导读:本文包含了丝氨酸蛋白酶抑制因子论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:卒中,老年人,依达拉奉注射液,参麦注射液
丝氨酸蛋白酶抑制因子论文文献综述
李艳钰,陈丽[1]（2019）在《依达拉奉注射液联合参麦注射液治疗老年缺血性脑卒中患者的临床疗效及其对血清内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制因子、抵抗素水平和脑血流动力学的影响》一文中研究指出目的观察依达拉奉注射液联合参麦注射液治疗老年缺血性脑卒中患者的临床疗效,并探讨其对血清内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制因子(Vaspin)、抵抗素(Resistin)水平和脑血流动力学的影响。方法选取2016年1月—2019年1月自贡市第四人民医院收治的老年缺血性脑卒中患者140例,采用随机数字表法分为对照组和观察组,每组70例。两组患者入院后均予以常规治疗,对照组患者给予依达拉奉注射液治疗,观察组患者在对照组基础上给予参麦注射液治疗;两组患者均持续治疗2周。比较两组患者临床疗效及治疗前后血清Vaspin、Resistin、脑血流动力学指标[包括双侧大脑中动脉峰流速(Vp)、双侧大脑中动脉平均流速(Vm)及其对称性差值(DVp、DVm)]、美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分,记录两组患者治疗期间不良反应发生情况。结果 (1)观察组患者临床疗效优于对照组(P<0.05)。(2)两组患者治疗前血清Vaspin、Resistin水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,观察组患者治疗后血清Vaspin水平升高,血清Resistin水平降低(P<0.01)。(3)两组患者治疗前Vp、Vm、DVp、DVm比较,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,观察组患者治疗后Vp、Vm加快,DVp、DVm减小(P<0.01)。(4)两组患者治疗前NIHSS评分比较,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,观察组患者治疗后NIHSS评分降低(P<0.01)。(5)两组患者治疗期间不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论依达拉奉注射液联合参麦注射液治疗老年缺血性脑卒中患者的临床疗效确切,可有效提高血清Vaspin水平,降低血清Resistin水平,改善脑血流动力学,促进神经功能恢复,且安全性较高。(本文来源于《实用心脑肺血管病杂志》期刊2019年10期）
赵娜,汪国建,龙爽,粟永萍,王涛[2]（2019）在《Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子SPINK7在食管疾病中的研究进展》一文中研究指出Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子7(SPINK7),又名食管癌相关基因2 (ECRG2),是与食管癌发生发展密切相关的抑癌基因。研究显示其在食管癌组织存在表达失调,同时其短串联重复序列多态性与食管癌的易感性关系密切。机制分析表明SPINK7可通过分泌至胞外和留在细胞内两种不同的机制发挥抑癌作用。新近研究表明其表达失调与嗜酸性食管炎的发生有关。本文就SPINK7在食管癌、嗜酸性食管炎等食管相关疾病中的研究进展做一综述,并探讨该分子后续值得研究的问题。(本文来源于《消化肿瘤杂志(电子版)》期刊2019年02期）
陆畅畅,黄燕燕,续力云,何剑营,邱雷[3]（2019）在《丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型在人肺腺癌组织表达上调并促进肺腺癌细胞的增殖》一文中研究指出目的探讨肺腺癌组织丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal 1型(SPINK1)表达与生存时间的关系及其对肺腺癌细胞生长的影响。方法用Real-time PCR法、免疫组织化学法检测285例肺腺癌组织和癌旁组织SPINK1的表达,并分析其表达水平与临床病理特征及预后的关系。利用SPINK1慢病毒表达载体及小干扰RNA(si RNA),处理人肺腺癌细胞系,光学显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,ELISA或Real-time PCR检测SPINK1表达水平,细胞计数和集落形成法检测肺腺癌细胞生长情况。结果肺腺癌组织SPINK1 mRNA和蛋白表达均上调(均P<0. 0001),SPINK1高表达组患者总生存时间短于低表达组(50. 0个月vs 64. 5个月,P<0. 001)。SPINK1过表达组,肺腺癌细胞上清液SPINK1蛋白高表达(P <0. 05),增殖与克隆形成能力均上调(P <0. 05);SPINK1敲减组,肺腺癌细胞SPINK1 mRNA表达下调,增殖能力下调(P<0. 05)。结论肺腺癌组织SPINK1高表达提示患者预后不良; SPINK1促进人肺腺癌细胞的增殖。(本文来源于《解剖学报》期刊2019年02期）
