主对营养物质更高效地消化利用。(8)扬子鳄肠道内病源微生物分布和免疫相关基因季节性表达的相关性研究结果显示,扬子鳄肠道中检测到机会病原菌在不同季节均有分布,但活跃期肠道中存在更多的常见致病菌和病毒序列(活跃期vs.冬眠期:4.03%vs.0.04%)。叁个旁系β防御素(AsBD105α,105θ和105α)和MHC I1327基因在冬眠期肠道组织中的显着性高表达可能是应对冬眠期细菌性粘蛋白降解导致黏膜屏障减弱的免疫补偿机制;直系β防御素(AsBD5,AsBD10和AsBD13)、MHC beta和TLR-2基因的表达量则在活跃期显着地高于冬眠期,以抵御活跃期肠道内更多的病源微生物的入侵。得益于肠道免疫基因与肠道菌群的季节性互作反馈机制,扬子鳄得以维持肠道微生态系统的稳态并保障机体的健康。综上所述,扬子鳄β防御素基因簇的解析为后续研究其它动物类群尤其是爬行动物β防御素的进化研究提供了基础信息;为理解我国特有珍稀动物扬子鳄的免疫适应机制提供了重要参考;对未来开发新的抗生素类药物提供了重要的理论和应用依据。同时,在濒危动物的系统性保护工程中,我们呼吁相关从业人员应更多地关注动物肠道微生物多样性保护。扬子鳄肠道微生物组的研究结果在濒危动物保护生物学研究以及“宿主-微生物”共生体在能量代谢和免疫应答方面的互作机理具有重要实用意义和理论价值。(本文来源于《浙江大学》期刊2019-06-01）
向奥玲,张涛,唐蓓,陆俊杏[3]（2019）在《芸薹属物种(B.napus,B.rapa,B.oleracea)防御素基因PDF1.1的生物信息学分析》一文中研究指出本研究利用生物信息学方法分析芸薹属物种PDF1.1家族的结构功能,探究芸薹属物种PDF1.1家族的分子进化,为芸薹属物种PDF1.1家族抗菌性提供理论基础。本研究以甘蓝型油菜,白菜,甘蓝为例,利用生物信息学方法,鉴定了这3个芸薹属物种共有8个PDF1.1,并分析其PDF1.1的基本特征、同源性及系统发生关系。结果显示,8个PDF1.1均有1个内含子和2个外显子;共有79～80个氨基酸残基;均具有Knot1结构域,具有多个磷酸化位点,其中丝氨酸磷酸化位点0～1个,苏氨酸磷酸化位点0～1个,酪氨酸磷酸化位点1个;它们的二级结构主要为随机卷曲;既是疏水性蛋白,也是稳定蛋白;在不同物种间芸薹属PDF1.1的同源性高于种内同源性。芸薹属的结构特点是防御素抗菌作用的重要条件之一;其叁个物种的PDF1.1进化符合禹氏叁角理论,且叁个物种PDF1.1位点符合叁倍化学说。本研究为芸薹属物种PDF1.1抗菌性提供了科学依据。(本文来源于《分子植物育种》期刊2019年09期）
陈东,范海云,高世雯,王广龙,王云鹏[4]（2019）在《大蒜防御素基因AsPDF1的克隆与表达分析》一文中研究指出植物防御素是一类低分子量、富含半胱氨酸的抗菌多肽,是植物防御生物和非生物侵害的重要物质之一。为了解大蒜中防御素的序列特征和功能,本研究利用RT-PCR方法从大蒜‘苍山四六瓣’中克隆得到防御素基因AsPDF1。序列分析结果表明,来源于大蒜的防御素基因含有1个246 bp的开放阅读框,编码81个氨基酸。推测其编码的蛋白质分子量为8.45 kDa,等电点(pI)为9.36。该蛋白含有8个保守的半胱氨酸, N端有一段23个氨基酸组成的信号肽区域,空间结构由1个α螺旋和3股反向平行的β折叠构成。在进化关系上,大蒜防御素与禾本科的小麦和高粱防御素蛋白最为接近。荧光定量PCR分析表明, AsPDF1在根、鳞茎、叶片中均有表达,在根中表达量最高,且能响应盐胁迫的诱导。本研究克隆的大蒜防御素基因为进一步鉴定防御素基因的生物学功能和表达调控机制奠定了基础。(本文来源于《植物生理学报》期刊2019年02期）
