一、Cloning of Two Genes Related to Plant Defense Response ofSea Island Cotton (Gossypium barbaden.se L. )(论文文献综述)
郭楠楠[1](2021)在《海岛棉GhDAHP同源基因的克隆及抗黄萎病功能初步验证》文中研究表明
王倩[2](2021)在《GhMAPKKK3、GhF-box及三个GhBsr-d1基因在棉花抗黄萎病中的功能鉴定》文中提出
刘世超[3](2021)在《大丽轮枝菌致病因子VdEPG1的致病机制研究》文中研究表明棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的世界性的土传维管束真菌病害,给棉花生产带来严重的经济损失。目前,棉花主栽品种并没有表现出很好的黄萎病抗性。研究大丽轮枝菌致病机制并探索致病基因与寄主棉花之间的互作关系能为棉花抗病育种提供理论依据和基因资源。大丽轮枝菌基因组编码分泌蛋白,在致病过程中与寄主植物展开博弈,其糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,GHs)家族成员能作为毒力因子,在侵染过程中发挥作用,并参与调控寄主植物免疫反应。本研究对大丽轮枝菌GH28家族成员VdEPG1的基因功能进行了研究,并找到其在寄主棉花中的互作蛋白,取得的主要结果如下:1.系统鉴定了大丽轮枝菌糖苷水解酶28家族基因,明确了其在棉花根组织诱导下的表达模式。研究发现VdGH28均受棉花根部组织诱导表达,这表明GH28家族基因在侵染过程中可能发挥作用,其中VDAG_04977(VdEPG1)在孢子和棉花根组织中均有较高表达量,表明VdEPG1可能起到关键作用。通过农杆菌介导的瞬时转化系统注射烟草叶片,发现11个VdGH28均不能引起烟草坏死反应,而VdEPG1能抑制由BAX引起的坏死反应,且抑制其引发的防御基因NbAcre31,NbCYP71D20,NbLOX,NbPR4,NbWRKY7表达。酵母信号肽捕获试验验证其具有分泌活性,表明VdEPG1可能作为毒力因子在黄萎病菌致病过程中被分泌到胞外起作用。2.通过同源置换的方法,对大丽轮枝菌基因组中的VdEPG1进行敲除与回补,得到敲除突变体与回补突变体。VdEPG1敲除后,其生长速率减慢,对氯化钾、氯化钠、山梨醇渗透胁迫更敏感;对细胞壁渗透胁迫SDS更敏感;对不同碳源的利用率、产孢量、穿透玻璃纸能力均下降并影响玻璃纸上菌丝排列,在棉花上的致病力也呈下降趋势。3.通过酵母双杂交技术,在寄主棉花中筛选到与茉莉酸合成相关的,植物二烯酸还原酶GH_D05G1193(GhOPR9)与VdEPG1互作,并通过酵母双杂交系统、BiFC和LCI试验,进一步验证GhOPR9与VdEPG1在体内和体外存在互作。通过亚细胞定位技术,证明GhOPR9与VdEPG1均能被定位在细胞膜上,存在在细胞膜互作的可能。4.对棉花中OPR家族进行生物信息学分析,发现GhOPR8与GhOPR9存在串联复制事件,通过酵母双杂交技术验证GhOPR8与VdEPG1不存在互作。研究发现10个GhOPR均受盐和大丽轮枝菌胁迫诱导,其中GhOPR9在大丽轮枝菌诱导下,在棉花根部的表达量显着上调;干旱胁迫抑制GhOPRs表达。通过VIGS技术在棉花中沉默GhOPR9和超表达转基因拟南芥,发现GhOPR9正调控对黄萎病的抗性。5.通过qRT-PCR技术和ELISA技术,检测到在接种大丽轮枝菌前后,GhOPR9沉默棉花植株茉莉酸通路相关基因表达量有上升趋势,茉莉酸积累量低于对照植株,结果表明GhOPR9参与调节棉花中茉莉酸合成;检测接种大丽轮枝菌野生型Vd991、敲除突变体、和回补突变体前后的棉花植株体内的GhOPR9表达量。结果表明,接种敲除突变体的植株体内的GhOPR9表达量下调,茉莉酸积累量高于其他。表明,VdEPG1可能通过调节GhOPR9表达量,影响棉花体内茉莉酸合成。综上所述,本研究探究了大丽轮枝菌致病因子VdEPG1的致病机理,筛选到其与寄主棉花的互作蛋白GhOPR9,且GhOPR9对棉花抗黄萎病具有正调控作用。VdEPG1可能参与由GhOPR9介导的茉莉酸合成路径,诱导寄主免疫抗性,为后续棉花的抗病育种提供新的理论依据。