杨帆[4]（2019）在《RNAi对旋毛虫丝氨酸蛋白酶1.2及丝氨酸蛋白酶抑制因子基因功能的研究》一文中研究指出旋毛虫是一种主要的食源性寄生线虫,旋毛虫病主要是由于生食或半生食含旋毛虫囊包的肉制品从而感染。旋毛虫成虫寄生在宿主的小肠内,但幼虫侵入肠黏膜的机制尚不完全清楚。蛋白酶能够催化蛋白质多肽链的水解,而在寄生虫体内分泌的有多种功能的蛋白酶,在寄生虫的侵入与致病过程有着重要的作用。旋毛虫丝氨酸蛋白酶Ts SP1.2和丝氨酸抑制因子Ts SPI是从旋毛虫排泄-分泌物(excretory-secretory,ES)中获得的。实验室前期已经发现Ts SP1.2(Gen Bank Accession No.:EU302800)和Ts SPI抑制因子(Gen Bank accession no.XP_003377380.1)均可能参与了旋毛虫感染性幼虫侵入小肠上皮细胞(IEC)。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在生物进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象[1]。本研究的目的是通过RNAi确定Ts SP1.2和Ts SPI在旋毛虫幼虫侵袭和生长发育中的作用。将特异性小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)通过电穿孔法导入旋毛虫肌幼虫(muscle larvae,ML)体内后,分别通过q PCR技术和Western blot技术来验证干扰效果。同时两个基因互为无关基因进行RNAi特异性的研究。此外,选取最优si RNA并导入旋毛虫肌幼虫后,体外观察幼虫存活率并在胆汁激活为肠道第1期幼虫(IL1)后进行侵入实验,观察RNAi沉默Ts SP1.2或Ts SPI是否能抑制幼虫对肠上皮细胞(IEC)的入侵与发育。将RNAi处理后的肌幼虫经口接种感染小鼠,观察沉默Ts SP1.2和Ts SPI对幼虫发育、存活及生殖力的抑制作用。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞本实验所用旋毛虫均来自本实验室昆明小鼠保种的旋毛虫(T1)。实验所用BALB/c小鼠,雄性6周龄,购自河南省实验动物中心。所用细胞系为本实验室分离出的小鼠小肠上皮细胞。2.Ts SP1.2和Ts SPI的表达纯化及抗其免疫血清的制备将本实验室之前冻存的Ts SP1.2和Ts SPI重组菌活化。进行r Ts SP1.2和r Ts SPI诱导表达,进行超声破碎并纯化蛋白,分别免疫小鼠,获取抗r Ts SP1.2和抗r Ts SPI的免疫血清。3.si RNA的设计及合成根据Ts SP1.2和Ts SPI的基因号,登录si RNA在线设计软件si Direct version 2.0进行设计。每个基因筛选出3个si RNA,根据其位点分别命名Ts SP1.2的si RNA为si RNA-534、si RNA-818、si RNA-303;Ts SPI的si RNA为si RNA-445、si RNA-653、si RNA-882。此外,设计一条Control si RNA并添加FAM荧光标记,用于实验观察是否将si RNA导入旋毛虫体内。4.将si RNA用电穿孔法导入到旋毛虫体内应用瞬时电击的方法,分别将2μМ不同si RNA导入到旋毛虫体内,体外培养18h后观察荧光信号。5.RNAi后在基因转录水平和蛋白表达水平的变化将siRNA转染肌幼虫后2、4、6及8天,通过qPCR和Western blot技术分别观察Ts SP1.2和Ts SPI基因转录水平和蛋白表达水平的变化。同时观察不同剂量si RNA(1、2、3μМ)的干扰效果。6.RNAi具有基因特异性分别选取2μМ来自Ts SP1.2和Ts SPI的si RNA进行基因沉默,两组互为对照组,验证RNAi基因特异性。7.RNAi后的虫体存活率及其对虫体侵入IEC的影响电穿孔处理旋毛虫肌幼虫后,体外培养7d,观察肌幼虫形态变化,计算存活率。应用电击法将1、1.5、2、2.5、3μM si RNA-534、si RNA-653和Control si RNA导入到旋毛虫肌幼虫体内,PBS作为对照组。体外孵育2h后观察肌幼虫体外入侵IEC情况,计算RNAi对虫体侵入IEC的抑制率。8.RNAi对旋毛虫感染性、发育及生殖力的影响将80只BALB/c小鼠分为4组(每组20只):分别为Ts SP1.2组、Ts SPI组、Control si RNA组及空白对照组。每只小鼠分别按300条肌幼虫进行经口感染。感染后6d后各组剖杀10只小鼠,回收肠道期成虫(AW),测量雌雄虫长度并计算成虫减虫率,每组分别抽取100条成虫进行体外培养,72h后收集新生幼虫(NBL),观察NBL虫体长度并计算雌虫生殖力。剩余小鼠在感染后35 d剖杀,收集肌幼虫,测量虫体长度并计算肌幼虫减虫率。结果1.si RNA的导入:通过荧光显微镜下观察,发现RNAi处理后幼虫体内有明显一条荧光且虫体通体发亮,而未处理的幼虫则没有荧光信号。2.RNAi对旋毛虫肌幼虫Ts SP1.2和Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的影响2.1 RNAi对旋毛虫Ts SP1.2基因转录和蛋白表达水平的影响:q PCR和Western blot结果显示,si RNA-534、si RNA-818、si RNA-303处理组肌幼虫Ts SP1.2基因转录水平相对于PBS对照组分别降低了57.05%、47.37%和27.18%(P<0.05),蛋白表达水平分别减少了69.65%、68.97%和37.09%(P<0.05);1、2、3μМsi RNA-534导入虫体后,Ts SP1.2基因转录水平降低了44.29%、53.81%和79.16%(P<0.05),蛋白水平分别减少了35.83%、44.05%和63.28%(P<0.05);2μM si RNA-534干扰后的肌幼虫在培养2d和4d基因表达量分别降低了56.44%和35.46%(P<0.05),蛋白水平分别降低了84.48%与67.35%(P<0.05),Control si RNA与PBS对照组相比较,Ts SP1.2转录和蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。