黄兴,梁艳琼,习金根,郑金龙,贺春萍[5]（2018）在《龙舌兰防御素基因的鉴定与表达分析》一文中研究指出防御素在植物中广泛存在,其抗菌活性对真菌、细菌等的入侵具有抑制作用。本研究前期已从剑麻中克隆出1条防御素基因4sPDF1,以此为检索序列在已公布的剑麻近源物种龙舌兰(Agave tequilana)转录组数据库中进行Blast比对,从中获得1条AsPDF1的同源序列。对其进行生物信息学分析发现其具有完整的编码序列,开放阅读框具有267bp,编码88个氨基酸,含有5个保守Cys残基,具备Knot1功能域将,因此将其命名为AtqPDF1(NCBI序列号:GAHU01192839)。蛋白质序列比对显示AtqPDF1与AsPDF1差异较大,系统进化分析也显示AtqPDF1与剑麻、烟草、拟南芥、芦笋、油棕等防御素基因进化关系均较远,其功能可能与已知植物防御素差异较大。时空表达分析表明AtqPDFl在龙舌兰幼苗、叶和根部表达水平较高,在茎部表达水平较低。(本文来源于《中国植物病理学会2018年学术年会论文集》期刊2018-08-24）
周思宇[6]（2018）在《基于宿主防御素基因表达谱判别细菌病毒感染的研究》一文中研究指出感染是指病毒、细菌、真菌或寄生虫等病原体侵入宿主所引起的局部组织或全身性炎症反应。临床上不同类型的病原体感染可以针对性的采用不同的治疗策略,如细菌感染可以给予抗生素治疗、真菌感染可以给予抗真菌药物治疗等。因此,准确的病原体感染类型的判别对于感染性疾病的临床治疗具有重要意义。尽管传统的基于形态学、免疫学、分子生物学等的病原体检测方法已经在临床感染类型的判别方面得到广泛应用,近年来基于宿主基因表达谱并利用机器学习方法发现区分不同类型病原体感染的生物标记物从而区分感染类型的研究成为一个新兴的发展方向。这类基于生物信息学的间接诊断方法可以为传统的直接检测手段提供辅助和补充。防御素是有助于宿主防御细菌、真菌和病毒感染的内源性抗微生物多肽。不同的防御素已被证实在先天免疫中对宿主抵御细菌或病毒的感染发挥着重要作用。因此,本研究尝试通过分析防御素及其相关基因在感染过程中的表达来区分病毒感染和细菌感染。首先,我们在国际基因表达数据库(GEO)中筛选含有一种以上的感染类型的表达谱样本,并进一步从中选定了 4个涉及防御素及相关基因表达谱的数据集。其中,我们选取防御素表达值最多、质量最好的数据集作为训练数据集,其他叁个的作为验证数据集。然后,我们对每个数据集进行数据标准化、缺失值处理和数据整合等数据预处理操作,再根据探针的表达值估计防御素基因在每个样本的表达值,并对训练数据集进行差异基因表达分析,得到49个细菌病毒感染的差异表达基因。最后,针对这些基因,我们分别使用了 K-邻近算法、贝叶斯分类、支持向量机、决策树和随机森林等五种机器学习方法定义了五种分类函数,并根据留一交叉验证的结果调整参数,得到最优的分类模型。我们利用这五种分类方法评估了49个基因的基因集在四个数据集的分类效果,结果表明五种分类方法都可以很好的区分细菌或病毒感染,其中随机森林方法表现最佳。我们还将本研究与之前的报道发现的生物标记物的分类效果进行了比较,结果表明,本研究的分类效果优于其中一部分报道,和另一部分报道效果相当。此外,根据随机森林算法中分类效果的贡献程度,我们又进一步将49个基因集缩小到仅包含10个基因的基因集,分析结果表明这10个基因的基因集同样可以较好的区分病毒或细菌感染。准确判别细菌和病毒感染具有重要的临床价值,可以帮助临床医生选择恰当治疗方法。因此,找到能准确判别细菌或病毒感染的生物标志物具有重要意义。本研究在国际上首次尝试从防御素的角度出发,建立了基于防御素及相关基因表达谱的病原体感染类型判别机器学习新方法,可以为传统的临床病原体检测技术提供有益的补充。同时,本研究也从侧面验证了不同防御素在细菌或病毒感染过程中可能发挥了重要作用,为应用某些特定防御素基因作为生物标记物判别细菌或病毒感染提供了线索。尽管本研究目前局限于使用基于基因芯片的表达谱数据,但是本研究的基本策略和相关机器学习模型同样可以进一步扩展应用于新一代测序技术所产生的表达谱数据,为未来潜在的临床应用提供了可能。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2018-05-01）