斯欢[4](2021)在《全基因组关联分析解析棉花代谢产物的遗传和生化基础》文中研究表明植物能够合成大量结构与功能各异的代谢产物,其中一些代谢产物与作物品质以及抗性的形成有着密切的关联。解析这些代谢产物的遗传及生化基础对于解析复杂数量性状形成的调控机制有重要的意义。本研究利用代谢组及全基因组关联分析方法对棉花代谢谱以及代谢产物自然变异的遗传基础进行了研究,结果如下:1、棉花非靶向代谢组学方法的建立为了稳定、高通量地对棉花代谢产物进行分析,本研究基于UPLC-QTOF-MS平台建立了棉花半极性代谢物液相分离和质谱检测的方法,随后结合计算机模拟、手动搜索以及标准品验证等方式对棉花中所检测到的代谢产物进行鉴定,最终注释和鉴定了125个代谢产物,并利用标准品验证了其中的10种。2、昆虫口腔分泌物诱导下的棉花代谢谱研究为了验证上述所建立的方法的有效性,本研究对棉铃虫和斜纹夜蛾口腔分泌物以及机械损伤处理下的棉花叶片的代谢谱进行分析,结果显示,昆虫口腔分泌物处理能够显着地引起棉花代谢谱的变化,而不同的昆虫口腔分泌物所引起的代谢物的差异积累趋势并不相同。棉花受到机械损伤后能够引起棉酚含量的显着积累,而这种积累模式却能够被昆虫口腔分泌物处理显着地抑制,本研究对棉酚合成路径上基因的表达量分析也证明了这种抑制作用的存在。3、棉花种间代谢谱差异及代谢物驯化研究为了探究棉花在驯化和改良过程中代谢谱的变异情况,本研究对25个具有代表性的陆地棉栽培种、6个陆地棉地理种系以及部分野生材料的代谢谱进行了比较,聚类分析和主成分分析都表明栽培种与野生种之间在代谢水平上存在显着的差异。驯化分析表明,在检测到的1775个代谢特征物中,595个代谢物在栽培种与地理种系间存在潜在的选择信号,其中包括了类黄酮路径和谷胱甘肽代谢路径上的代谢产物。4、基于代谢产物的全基因组关联分析为了研究陆地棉代谢产物的遗传基础,本研究将一个包含267份陆地棉栽培种的自然群体种植于不同环境进行取样和代谢组学分析,并在3个不同环境中分别检测到了996(2016年武汉),828(2016年鄂州)和776个(2017年鄂州)几乎无冗余的代谢信号。随后利用大约270万个高质量的SNP基于代谢性状在混合线性模型下进行全基因组关联分析。最终在不同环境下分别检测到了1877(2016年武汉),1419(2016年鄂州)和898(2017年鄂州)个m QTL。进一步结合候选基因表达量分析以及同源基因比对,最终得到了14个可能影响代谢物积累的候选基因。5、腺体形成基因编码区的转座子插入影响多种代谢产物的积累为了研究m QTL在染色体分布的均一性,本研究对其分布区域进行了热点区域分析。其中一个位于A12染色体上的区域与包含棉酚在内的多种代谢产物的含量呈现显着的关联。对该热点的进一步分析发现,候选区域内存在一个腺体形成相关基因Ghir_A12G025340,沉默该基因的表达后棉花植株中超过20%的代谢产物发生差异积累,其中棉酚的含量下调80%以上。超表达该基因能够显着提升棉酚含量,而次生代谢产物的高量积累也同时影响愈伤组织的进一步分化。对极端材料中该基因的序列进行比较发现,低棉酚品种中该基因编码区含的一个~5kb的转座子插入可能是影响腺体发育进而影响代谢物积累的关键。6、多组学结合促进候选基因鉴定为了更加高效地鉴定代谢性状相关的候选基因,本研究利用40份棉花材料的表达谱数据进行e QTL分析以及代谢物与基因表达量的相关性分析,结合关联分析结果构建了“SNP-基因表达量-代谢物含量”的网络,并挑选了其中的两个基因进行了功能验证。其中Ghir_D13G004710被鉴定为一个编码酰基转移酶的基因,其基因表达量与目标代谢物含量呈显着正相关,且e QTL区间与目标代谢物m QTL区间重叠,沉默该基因的表达可以显着抑制部分丙二酰基化类黄酮的含量。