2.2 RNAi对旋毛虫肌幼虫Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的影响:q PCR和Western blot分析发现,si RNA-445、si RNA-653、si RNA-882处理组同PBS对照组相比,Ts SPI基因转录水平分别降低了20.50%、42.09%和12.13%(P<0.05),蛋白表达水平分别减少了63.52%、80.26%和10.61%(P<0.05);1、2及3μМsi RNA-653导入虫体后1d,Ts SPI基因转录水平分别降低了23.57%、36.90%和60.78%(P<0.05),蛋白表达水平分别减少了26.47%、75.13%和89.18%(P<0.05);2μM si RNA-653干扰后的肌幼虫在4d和6d,基因表达量明显降低了75.75%和69.79%(P<0.05),蛋白表达量分别降低了69.23%和50.63%(P<0.05)。Control si RNA组同PBS对照组相比,Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。3.RNA干扰的基因特异性分析分别将si RNA-Ts SP1.2和si RNA-Ts SPI导入到幼虫体内后1d,观察RNAi对Ts SP1.2和Ts SPI蛋白表达水平的变化。结果发现,si RNA-Ts SP1.2处理组同PBS组相比,蛋白表达量减少了46.05%,si RNA-Ts SPI组蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05);si RNA-Ts SPI组蛋白表达量相对于PBS对照组减少了20.50%,Ts SP1.2组蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。4.RNAi后的虫体存活率RNAi后1d,si RNA-534、si RNA-653、Control si RNA组和PBS组幼虫死亡率分别为5.16%、4.80%、4.49%及3.16%(P>0.05)。沉默后7d,4组虫体死亡率分别为30.34%、34.08%、33.13%和32.73%(P>0.05)。结果表明RNAi对幼虫的生存能力没有明显的抑制作用。5.RNAi对虫体侵入IEC的抑制作用5.1 Ts SP1.2基因沉默对旋毛虫侵入IEC的抑制作用:2、2.5及3μМ的RNAi实验组与PBS组相比,均显着抑制了幼虫对IEC的侵入,3组的幼虫侵入率分别为42.82%、38.66%和32.88%(χ2 2μM=11.095,χ2 2.5μM=14.892,χ2 3μM=23.878;P<0.01);RNAi对幼虫侵入IEC的抑制效果与si RNA534的剂量具有相关性(r=0.981,P<0.001)。但是,不同浓度Control si RNA组的虫体侵入率的差异无统计学意义(P>0.05)。5.2 Ts SPI基因沉默对旋毛虫侵入IEC的抑制作用:2、2.5、3μМsiRNA-653转染旋毛虫体内后1d,3组的幼虫侵入率分别为43.68%、36.07%和30.54%(χ22μM=12.789,χ22.5μM=17.185,χ23μM=28.474,P<0.001);幼虫侵入率与si RNA653的浓度存在相关性(r=0.976,P<0.001)。不同浓度Control si RNA组的虫体侵入率的差异无统计学意义(P>0.05)。6.RNAi对旋毛虫感染性、发育及生殖力的影响6.1 Ts SP1.2-si RNA组:si RNA-534处理的肌幼虫感染小鼠后6d,RNAi组成虫荷(48.31±7.29)明显低于Control si RNA组(114.15±12.68)和PBS组(112.77±9.99)(Fadults=162.493,P<0.001);雌成虫培养72h后新生幼虫产量分别为53.33±8.26、78.17±6.33和76.17±6.78条(FNBL=39.547,P<0.001);感染后35 d从3组小鼠回收的肌幼虫数分别为1076.40±348.31、3410.79±643.72和3682.34±1090.84(FML=35.530,P<0.05)。结果表明,Ts SP1.2-si RNA处理幼虫接种小鼠后6d与35d成虫与肌幼虫的减虫率分别是57.16%和71.46%。虫体长度测量结果显示,si RNA组雌成虫长度(1496.48±96.19)μm低于si RNA对照组(1807.70±105.88)μm和PBS组(1999.05±36.42)μm;si RNA组与si RNA对照组的雄成虫长度分别为(867.92±28.11)μm与(949.89±20.01)μm,亦明显小于PBS组(996.29±70.27)μm(Ffemal=50.965,Fmale=6.205,P<0.05)。3组的新生幼虫长度分别为(73.72±9.69)μm、(116.50±2.59)μm和(119.28±4.64)μm(FNBL=39.547,P<0.0001)。si RNA组的肌幼虫长度(843.44±39.60)μm亦显着短于对照组的(1133.12±55.54)μm和PBS组的(1146.38±20.70)μm(F=57.836,P<0.001)。