刘志霞,周舟,蔡薇,程姣,任春梅[7]（2018）在《拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化》一文中研究指出PDF1.2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角色,其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应。试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建GUS报告基因的表达载体,通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转入拟南芥中,筛选获得了转化植株。获得以下主要结果:(1)成功克隆了拟南芥PDF1.2基因的启动子并将其与带GUS标记基因的载体进行了融合,得到了重组的融合载体;(2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥PDF1.2基因启动子融合载体转入到拟南芥植株中并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;(3)利用GUS染色技术检测了转基因植株中PDF1.2基因启动子的表达情况。(本文来源于《作物研究》期刊2018年02期）
徐燕玲,付丹影,司风玲,陈斌,郝友进[8]（2018）在《葱蝇防御素基因的鉴定及针刺对基因表达的影响》一文中研究指出【目的】分析葱蝇(Delia antiqua)防御素基因家族的序列特征、分子进化和基因表达模式,了解防御素基因在滞育期的免疫应答特征。【方法】利用生物信息学方法,从转录组数据库中搜索防御素基因家族的序列,并进行基因鉴定、系统发育、选择压力及针刺刺激对基因表达的影响分析。【结果】共鉴定出3个防御素前体序列及由此形成的40个氨基酸残基组成的成熟肽DaDef1,DaDef2和DaDef3,理论分子量分别为4.09,4.12 4.09kDa;等电点分别为8.71,8.69和8.35;它们具有昆虫防御素的典型的保守结构域,有3对分子内二硫键,均为外分泌型、稳定多肽。系统发育分析显示葱蝇防御素成熟肽Dadef1与新陆原伏蝇(Protophormia terraenovae)、丝光绿蝇(Lucilia sericata)和家蝇(Musca domestica)防御素亲缘关系最近并聚为一枝,再与Dadef2和Dadef3聚为一枝。基因表达分析表明针刺能明显影响葱蝇防御素基因的表达。【结论】葱蝇防御素基因家族序列保守性高,具有典型的家族特征;它们的表达模式在冬滞育和非滞育蛹的不同发育时期存在明显差异,说明葱蝇冬滞育蛹和非滞育蛹的免疫应答存在差异。研究结果为进一步研究昆虫防御素类抗菌肽的结构特征、进化以及滞育条件下免疫活动提供理论基础。(本文来源于《重庆师范大学学报(自然科学版)》期刊2018年02期）