类似地,本研究中利用同样的方法鉴定和验证了Ghir_A12G019280在调控棉花中山奈酚及其衍生物含量上的功能。7、糖基转移酶影响ABA-GE的合成并参与调控棉花抗旱通过全基因组关联分析,我们在D02染色体上鉴定到一个与ABA-GE含量显着相关的m QTL,进一步分析发现,该区间内存在一个糖基转移酶基基因Ghir_D02G002230。表达模式分析显示,该基因受干旱诱导下调表达且在耐旱材料中的表达量显着低于敏旱材料。体外表达分析实验证明重组Ghir_D02G002230蛋白具有糖基化ABA的活性。在棉花体内沉默该基因的表达后,ABA-GE的含量显着下调。抗旱性实验证明沉默该基因的表达能够有效增强棉花对干旱的抗性。8、抗虫相关代谢产物的筛选为了获得与棉花抗虫性相关的代谢产物及其候选基因,本研究结合田间抗虫表型数据和代谢物含量,通过共表达网络分析以及性状与模块的相关性分析鉴定到了一个与植物抗虫性呈显着正相关的代谢物模块,并从该模块中筛选到了一个关键的代谢产物,并将其候选基因定位于A06染色体。
黄铭慧[5](2021)在《大豆对孢囊线虫Heterodera glycines的分子遗传抗性机制研究》文中研究表明大豆孢囊线虫(soybean cyst nematode,SCN,Heterodera glycines)病是一种世界性的毁灭性大豆(Glycine max)病害。防治大豆孢囊线虫最经济有效的方法是结合抗性品种和非寄主品种轮作,但由于土地的有限性,轮作受到限制;高毒有效的化学杀线虫剂已被禁止或者限制使用;SCN在田间是混合群体,存在多个生理小种;目前大多数抗性品种的抗性单一,东北的抗性资源更有限,仅有的抗线品种对变异线虫的抗性已出现减弱或丧失;已存在的抗线育种系的分子遗传背景及抗性机制未知,使得这些资源不能充分被利用。因此筛选和培育多抗品种是当务之急,解析抗性机制使这些抗性种质资源得到充分利用,加速分子辅助育种。本研究的主要结果如下:1.通过对62个大豆基因型的SCN抗性反应进行评价,SCN包括4号生理小种(SCN4,HG type 1.2.3.5.6.7)和5号生理小种(SCN5,HG type 2.5.7),结果表明了不同品种之间的表型差异非常显着。对rhg1和Rhg4位点进行特异性引物扩增及测序,在51个黑龙江省地方大豆种质资源中,共鉴定了3种单倍型,发现了新的抗病类型且所检测的东北主栽品种均为感病。进一步通过定量PCR分析证实了rhg1和Rhg4的表达量高低和基因的拷贝数相关,而拷贝数与抗感有关。本研究所鉴定的抗性资源及相关的分子标记有利于加速SCN分子辅助育种。2.基于前期结果,选取抗SCN4但对SCN5感病的新型抗性基因型09-138(单倍型II)与地方感病品种绥农54(单倍型III)进行杂交,形成F2代,并对SCN4表型筛选,结果发现表型雌虫指数(Female Index,FI)分布广泛(FI范围,3-439)且后代的FI超出抗病亲本09-138(FI 9)和感病亲本绥农54(FI 113),表明多基因参与大豆对SCN抗性调控且表现出超亲遗传现象。通过Graded Pool-seq方法检测到SCN抗性相关的区间位于8、10、11、13及14号染色体,总长度为6.5 Mb。通过靶向测序基因型检测(GBTS),利用单因素标记Kruskal-Wallis(K*)分析(P<0.005)且多因子MQM定位方法(LOD>2)共鉴定了分布在16条染色体上的21个QTLs对抗性的贡献率范围是5.7-12.6%,双亲对抗性均有贡献,证实了SCN抗性的超亲遗传。同时对Graded Pool-seq与GBTS共同检测到的基因区间进行了功能注释,发现了一些与生物和非生物胁迫有关的转录因子可能与大豆抗SCN有关。3.在QTL定位F2(绥农54×09-138)群体时,发现多个微效基因参与抗性,同时发现一些分离个体的雌虫指数FI低但根重比较小。