6.2 Ts SPI-si RNA组:si RNA-653处理的肌幼虫感染小鼠后6d,RNAi组成虫荷(440.92±8.29)明显低于Control si RNA组(114.15±12.68)和PBS组(112.77±9.99)(Fadults=191.887,P<0.001);雌成虫培养72 h后新生幼虫产量分别为(40.67±6.32)、(78.17±6.33)和(76.17±6.78)条(FNBL=112.406,P<0.001);感染后35 d从3组小鼠回收的肌幼虫数分别为(1012.29±131.41)、(3410.79±643.72)和(3682.34±1090.84)条(FML=57.014,P<0.05)。结果表明,Ts SP1.2-si RNA处理幼虫接种小鼠后6d与35d成虫与肌幼虫的减虫率分别是63.71%和72.38%。虫体长度测量结果显示,si RNA组雌成虫长度(1517.98±90.74)μm低于si RNA对照组(1807.70±105.88)μm和PBS组(1999.05±36.42)μm;si RNA组与si RNA对照组的雄成虫长度分别为(715.32±57.60)μm与(949.89±20.01)μm,亦明显小于PBS组(996.29±70.27)μm(Ffemal=40.683,Fmale=40.008,P<0.05)。3组的新生幼虫长度分别为(69.85±4.22)μm、(116.50±2.59)μm和(119.28±4.64)μm(FNBL=57.836,P<0.001)。si RNA组的肌幼虫长度(817.44±43.25)μm亦显着短于对照组的(1133.12±55.54)μm和PBS组的(1146.38±20.70)μm(F=39.547,P<0.001)。结论1.应用电穿孔法将Ts SP1.2和Ts SPI特异性si RNA成功导入到了旋毛虫肌幼虫体内。2.Ts SP1.2-si RNA 534和Ts SPI-si RNA 653分别明显降低了Ts SP1.2和Ts SPI的转录与表达。3.RNAi沉默Ts SP1.2和Ts SPI,均显着抑制了旋毛虫对肠上皮细胞的侵入与虫体的发育,并降低了雌虫的繁殖力,进一步证实Ts SP1.2和Ts SPI为旋毛虫的侵入相关蛋白,可作为抗旋毛虫疫苗的潜在的分子靶点。(本文来源于《郑州大学》期刊2019-04-01）
宋艳艳[5]（2018）在《旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子TsSPI的克隆表达与功能鉴定》一文中研究指出旋毛虫病是一种人兽共患寄生虫病,是由于宿主食入了含有活的囊包幼虫引起的。当活的囊包幼虫进入宿主之后,在宿主的胆汁和胃液的刺激下,激活成为肠道期感染幼虫,在感染30~48h之内,虫体经过4次蜕皮,发育长成为成虫,成虫的雌雄虫交配后,雄虫一般立即死亡并随宿主的粪便被排出体外,雌虫则继续发育,感染5 d开始产出新生蚴,新生蚴随着宿主的淋巴管和血管循环至全身各个地方,但只有到达横纹肌的新生蚴能够继续发育成长为肌幼虫~([1])。旋毛虫对宿主小肠上皮细胞的附着和侵入是其感染宿主的关键,但是其侵入机制目前尚不清楚。我们前期在旋毛虫成虫的分泌蛋白中鉴定出了旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Trichinella spiralis serine protease inhibitor,TsSPI),推测该蛋白可能参与旋毛虫的入侵。丝氨酸蛋白酶抑制因子能抑制丝氨酸蛋白酶的活性,是一组结构保守的蛋白超家族。该家族成员参与脊椎动物凝血级联、补体活化、炎症、细胞凋亡、细胞发育和纤维蛋白溶解等关键生物过程~([2])。本实验对旋毛虫的丝氨酸蛋白酶抑制因子(TsSPI,ID:Tsp_01570;蛋白ID:XP_003377380.1)采用分子克隆表达,纯化出了重组TsSPI(rTsSPI)并对TsSPI进行了qPCR分析、免疫荧光抗体定位分析;对rTsSPI的抑制功能进行分析;用抗rTsSPI血清进行了体外入侵和ADCC实验。旨在揭示TsSPI在旋毛虫侵入过程中的潜在功能。材料与方法1旋毛虫、实验小鼠、质粒、菌株及细胞旋毛虫为河南猪源地理株(ISS534);实验小鼠有BABL/c和昆明小鼠;表达质粒为pQE-80L;表达菌株为BL21;细胞为本实验室分离得到的IECs。2 TsSPI的生物信息学分析在ExPasy网站对TsSPI(GenBank accession no.XP_003377380.1)进行理化性质预测和疏水性分析;在TMHMM网站预测跨膜结构;在SignalP 4.1 Server进行信号肽预测;在TargetP 1.1 Server进行亚细胞定位分析。SWISS-MODEL网页版预测TsSPI的二级结构;PyMOL软件预测叁级结构。用BioEdit Sequence Alignment Editor软件,将旋毛虫TsSPI与其他寄生虫、小鼠和人等22个物种的丝氨酸蛋白酶抑制因子的序列进行比对;用MEGA的临接法对这22个物种的丝氨酸蛋白酶抑制因子进行1000次比对并绘制构建系统发育进化树。3 TsSPI的克隆表达和酶活性抑制功能分析用大肠杆菌表达rTsSPI并用镍柱对其进行亲和纯化;应用SDS-PAGE与Western blot分析rTsSPI的抗原性。用BAEE在A_(253nm)处的吸光度变化来计算其对胰酶的抑制率。