白莉,陈亚东,夏永涛,许式见,胡谋[9]（2018）在《俄罗斯鲟β-防御素基因的克隆及表达分析》一文中研究指出β-防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,在脊椎动物免疫系统中发挥重要作用。本研究基于转录组Solexa测序结果,利用PCR和荧光定量PCR技术对俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti)β-防御素基因进行了克隆和表达模式分析。结果显示,俄罗斯鲟β-防御素c DNA片段长度为333 bp,包含开放阅读框(Open reading frame,ORF)213 bp,推测编码71个氨基酸;SMART分析显示,该基因包含23个氨基酸的信号肽、1个防御素-β-2结构域和6个保守的半胱氨酸残基,此结构与其他物种极为相似,在进化中比较保守。同源比对发现,俄罗斯鲟β-防御素与鱼类的相似度最高,为54%~60%。β-防御素基因在健康俄罗斯鲟11种组织(肝、肠、脾、头肾、胃、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉和性腺)中均有表达,其中,在性腺和皮肤中表达量最高;病原菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后可强烈影响β-防御素基因在6种免疫组织(肝、肠、脾、头肾、血液和鳃)中的时空表达。其中,在头肾中的上调表达最明显,在感染后72 h为表达峰值,达到0 h表达量的700倍。在脾、血液和肠中均有几倍至十几倍的上调,而在肝中整体呈现下调表达趋势。研究表明,β-防御素基因参与了俄罗斯鲟的免疫应答过程,本结果为俄罗斯鲟的免疫调控和病害防治研究奠定了基础。(本文来源于《渔业科学进展》期刊2018年05期）
陈圣阳,敖长金,郑彦楷,陈仁伟,刘旺景[10]（2018）在《沙葱黄酮对肉羊生产性能和肠道组织β-防御素基因表达的影响》一文中研究指出本试验旨在研究沙葱黄酮对肉羊生产性能和肠道组织免疫因子β-防御素-1(sBD-1)和β-防御素-2(sBD-2)基因表达的影响。选取60只健康、体重[(39.9±3.2)kg]相近的6月龄小尾寒羊羯羊,采用单因素完全随机区组设计,共分为4组,每组15只。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别饲喂在基础饲粮中添加11(低浓度黄酮组)、22(中浓度黄酮组)和33 mg/kg沙葱黄酮(高浓度黄酮组)的试验饲粮,共饲喂70 d,其中预试期15 d,正试期60 d。每天记录各组羊的采食量,每隔15 d晨饲前空腹称重1次。试验结束后每组随机选取3只羊进行屠宰,采集十二指肠、空肠、回肠组织样,应用实时荧光定量PCR进行sBD-1和s B-2基因相对表达量的测定。结果表明:1)试验第30~45天以及第45~60天,各试验组肉羊的平均日采食量均显着高于对照组(P<0.05),其中以高浓度黄酮组肉羊的平均日采食量最高;试验第45~60天,与对照组相比,各试验组肉羊的平均日增重显着提高(P<0.05),料重比显着降低(P<0.05),其中以中浓度黄酮组肉羊的平均日增重最高,高浓度黄酮组料重比最低。2)与对照组相比,饲粮添加33 mg/kg的沙葱黄酮显着提高了sBD-1基因在空肠和回肠中及sBD-2基因在空肠中的相对表达量(P<0.05),饲粮添加22 mg/kg的沙葱黄酮显着提高了sBD-2基因在十二指肠中的相对表达量(P<0.05)。综上所述,饲粮中添加22~33 mg/kg的沙葱黄酮能够显着提高肉羊生产性能和β-防御素(sBD-1、sBD-2)基因在肠道组织中的表达。(本文来源于《动物营养学报》期刊2018年03期）
防御素基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