因此为了进一步完善SCN评价指标,该研究首次利用162个BC3F7-BC7F3大豆染色体代换系群体CSSLs(G.max绥农14×野生型G.soja ZYD00006)开展了每克根重SCN的孢囊数(cysts per gram root,CGR)的抗性评价和QTL定位研究,表型鉴定结果表明表型分布广泛,SCN5 FI和CGR都呈现出了超亲遗传现象,FI与CGR的相关性比较低(R2=0.0018),CGR与根重的相关性较高(R2=0.5424)。使用K*单标记检测和MQM方法共鉴定得到38个QTLs(FI和CGR)覆盖了大豆20条染色体,双亲对超亲遗传都有贡献。研究发现在缺少SCN主要抗性基因(如rhg1和Rhg4)的情况下,综合考虑FI、CGR及根重三者有利基因的组合可以有效抑制线虫繁殖,同时发现对SCN有耐性并适合于东北种植的具有绥农背景的代换系株系具有潜在的应用价值。4.为了解析09-138对SCN4和SCN5的抗性差异,利用全长转录组(ONT)对侵染和未侵染的大豆根部进行测序。通过基因组结构分析,得到lnc RNA转录本为288个,可变剪接数量均在200个左右;转录因子分析中WRKY、AP2/ERF-ERF、NAC、GRAS转录本的数量均在200个以上;差异表达基因分析中共鉴定了2255个DEG。通过对差异表达基因进行功能注释及富集分析,所有过氧化物酶的GO注释与防御线虫反应相关(GO:000215),KEGG富集于苯丙烷类生物合成(ko00940);96%的WRKY转录因子与呼吸爆发防御反应相关(GO:0002679);VQ(Valine-glutamine)motif基因中,与对照相比Glyma.03G120700与Glyma.19G125300基因表达最高,可能在防御线虫方面存在潜在的功能。同时利用q RT-PCR比较了3个单倍型不同抗感的大豆品种(09-138,抗线12号、11-452和东生1号)在3个时间点(3 d、6 d和8 d)对SCN4和SCN5的表达,同一基因表达量的不同,说明对两个线虫之间防御机制不同,对这些基因功能研究将有助于阐明线虫的抗性或者防御机制。综上,本研究所筛选的抗性种质资源、确定的抗性单倍型、鉴定的分子标记能够加速东北大豆抗孢囊线虫分子辅助育种,通过解析大豆-孢囊线虫复杂的互作机制,从而丰富了线虫-植物互作知识。
柴生樾[6](2021)在《中国野生山葡萄抗灰霉病转录因子VaERF99功能及其作用机理》文中研究表明葡萄(Vitis vinifera L.)是世界四大水果(柑桔、苹果、葡萄和香蕉)之一,具有极高的经济和营养价值。葡萄在我国农业产业和区域经济发展中占有十分重要的地位。然而葡萄生产上灰霉病(Grey mould)却普遍发生,并随着我国设施栽培的广泛应用而日趋严重。因此挖掘葡萄抗灰霉病基因,通过分子育种的手段来改善葡萄品质显得尤为重要。课题组前期通过对抗病材料中国野生山葡萄‘双优’在灰霉菌侵染后不同时期的转录组分析和表达谱分析筛选出具有显着差异表达的乙烯响应转录因子VaERF99。本研究以高抗灰霉病中国野生山葡萄‘双优’为材料克隆得到VaERF99基因,开展其抗灰霉病功能及调控机制研究,揭示VaERF99抗灰霉病分子机理。主要研究结果如下:1.中国野生山葡萄乙烯响应转录因子VaERF99的CDS序列长度为1266bp,编码422个氨基酸,包含一个AP2保守结构域,与欧洲葡萄的氨基酸序列一致性为97.86%。亚细胞定位实验表明VaERF99定位于植物细胞核。2.以抗病葡萄“双优”及感病葡萄“红地球”的果实为试材,接种灰霉菌后发现,VaERF99在不同时间点的表达存在差异,在接种五天后,VaERF99的表达均出现峰值。组织特异性表达分析表明,ERF99在两种材料的茎、叶中表达量较高,而在根、果实中的相对表达量偏低。3.VaERF99瞬时转化葡萄叶片并接种灰霉病的实验初步验证了VaERF99基因抗灰霉病功能。接种灰霉菌48h后,瞬时过表达VaERF99的葡萄叶片显着增强了对灰霉病的抗性。利用农杆菌介导的遗传转化将VaERF99过表达及基因编辑载体转化欧洲葡萄‘无核白’,为后续VaERF99基因功能验证奠定基础。