4 TsSPI的表达、免疫定位及其旋毛虫侵入过程中的功能检测Real-time PCR分析TsSPI基因在不同期虫体的转录;IFA检测TsSPI在不同发育期虫体的表达与定位情况,通过Far-Western blot与IFA、荧光共聚焦显微镜检疫分析rTsSPI与正常小鼠肠上皮组织的结合情况,通过体外侵入实验观察抗rTsSPI小鼠血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞(IECs)的影响,采用ADCC实验评价抗rTsSPI小鼠血清对NBL的杀伤性。5.rTsSPI免疫小鼠诱导的免疫应答及保护效果将60只雌性BALB/c小鼠分成3组(免疫组、佐剂组及PBS组),每只小鼠应用rTsSPI进行皮下注射免疫(20μg/只,免疫4次,间隔2周),采集免疫前及每次免疫后小鼠血清,采用ELISA法检测小鼠血清抗体IgG、IgG1、IgG2a的水平。末次免疫后7 d,每只小鼠经口感染300条旋毛虫ML,感染后6d,每组剖杀10只,从收集肠道成虫,计算成虫减虫率。感染后35d每组剖杀另外10只小鼠收集肌幼虫,计算肌幼虫减虫率,评价rTsSPI对小鼠的免疫保护效果。6统计学处理使用PASW Statistics 18软件对数据进行分析,数据采用均数±标准差,2组比较采用t检验,其他采用单因素方差分析,检验水准为α<0.05。结果1旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子TsSPI的生物信息学分析以及其克隆表达与鉴定用NCBI、Ex Pasy等在线网站分析预测了旋毛虫TsSPI的结构域、理化性质、信号肽与跨膜结构域。结果显示,该基因序列全长1050 bP,编码349个氨基酸残基,蛋白质分子质量为39.59 kDa,等电点为5.78;TsSPI属于丝氨酸蛋白酶抑制因子家族。通过巢式PCR扩增出大小为1122 bp的TsSPI基因,将TsSPI基因一步克隆连接到表达载体pQE-80L上构建重组表达质粒pQE-80L/TsSPI,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,发现在42.5 kDa处出现一条明显条带,在上清与沉淀中均有该蛋白的表达,证明表达的rTsSPI为可溶性蛋白。Western blot分析显示,rTsSPI蛋白能被小鼠感染旋毛虫血清识别,但不能被正常小鼠血清识别,说明该重组蛋白具有良好的抗原性。抗rTsSPI血清能识别旋毛虫不同发育期虫体蛋白和ES蛋白中天然的TsSPI,表明TsSPI在旋毛虫各个虫期均有表达。2 TsSPI在不同期虫体的转录与表达Real-time PCR分析表明TsSPI在3d成虫期的转录水平为肌幼虫期的1.79倍(F=15.380,P<0.05),新生幼虫期的转录水平为肌幼虫期的2.27倍(F=51.129,P<0.05),肠道感染幼虫期的转录水平为肌幼虫期的-7.77倍(F=76.004,P<0.01)。IFA结果表明,TsSPI在各个虫期(肌幼虫、肠道感染性幼虫、3d与6d成虫及新生幼虫)都有表达,主要定位在虫体的表皮、杆状体及生殖器官等。3 rTsSPI抑制trypsin的酶活功能对rTsSPI进行生化实验分析,结果显示rTsSPI能够有效的抑制猪胰蛋白酶的活性,抑制率为59.33%。该重组蛋白在25℃~90℃之间对trypsin活性均有一定的抑制性,且在温度为25℃时抑制率最高。4 Far-Western和IFA检测rTsSPI与IECs的结合情况Far-Western结果显示rTsSPI能够与小鼠的IEC蛋白的29条带结合,证明rTsSPI能够与IECs相互作用,但是具体作用机制及作用过程仍不清楚。而用抗rTsSPI小鼠血清来进行IFA检测,发现rTsSPI能够与正常小鼠小肠上皮细胞结合而与正常小鼠的肝组织没有结合,说明rTsSPI与小鼠肠上皮细胞的结合是特异性的,进一步说明了rTsSPI能够与小鼠小肠肠上皮细胞相互作用。5重组蛋白(rTsSPI)及其抗血清对旋毛虫体外入侵的影响将血清加入含IECs的半固体培养基和旋毛虫幼虫共培养,结果显示抗rTsSPI血清组、感染旋毛虫小鼠血清组以及正常小鼠血清组幼虫侵入率分别为38.7%、16.85%和80.08%,统计学分析结果显示抗rTsSPI血清组、感染旋毛虫小鼠血清组和正常小鼠血清组之间侵入率的差异有统计学意义(χ~2=134.354,P<0.01)。抗rTsSPI血清对幼虫侵入IECs的抑制作用明显高于正常血清(χ~2=119.551,P<0.01),且这种抑制作用是抗体剂量依赖性的(F=160.236,P<0.01),表明血清rTsSPI血清可明显抑制旋毛虫对小鼠肠上皮细胞的侵入。6抗rTsSPI血清介导的ADCC在含小鼠腹腔巨噬细胞的培养板中,分别加入不同血清和新生幼虫,观察ADCC对旋毛虫新生幼虫的杀伤作用。感染旋毛虫小鼠血清组、rTsSPI免疫血清组、正常血清组和PBS组的死亡率分别为87.67%、27.67%、10.33%和6.33%(F=400.798,P<0.01)。rTsSPI免疫血清组的幼虫死亡率明显高于正常血清组的幼虫死亡率(χ~2=10.526,P<0.05)。细胞毒性与培养时间呈显着正相关(r=0.968,P<0.01),随培养时间的延长幼虫死亡率呈现增加趋势(F=117.584,P<0.01),并且细胞毒性为抗rTsSPI抗体剂量依赖性(r=-0.984,P<0.01),幼虫死亡率随着血清稀释度的增加呈下降趋势(F=96.813,P<0.01)。7 rTsSPI免疫小鼠的保护作用rTsSPI免疫小鼠攻虫感染后6d和35d,与PBS组相比,成虫和肌幼虫的减虫率分别为62.2%和57.25%(F_(adult)=62.34,F_(larva)=27.2,P<0.01);并且佐剂组的成虫(22.27%与肌幼虫(2.04%)减虫率均明显低于免疫组(F_(adult)=35.77,P<0.01;F_(larvae)=28.70,P<0.01)。结论1.本实验成功克隆表达了旋毛虫的丝氨酸蛋白酶抑制因子Ts SPI,并且该蛋白具有良好的抗原性。2.TsSPI存在于旋毛虫的各个生长阶段,主要定位在虫体表皮、杆状体及胚胎。3.rTsSPI能够有效的抑制胰酶活性并与肠上皮细胞产生特异性结合;抗rTsSPI小鼠血清能够抑制幼虫侵入肠上皮细胞并介导ADCC杀伤NBL且rTsSPI对小鼠有一定的免疫保护作用。(本文来源于《郑州大学》期刊2018-03-01）