扬子鳄(Chinese alligator,Alligator sinensis),中国特有的濒危爬行动物,国家一级保护动物,是世界现存的23种鳄类中的一员。作为一种半水生的食肉动物,扬子鳄无时无刻不经受来着环境和肠道病源微生物的潜在威胁。鳄类血清中存在具有广谱抗菌活性的抗菌肽类物质,其中β防御素(β-defensin)即是抗菌肽的一种,其构成动物先天性免疫系统的第一道屏障。不同于在哺乳动物和鸟类中对β防御素的广泛研究,关于爬行动物β防御素的信息则相对有限,在鳄目中甚至还未曾有β防御素的报道。扬子鳄还是一种具有冬眠习性的变温爬行动物。由于寒季环境温度的下降和食物的减少,扬子鳄在冬眠期间保持深度休眠、低代谢率和禁食的生理状态。基于之前16S rRNA扩增子测序的研究表明,冬眠动物的肠道微生物群落组成和结构会随着宿主生理状态和食物摄入量的变化而呈现季节性波动。但从宏基因组水平对冬眠动物肠道微生物组在功能上的季节性变化的研究却鲜有耳闻;此外,冬眠宿主肠道黏膜及其免疫屏障与肠道菌群之间的季节性互作机理也尚不明确。因此,扬子鳄是我们研究冬眠引起的肠道菌群结构、功能改变和肠道免疫应答的天然理想模型。本研究中,我们通过生物信息学手段和RACE-PCR的方法在扬子鳄基因组scaffold687_1上鉴定到一个长390 kb的β防御素基因簇,由20个新的鳄类β防御素基因(AsBDs,Alligator sinensisβ-defensin genes)组成。通过对扬子鳄β防御素的基因结构、氨基酸序列、系统进化以及组织表达的解析,揭示了扬子鳄旁系AsBDs与哺乳动物α防御素在基因演化和功能上具有高度的相似性,为后续进行的β防御素与肠道微生物的关联研究奠定了基础。针对扬子鳄肠道微生物的研究,我们通过对冬眠期和活跃期的扬子鳄消化道各段(胃、小肠和结肠)内容物和粪便样品进行16S rRNA V3-V4高变区扩增子测序,并对粪便样品进行宏基因组de novo测序,以揭示其肠道微生物在优势菌群组成、菌群结构、群落多样性和预测功能上的季节性变化规律;并探讨了扬子鳄AsBDs在肠道组织中的季节性表达模式与肠道菌群的关系。主要的研究结果如下:(1)扬子鳄β防御素基因簇包含6个鸟类同源的直系AsBDs和9个爬行动物特有的旁系同源AsBDs。旁系AsBDs拥有一段较长的(36~60个氨基酸)连接肽段(Pro-piece),与哺乳动物α防御素的长连接肽段序列特征极为相似。由于二者拥有长度相当的氨基酸序列,致使旁系AsBDs和哺乳动物α防御素在电荷数和疏水性等理化性质上也保持高度的相似性。(2)旁系和直系AsBDs的“信号肽-连接肽”区段所受选择压力无明显差异(旁系:ω=0.759;直系:ω=0.604,p=0.471),二者ω值均小于1,经受纯化选择。旁系AsBDs成熟肽的ω值则显著高于直系AsBDs成熟肽(旁系:ω=1.208;直系:ω=0.499;p=0.034),表明旁系AsBDs成熟肽经历了更强烈的正选择压力;与哺乳动物α防御素成熟肽的进化方向一致。进化树结果显示旁系AsBDs与哺乳动物α防御素聚为一枝,暗示α防御素在进化上可能起源于爬行动物旁系AsBDs。(3)扬子鳄β防御素基因在各器官组织中的表达具有普遍性和差异性的特征。总体上,各AsBDs在消化道、脾、肝和肾等部位的表达量较高,在肌肉、胆囊和心脏中表达水平相对较低。旁系AsBDs在肠道各段的表达水平显着高于直系AsBDs在肠道相同部位的表达量,与同样在肠道中具有高表达特点的α防御素相似,暗示二者在表达和功能上也具有一定的相似性。(4)通过16S rRNA扩增子测序我们在扬子鳄肠道中鉴定到41个细菌门类和3215个OTUs。其中,变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和硬壁菌门(Firmicutes)为扬子鳄肠道微生物门水平的四大优势菌门,共同占比超过80%。基于宏基因组de novo测序,我们在扬子鳄粪便样本中共鉴定到51个细菌门和3907个细菌种,优势菌群在门和属水平上的分布情况与16S rRNA扩增子测序结果一致。(5)通过对不同季节的所有24个肠道微生物样本进行主成分分析(PCoA)、聚类分析(UPGMA)、相似性检验(ANOSIM)和典型相关性分析(CCA),结果均显示冬眠期和活跃期的扬子鳄肠道菌群在组成和结构上存在明显季节差异。