4.通过酵母双杂交技术筛选到VaERF99的互作蛋白VaTLP3,并通过酵母回复验证,荧光素酶报告系统(Split-Luc)实验,免疫共沉淀技术(CO-IP)在体内体外验证二者的互作关系,揭示了VaERF99的抗病机制。‘红地球’和‘双优’葡萄叶片及果实接种灰霉菌后的表达分析表明,VaTLP3也受到灰霉菌的诱导表达。5.对VaERF99的启动子进行了克隆,启动子元件分析表明其启动子区域内包含有与生物胁迫相关的多种顺式作用元件。利用酵母单杂交技术从酵母c DNA文库中筛选出VaERF99的上游调控因子VaERF20,并通过回复验证及双荧光素酶实验进一步确认VaERF20与VaERF99启动子区域的GCC-box元件结合从而调控VaERF99基因的表达,阐明了上游基因对VaERF99的调控机理。
孙梦坤[7](2021)在《拟南芥zar1的RNA-seq分析及ZAR1的配体筛选》文中研究表明植物的双受精、受精后合子的激活、胚胎发育等过程的分子机制一直是植物生殖生物学研究的重点问题。在胚胎发生的过程中,合子的不对称分裂对胚胎的体制模式建成至关重要。我们前期研究发现,富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶(leucine-rich repeat receptor-like protein kinases,LRR-RLKs)家族成员蛋白ZAR1(zygotic arrest1,ZAR1),调控合子不对称分裂,并影响分裂后其子细胞的细胞命运。受精前,ZAR1在成熟胚囊的中央细胞、卵细胞和助细胞中均有表达;受精后,ZAR1在合子和胚乳中表达;ZAR1蛋白可以与Ca2+-Ca M1和异三聚体Gβ蛋白的发生相互作用,共同调控合子不对称分裂和分裂后顶-基细胞的细胞命运决定。通过对ZAR1突变体zar1-2和野生型Ler,从配子体发生到合子第一次不对称分裂完成的发育时期进行RNA-seq和数据分析,获得了ZAR1受体激酶在合子发育过程中共表达或者差异表达的基因,找到15个可能与ZAR1相互作用的小肽蛋白ZI1~ZI15。这些小肽大多都是分泌型富含半胱氨酸(cysteine-rich peptides CRPs)家族成员,可能作为ZAR1激酶的配体参与合子不对称分裂过程。我们通过酵母双杂交方法,对筛选到的这15个小肽蛋白进行初步检测,发现ZI2,ZI6,ZI14能够与ZAR1的胞外LRR结构域发生相互作用;ZI9与ZAR1胞外域发生弱的相互作用,ZI1,ZI10,ZI13,本身带有自激活活性,与ZAR1相互作用还需要进一步确认。需要对ZI2,ZI6,ZI14这3个候选配体的小肽和ZAR1的相互作用通过体外pull-down实验再次验证,并通过突变表型或者表达模式,找到ZAR1调控的合子不对称分裂的真正配体。
吴朝峰[8](2020)在《棉花腺体形成相关基因GhERF105的功能分析》文中指出棉花是世界上最重要的经济作物之一,棉籽是纤维和蛋白的重要来源。然而,存在于色素腺体的棉酚毒素限制了棉籽的开发利用,长时间食用棉酚,会引起人和单胃动物消化系统的代谢紊乱。同时,棉酚又是棉花体内特有的天然毒素,能提高棉株对某些真菌、病害和虫害的拮抗作用。因此,挖掘色素腺体发生的相关基因、解析腺体形成的分子机制、选育低酚棉品种一直是育种家孜孜追求的目标和方向。基于棉花色素腺体2套近等基因系叶片转录组数据比较分析,我们获得了一个差异表达的AP2/ERF转录因子,命名为Gh ERF105。为了探究其功能,通过生物信息学、基因表达、乙烯诱导、VIGS、酵母单(双)杂等方法对其进行分析。主要研究结果如下:(1)Gh ERF105基因编码区全长711bp,编码236个氨基酸。蛋白质分子量为26.26k Da,理论p I 7.72。二级结构预测存在α-螺旋(22.88%),β-转角(3.81%),延伸链(13.14%)和无规则卷曲(60.17%)。