刘勇杰[6]（2017）在《凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serpins）的鉴定及调控功能研究》一文中研究指出凡纳滨对虾,也称之为南美白对虾,是我国重要的养殖虾类。近年来,由于疾病频频爆发,我国乃至全球对虾养殖产业都遭受了巨大损失。因此,在加强病害防治的同时,更要加大对虾基础免疫的研究,为对虾抗病育种奠定分子基础。作为低等的无脊椎动物,凡纳滨对虾只能依赖于先天免疫系统来抵御病原的入侵。病原入侵后激活Toll/IMD通路以及酚氧化酶原系统,通过诱导产生抗菌肽以及发生黑化反应来杀灭病原。在这些免疫应激反应被激活的过程中,都需要丝氨酸蛋白酶的参与。然而,过多被激活的蛋白酶会对机体自身造成损害,引发对虾死亡,必须加以严格调控,做到按需激活。丝氨酸蛋白酶抑制因子serpin,能够通过对蛋白酶的特异性抑制,进而有效调控蛋白酶激活。本研究利用同源克隆结合网络数据、RACE技术,从凡纳滨对虾分离鉴定出4种serpin基因,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术,从mRNA水平对4个serpin基因的表达谱进行分析;构建EGFP融合表达质粒,转染果蝇S2细胞,分析serpin基因的亚细胞定位;过表达serpin基因,利用双荧光素酶报告基因系统,检测serpin基因对抗菌肽启动子活性的影响;体外合成双链RNA,利用RNA干扰技术沉默serpins表达后,探究其与通路相关基因的表达调控关系;构建原核表达载体,诱导表达、纯化得到4个serpin基因的重组蛋白,进行体外活性分析;定点突变serpinB3 P1P1’位点,分析P1P1’位点对蛋白酶抑制的选择特异性;利用GST Pull-down技术,检测与serpinB3结合的靶蛋白;利用抗体杂交进一步分析serpinB3与蛋白酶的作用机制,获得的主要研究结果如下:1.利用同源克隆和RACE技术从凡纳滨对虾克隆得到四个serpin基因,分别命名为Lvserpin3、Lvserpin7、Lvserpin8、LvserpinB3。四个serpin基因都含有信号肽序列、serpin结构域、反应中心环(RCL)以及典型的7-8个α-螺旋以及3个β-折迭,其中,LvserpinB3在其N末端具有一个跨膜结构域。2.共聚焦显微观测结果显示,与EGFP组相比,Lvserpin3定位在整个细胞,LvserpinB3主要定位在线粒体。在果蝇S2细胞过表达Lvserpin3,引起果蝇抗菌肽Attacin A启动子活性显着降低,过表达LvserpinB3后引起凡纳滨对虾抗菌肽Penaeidin4启动子活性显着下降。对启动子活性的抑制表明Lvserpin3和LvserpinB3能够参与对一些抗菌肽生成的调控,进而参与到对虾的抗菌免疫。3.凡纳滨对虾lvserpin3、lvserpin8和lvserpinb3在肝胰腺中表达量最高,lvserpin7在血细胞中表达量最高;在注射鳗弧菌后,lvserpin3基因的mrna表达量在感染早期显着上调,lvserpin7、lvserpin8及lvserpinb3在感染的后期,表达量极显着高于对照组。在注射溶壁微球菌后,lvserpin3和lvserpin7基因的mrna表达量在感染早期显着上调,而lvserpin8及lvserpinb3在感染的后期表达量显着上调。在注射wssv中后期,lvserpin3、lvserpin7、lvserpin8及lvserpinb3表达量都有显着地上调。利用dsrna干扰技术沉默lvserpin3表达后感染鳗弧菌,引起酚氧化酶原激活因子(lvppaf)和酚氧化酶原(lvpropo)的mrna表达量显着上调,血液酚氧化酶活力(po)显着上升;沉默lvserpin7后,lvppaf和酚氧化酶原激酶(lvppae)的mrna表达量显着上升;沉默lvserpin8后,酚氧化酶原激酶2(lvppae2)的mrna表达量显着上升;沉默lvserpinb3后,丝氨酸蛋白酶1(lvsp1)和lvppae2的mrna表达量显着增加。此外,沉默4个serpin都引起对虾累积死亡率显着上升。4.利用纯化得到的重组serpins蛋白进行体外抑制实验。rlvserpin3对枯草芽孢杆菌和鳗弧菌的结合活力很强,而对溶壁微球菌和大肠杆菌的结合活力较弱。而且,rlvserpin3蛋白能够通过对枯草芽孢杆菌和溶壁微球菌所分泌的蛋白酶的有效抑制进而抑制它们的生长。rlvserpin7不仅表现出对枯草芽孢杆菌和鳗弧菌强的结合活力,而且对枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶有显着的抑制作用。rlvserpin8蛋白对牛胰蛋白酶有显着的抑制效果。rlvserpinb3蛋白对胰蛋白酶、弹性蛋白酶以及木瓜蛋白酶都有显着的抑制效果。除此之外,rlvserpin3、rlvserpin7、rlvserpin8和rlvserpinb3蛋白能抑制酚氧化酶原反应的激活。5.