环境温度和冬眠禁食是塑造扬子鳄肠道微生物群落的两个主要环境驱动因子。此外,考虑到活跃期扬子鳄的粪便与结肠处微生物群落在组成和结构上具有的较高相似度,我们提出在对濒危动物的肠道微生物进行研究时,建议使用粪便样本替代结肠样品的非损伤性取样策略。(6)拟杆门菌(Bacteroidetes)及其分类下的拟杆菌属(Bacteroides)是冬眠期扬子鳄肠道中显着大量富集的冬眠特异微生物群落,占比分别达到57.95%和55.82%。该门类的微生物具有强大的降解利用宿主来源底物——粘蛋白糖苷(Mucin glycan)的能力。基于CAZy数据库注释结果,我们总共在扬子鳄肠道宏基因组中鉴定到193个碳水化合物酶家族(CAZymes families)和458个碳水化合物酶(CAZymes)。其中有14个涉及降解和结合粘蛋白糖苷的碳水化合物酶家族和28种粘蛋白寡糖降解酶(Mucin oligosaccharide-degrading enzymes)在冬眠期显着富集,且其相对丰度显着高于活跃期。我们在细菌和宏基因组水平揭示了冬眠期肠道特异性微生物通过降解利用宿主来源的粘蛋白糖苷维持生命,以适应宿主冬眠禁食期间肠道内食物匮乏的分子机制。(7)活跃期扬子鳄消化道后段聚集着高丰度的梭杆菌门(Fusobacteria)微生物(20.37%~41.22%),具有典型的食肉动物肠道微生物群落特征。梭杆菌门(Fusobacteria)分类下贡献了95%占比的是一种具有蛋白水解功能的细菌——Cetobacterium somerae,该菌在活跃期消化道后段大量富集,其相对丰度显着高于冬眠期(活跃期vs.冬眠期:小肠:17.81%vs.0.09%,p=0.05;结肠:31.40%vs.0.35%,p=0.002;粪便:33.91%vs.0.81%,p=0.038)。除了高丰度的C.somerae,我们还检测到其它20种同样具有水解蛋白质、多肽和发酵氨基酸能力的细菌在活跃期扬子鳄肠道内显着富集,表明活跃期正常进食的扬子鳄肠道内大量聚集的蛋白质降解微生物以适应宿主高蛋白的饮食结构,对动物源性食物的细菌性降解和发酵有利于宿主对营养物质更高效地消化利用。(8)扬子鳄肠道内病源微生物分布和免疫相关基因季节性表达的相关性研究结果显示,扬子鳄肠道中检测到机会病原菌在不同季节均有分布,但活跃期肠道中存在更多的常见致病菌和病毒序列(活跃期vs.冬眠期:4.03%vs.0.04%)。叁个旁系β防御素(AsBD105α,105θ和105α)和MHC I1327基因在冬眠期肠道组织中的显着性高表达可能是应对冬眠期细菌性粘蛋白降解导致黏膜屏障减弱的免疫补偿机制;直系β防御素(AsBD5,AsBD10和AsBD13)、MHC beta和TLR-2基因的表达量则在活跃期显着地高于冬眠期,以抵御活跃期肠道内更多的病源微生物的入侵。得益于肠道免疫基因与肠道菌群的季节性互作反馈机制,扬子鳄得以维持肠道微生态系统的稳态并保障机体的健康。综上所述,扬子鳄β防御素基因簇的解析为后续研究其它动物类群尤其是爬行动物β防御素的进化研究提供了基础信息;为理解我国特有珍稀动物扬子鳄的免疫适应机制提供了重要参考;对未来开发新的抗生素类药物提供了重要的理论和应用依据。同时,在濒危动物的系统性保护工程中,我们呼吁相关从业人员应更多地关注动物肠道微生物多样性保护。扬子鳄肠道微生物组的研究结果在濒危动物保护生物学研究以及“宿主-微生物”共生体在能量代谢和免疫应答方面的互作机理具有重要实用意义和理论价值。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
防御素基因论文参考文献
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标签：瓢鸡; 沙门菌; 防御素基因; 双向特异等位基因PCR扩增;