Gh ERF105蛋白在第91-155个氨基酸之间存在1个AP2结构域。亚细胞定位预测Gh ERF105可能位于细胞核。进化树分析显示Gh ERF105蛋白与海岛棉、亚洲棉、陆地棉和雷蒙德氏棉中的同源蛋白的相似性较高,说明该类蛋白在棉属的进化中比较保守。(2)利用荧光定量PCR对无腺体和有腺体棉花材料及不同组织部位中Gh ERF105基因的表达情况进行分析。结果表明,Gh ERF105基因在有腺体陆地棉品种中棉所12、17、辽7和陆地棉遗传标准系TM-1的叶片和茎中相对表达量均高于显性无腺体品种中棉所12、辽7和隐性无腺体品种中棉所12、17。同时,该基因在有腺体陆地棉中棉所12子叶、真叶、叶柄、下胚轴、茎、花萼、花瓣及铃壳等部位的相对表达量明显高于无腺体棉中棉所12。推测Gh ERF105基因可能与腺体形成有关。(3)利用VIGS技术对Gh ERF105基因进行功能分析,发现Gh ERF105基因沉默后,有腺体中12植株新生的叶片腺体数目大幅度减少和棉酚含量降低。证明Gh ERF105基因参与叶片腺体形成和棉酚合成。(4)将Gh ERF105和GFP蛋白融合构建p BI121-Gh ERF105-GFP表达载体,将其注射烟草叶片进行亚细胞定位,结果发现Gh ERF105-GFP蛋白在烟草细胞核中表达。利用酵母单杂交实验证明Gh ERF105基因能够特异性识别和结合靶基因启动子上的GCC-box和DER作用元件,表明Gh ERF105是一个典型的ERF转录因子。(5)以有腺体陆地棉品种中棉所12和显性无腺体品种中棉所12为材料,克隆了Gh ERF105基因上游2000 bp的启动子序列并对其进行初步分析,生物信息学分析表明,Gh ERF105基因启动子序列中含有大量的TATA-box和CAAT-box保守元件,以及光调控元件,ABRE,ARE,ERE,GCN4-motif,TC-rich repeats等多个顺式作用元件。诱导表达分析表明Gh ERF105明显受乙烯利诱导上调表达,在喷施乙烯利8 h后,Gh ERF105表达量达到最高值,表明Gh ERF105基因参与到乙烯信号转导途径。(6)构建酵母诱饵表达载体p DHB1-Gh ERF105,并对其进行自激活和毒性检测。结果显示,诱饵蛋白Gh ERF105不能单独启动NMY51菌株中报告基因表达,并且对酵母细胞无毒性。通过酵母双杂交实验共筛选到52个可能与Gh ERF105互作的蛋白,挑选出7个蛋白质再次进行共转验证和α-galactosidase检测,结果表明这7个蛋白质均与Gh ERF105蛋白互作。同时,采用双分子荧光互补试验进一步确认了互作结果。综上所述,Gh ERF105基因可能通过乙烯信号通路来参与棉花色素腺体的形成,为解析棉花腺体形成的分子机制提供理论依据,为培育新的低酚棉品种提供候选基因和辅助筛选标记。
王佳玉[9](2020)在《棉花转录因子GhWRKY21调控植株抗旱和耐高温的分子机理研究》文中进行了进一步梳理棉花作为主要的棉纺织工业原料,是我国重要的经济作物之一。多种非生物胁迫(如干旱、高温等)严重影响了我国棉花的生产。WRKY转录因子是高等植物特有的转录因子,广泛参与调控植物对多种环境胁迫的应激反应。然而,由于功能的复杂性,WRKY转录因子在棉花抗逆过程中的作用还不清楚,其调控植物抗逆反应的分子机制仍需进一步阐明。本实验从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)(鲁棉研22)中分离出一个Ⅱd族WRKY转录因子家族成员,GhWRKY21。利用生物信息学、分子生物学、生物化学等技术,明确了GhWRKY21在调控棉花非生物胁迫抗性方面发挥的重要作用,解析了GhWRKY21调控棉花抗旱性的分子机制。主要结果如下:(1)GhWRKY21基因cDNA全长1494 bp,包含173 bp的5’非编码区、324 bp的3’非编码区和996 bp的开放阅读框(ORF)。ORF可以编码一个含331个氨基酸残基的多肽,其分子量约为36.8 kDa,等电点为9.51。