突变第373位氨基酸(p1位点)r为g后,rlvserpinb3对胰蛋白酶的抑制活性有显着的降低;突变第374位氨基酸(p1’位点)i为g后,rlvserpinb3对胰蛋白酶的抑制活性有所下降,但与野生型相比抑制活性没有显着差异;而在同时突变373/374位氨基酸(p1p1’位点)ri为gg后,rlvserpinb3对胰蛋白酶的抑制活性显着降低。gstpull-down检测到rlvserpinb3蛋白能够下拉与其拥有相同p1p1’激活位点的rlvsp1蛋白。这就表明serpin能够通过识别具有相同p1p1’位点的蛋白酶而发挥抑制作用,改变p1p1’位点后,对蛋白酶的抑制效果不同,进一步表明serpin基因的p1位点对蛋白酶的抑制有选择特异性。对rlvserpinb3与蛋白酶反应物的westernblot检测结果显示,rlvserpinb3未与蛋白酶结合形成的大分子条带,而是被降解形成小片段分子,而且随着rlvserpinb3蛋白浓度的加大,小片段分子的浓度也相应的增加。上述研究结果表明,不同serpin基因在对虾机体中发挥的作用各不相同,或者是通过调节抗菌肽的产生,或者是通过对细菌蛋白酶以及参与酚氧化酶原系统激活的蛋白酶的抑制来参与到对虾机体防御中。通过对候选基因serpin的免疫调控研究,并以此作为选育指标,将为凡纳滨对虾的抗病育种提供一定的理论依据。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2017-04-01）
张石洋[7]（2016）在《候选转基因靶标基因亚洲玉米螟丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin1突变体构建及功能分析》一文中研究指出玉米是世界叁大禾谷类作物之一,是重要的粮食、饲料和工业加工原料作物。近几年,随着我国玉米种植面积扩大和逐年连作,亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的为害逐渐加重,严重影响玉米产量。目前,我国转基因抗虫玉米研发工作正在进行中。丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine proteinase inhibitors, Serpins)是一种分布广泛的家族型蛋白酶抑制剂,该家族的大多数成员都对丝氨酸蛋白酶具有特异性抑制。迄今为止,现己从动物、病毒、植物、细菌和古生菌中发现1500多类丝氨酸蛋白酶抑制因子,该类抑制因子一般含有350～400个氨基酸残基,分子量约为40～100 kDa,并拥有一个包含8-9个a螺旋和3个p折迭的保守的叁维结构。丝氨酸蛋白酶抑制剂通常在C端有一段暴露的反应中心(reactive centre loop)RCL序列,可以与丝氨酸蛋白酶共价结合,随后Serpin自身被裂解,RCL区域P1位点的氨基酸在serpin的结合过程中起关键作用。本文以亚洲玉米螟免疫相关的丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin1为候选转基因靶标基因,进行P1位点定点突变,构建突变体并分析其表达产物的功能。本实验室已克隆获得Of-Serpin1全长为1336 bp的cDNA序列(登录号：.X524148),含一个1188 bp的开放阅读框,编码395个氨基酸残基,预测的分子量为43.3 kDa,其pI值为4.92,拥有一个典型的RCL功能区域。为探究P1位点在亚洲玉米螟serpin1功能中的作用,本文设计突变引物,将野生型P1位点的亮氨酸L360(CTA)突变为精氨酸R360(AGG)、赖氨酸K360(AAG)、苯丙氨酸F360(TTC)和丝氨酸S360(AGT),并在Serpin1氨基末端添加FLAG标签。将野生型和四种突变体Of-Serpin1的ORF克隆于pET-28b表达载体中,之后转入E.coli BL21(DE3)菌株进行体外原核表达。利用Ni2+亲和柱对野生型及四种突变体Serpin 1 (R、K、F、S)重组蛋白进行亲和纯化,利用Western blotting鉴定纯化获得的蛋白。对野生型及四种突变体Serpin1(R、K、F、S)重组蛋白进行抑制动力学分析。结果表明：添加Of-Serpinl S360(AGT)后牛胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的Vmax值和Km值最小,表示Of-Serpinl P1位点为S360时与chymotrypsin的亲和力最大,亲和力从大到小的Of-Serpin1 P1位点依次为S360>K360>p360>L360>R360。添加Of-serpin1 S360 (AGT)后chymotrypsin的K1值最小,表示Of-Serpin1 P1位点为S360时对chymotrypsin的抑制作用越强,抑制作用强度从大到小的Of-Serpin1 P1位点依次为S360>K360>F360>L360>R360。生物信息学分析表明Of-Serpin1类似于抗胰凝乳蛋白酶因子,但是Of-Serpin1野生型及四种突变体重组蛋白的选择性剪切实验结果证明,它们均可同时被牛胰凝乳蛋白酶和牛胰蛋白酶(.rypsin)剪切。(本文来源于《扬州大学》期刊2016-05-01）
吴芳兰,范先成,李倩,陈立华,李宁沙[8]（2015）在《丝氨酸蛋白酶抑制因子基因检测在乳腺癌骨髓微转移诊断中的作用》一文中研究指出目的探讨乳腺癌患者骨髓中丝氨酸蛋白酶抑制因子(Maspin)m RNA的表达及临床意义。方法用荧光定量聚合酶链反应(RTFQ-PCR)检测58例乳腺癌、15例乳腺良性肿瘤及10例健康体检者骨髓中的Maspin m RNA表达,并分析Maspin m RNA表达与临床病理因素的相关性。结果 58例乳腺癌患者中,20例Maspin m RNA阳性表达,阳性表达率为35.3%(20/58),显着低于乳腺良性肿瘤患者(86.7%)和健康体检者(90.0%)(P<0.05)。Maspin m RNA阳性表达与乳腺癌临床分期、腋窝淋巴结转移呈负相关(P<0.05);与年龄、肿瘤大小、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达无关(P>0.05)。结论 Maspin m RNA可作为检测乳腺癌患者骨髓微转移(BMM)的分子指标之一。BMM检测可为乳腺癌患者的治疗和预后判断提供帮助。(本文来源于《中国现代医学杂志》期刊2015年32期）