多序列比对及进化树分析显示,GhWRKY21是典型的Ⅱd族WRKY转录因子家族成员。(2)亚细胞定位结果显示GhWRKY21特异性的定位在细胞核中。表达特性分析发现GhWRKY21在棉花根、茎、叶中均有表达,表达水平可受到干旱、高温等非生物胁迫,脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(JA)等信号分子的诱导。(3)利用病毒介导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing,VIGS)获得了GhWRKY21沉默的棉花植株。功能分析发现,沉默GhWRKY21显着提高了棉花对干旱和高温胁迫的耐受力,使棉花叶片受损伤程度明显下降。(4)利用农杆菌介导的叶盘转换法得到了超表达GhWRKY21的转基因烟草,通过对转基因烟草在干旱胁迫下的发芽率、存活率、失水率和气孔开度等指标的测量以及表型分析,发现超表达GhWRKY21降低了转基因植株的抗旱性。此外,在添加ABA合成抑制剂后,超表达GhWRKY21的转基因烟草在干旱胁迫下种子的萌发率和萌发后的根长与野生型相比,没有显着差异。因此,GhWRKY21调控棉花对干旱胁迫的响应是依赖ABA的。(5)通过对ABA信号通路中所有A型PP2C蛋白磷酸酶的启动子元件分析,得到GhWRKY21可能调控的候选基因。酵母单杂交和EMSA实验结果表明,GhWRKY21可以直接与GhHAB启动子中的W-box结合。荧光定量分析表明,在棉花中超表达GhWRKY21可以促进GhHAB的转录水平,而沉默GhWRKY21后,棉花中GhHAB的表达水平显着降低。以上结果表明,GhWRKY21通过调控GhHAB的表达,负调节ABA介导的抗旱性。(6)通过对高温处理下,超表达GhWRKY21转基因烟草种子的萌发率和幼苗期相关生理指标的分析,发现超表达GhWRKY21降低了转基因烟草对高温胁迫的耐受性,同时转基因烟草中热激相关基因的表达水平显着下降。以上结果说明,GhWRKY21可能通过影响热激相关基因的表达水平调节植物的耐热性。
熊显鹏[10](2020)在《Gh4CL30和GhWRKY70D13在棉花抗黄萎病中的功能研究》文中研究表明目的:棉花(Gossypium hirsutum L.)是世界上重要的经济作物和天然纤维的主要来源,在国民经济中占有重要地位。棉花在生长过程中经常会受到各种生物和非生物的胁迫导致棉花减产,如冷害、干旱和病虫害等。由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病(Cotton Verticillium Wilt)是影响世界棉花生产最为严重的病害,被称为棉花的“癌症”。提高棉花品种对黄萎病菌抗性是防治黄萎病最经济和最有效的方法。由于陆地棉缺乏黄萎病抗源,常规育种手段很难解决其抗病难题。因此,开展棉花抗黄萎病分子机制研究,对利用基因工程手段提高陆地棉对黄萎病抗性具有重要意义。方法:(1)本研究利用转录组测序(RNA-seq)技术,对陆地棉中抗黄萎病品种石大陆抗-1(SD)和感黄萎病品种军棉1号(JM)之间差异表达基因进行挖掘,并对其中受黄萎病菌诱导表达的基因所涉及的相关通路进行了注释,利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选抗病候选基因。(2)分析了SD和JM接种黄萎病菌后不同时间点的差异表达基因,利用Blast2GO和KOBAS 2.0软件分别对黄萎病菌诱导的差异表达基因进行了KEGG和GO富集分析。(3)利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、病毒诱导基因沉默(VIGS)和其它生理生化方法,揭示Gh4CL30调控棉花抗黄萎病的机制。(4)通过VIGS、RNA干扰(RNAi)、RNA-seq和其它生理生化方法,阐明GhWRKY70D13在棉花抗黄萎病反应中的作用。