汤小伟[9]（2015）在《亚洲玉米螟丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin1的组织分布及储存蛋白SP的表达》一文中研究指出丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serpins)属于一个对丝氨酸蛋白酶水解有抑制作用的蛋白大家族,它们中的大部分可以控制蛋白酶介导的生理过程并且可调节丝氨酸蛋白酶。迄今为止,从动物、植物、细菌和病毒体内鉴定出超过800种Serpins。为了探究Serpin1在昆虫免疫中的功能,本文通过已制备的亚洲玉米螟Serpin1的多克隆抗体,利用间接免疫荧光标记以及Western blot技术来检测Serpin1在亚洲玉米螟幼虫不同组织的分布情况,为进一步研究Serpin在PPO激活系统中的功能和作用机制提供基础,并有助于发现昆虫发育和免疫反应中的蛋白质酶激活途径。本文的间接免疫荧光标记实验结果表明：在粒血细胞、浆血细胞和类绛色细胞中Serpin1蛋白呈现绿色荧光,细胞表面有Serpin1蛋白的表达。根据Western blot实验杂交得到的条带深浅粗细可以判断Serpin1在体壁中表达量最高,然后是血淋巴,再者是脂肪体,中肠表达量最低。采用胶体金标记的免疫电镜观察,统计分析10个视野内金颗粒数,检测Serpin1蛋白的表达情况。实验表明：Serpinl在体壁中表达量最高,其次是脂肪体,中肠中最少。昆虫储存蛋白(storage protein, SP)是一种由6个亚基聚合而成的球形六聚体蛋白,同血蓝蛋白有很大的同源性。储存蛋白是昆虫作为营养物质储存起来供以后使用的一种蛋白质,它是全变态昆虫幼虫主要的体液蛋白,作为氨基酸储存库对成虫变态发育和雌性卵发育起着重要的作用。为了进一步研究储存蛋白的生化特性,我们利用从亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 5龄幼虫体内克隆获得的SP基因,构建pET-30a-SP原核表达载体,对原核表达条件进行优化,在大肠杆菌中重组表达了亚洲玉米螟SP蛋白。(本文来源于《扬州大学》期刊2015-11-01）
冯欣宇,马雅军,徐建农,梁江涛,夏爱[10]（2015）在《中华按蚊丝氨酸蛋白酶抑制因子14(SRPN14)基因的多态性和进化研究》一文中研究指出目的鉴定和定位中华按蚊丝氨酸蛋白酶抑制因子14(SRPN14)基因,分析其在不同群体中的多态性,以及进化中的选择压力。方法依据中华按蚊基因组测序数据,设计引物,建立扩增SRPN14基因部分片段的体系,荧光原位杂交进行染色体定位。测定采自我国12省(市)18个采集地的中华按蚊群体的SRPN14基因部分片段序列,计算其在群体内与群体间的遗传差异,以及适应性进化的选择压力。结果本研究获得的中华按蚊SRPN14基因部分序列长度为429 bp,与冈比亚按蚊SRPN14基因的对应位置在核苷酸和氨基酸水平的序列一致性分别为77%和88%,位于唾腺染色体的2L:23C亚区。采自我国13个群体411个个体中,SRPN14的等位基因数目共204个,其中51个在群体间共享,占25.00%。13个群体的中华按蚊SRPN14等位基因数目范围为11(辽宁群体LN)~33(重庆群体CQ),核苷酸多态性为0.008(LN)~0.024(海南群体HAN)。AMOVA分析结果显示,群体内变异显着大于群体间,群体内变异占总变异的95.79%,群体间差异小,遗传分化指数(FST)值为0.042。中华按蚊各群体SRPN14基因核苷酸同义替换位点数明显多于非同义替换位点数,ω均小于1。结论SRPN14基因在中华按蚊群体中存在一定的多态性,其进化受到负选择压力。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2015年04期）
丝氨酸蛋白酶抑制因子论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子7(SPINK7),又名食管癌相关基因2 (ECRG2),是与食管癌发生发展密切相关的抑癌基因。研究显示其在食管癌组织存在表达失调,同时其短串联重复序列多态性与食管癌的易感性关系密切。机制分析表明SPINK7可通过分泌至胞外和留在细胞内两种不同的机制发挥抑癌作用。新近研究表明其表达失调与嗜酸性食管炎的发生有关。本文就SPINK7在食管癌、嗜酸性食管炎等食管相关疾病中的研究进展做一综述,并探讨该分子后续值得研究的问题。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
丝氨酸蛋白酶抑制因子论文参考文献
[1].李艳钰,陈丽.依达拉奉注射液联合参麦注射液治疗老年缺血性脑卒中患者的临床疗效及其对血清内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制因子、抵抗素水平和脑血流动力学的影响[J].实用心脑肺血管病杂志.2019
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