结果与结论:(1)在未接种黄萎病菌的陆地棉抗感品种SD和JM之间鉴定了6831个差异表达基因,其中2866个基因在SD中高表达,3965个基因在JM中高表达。在这些差异基因中,有3685和3239个基因分别在SD和JM中受黄萎病菌诱导差异表达,表明SD和JM之间大部分的差异表达基因都参与棉花对黄萎病菌侵染的应答。根据接种黄萎病菌后不同时间点的表达谱,对这6831个差异基因进行WGCNA分析,共鉴定了23个核心抗病候选基因。(2)SD和JM在接种黄萎病菌不同时间点(12、24和48 h)与未接菌(0 h)相比,分别检测到2010和1275个差异表达基因。GO功能富集显示,SD和JM中的差异表达基因都主要参与单一生物代谢过程和氧化还原过程。KEGG功能富集分析结果表明,苯丙氨酸代谢、单萜生物合成、倍半萜和三萜生物合成、二萜生物合成和植物昼夜节律的基因都在SD和JM中富集,而苯丙烷生物合成途径和植物激素信号转导只在SD中富集。研究发现大量木质素合成相关基因在SD和/或JM中被黄萎病菌诱导上调表达。此外,13个植物激素信号转导相关基因在SD和/或JM中被诱导,这些基因涉及水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)和油菜素类酯信号通路。(3)qRT-PCR分析表明Gh4CL30在棉花茎中优势表达,并在抗感材料根和茎中受黄萎病菌诱导上调表达,表明Gh4CL30可能参与棉花对黄萎病的抗性。利用VIGS技术抑制Gh4CL30在棉花中的表达,棉花植株对黄萎病菌的抗性显着提高。抑制Gh4CL30表达降低了黄酮、总木质素和S单体含量,却增加了G单体含量和G/S的比值。与对照植株相比,Gh4CL30沉默植株中SA和JA含量及信号通路相关基因的表达均被显着抑制,这表明Gh4CL30沉默植株对黄萎病抗性的提高可能不依赖于SA和JA信号通路。与对照植株相比,Gh4CL30沉默植株中咖啡酸和阿魏酸含量增加,进一步研究发现,外源添加咖啡酸和阿魏酸可以显着抑制黄萎病菌菌丝生长。以上结果表明,抑制Gh4CL30表达可以增强棉花对黄萎病菌的抗性,这可能与木质素组份改变以及咖啡酸和阿魏酸的积累有关。(4)在亚洲棉、雷蒙德氏棉和陆地棉中分别鉴定得到5、5和10个WRKY70基因。进化分析结果显示,棉花WRKY70转录因子是AtWRKY70的同源蛋白。在每个GhWRKY70基因启动子中至少都包含了一种激素响应顺式元件。GhWRKY70D13在根和茎中的表达高于其它组织,同时该基因受黄萎病菌诱导上调表达。利用VIGS和RNAi的方法抑制GhWRKY70D13的表达提高了棉花对黄萎病的抗性。比较转录组学和qRT-PCR分析发现抑制GhWRKY70D13的表达导致ET和JA合成和响应基因的表达被激活。此外,GhWRKY70D13-RNAi植株中1-氨基环丙烷-1-羧酸、JA和茉莉酸异亮氨酸的含量均显着高于野生型植株。以上结果表明,抑制GhWRKY70D13能激活ET和JA信号通路,从而提高GhWRKY70D13抑制表达植株对黄萎病菌的抗性。
二、Cloning of Two Genes Related to Plant Defense Response ofSea Island Cotton (Gossypium barbaden.se L. )(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Cloning of Two Genes Related to Plant Defense Response ofSea Island Cotton (Gossypium barbaden.se L. )(论文提纲范文)
(3)大丽轮枝菌致病因子VdEPG1的致病机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略语表 |
1 文献综述 |
1.1 大丽轮枝菌及其侵染 |
1.2 黄萎病的致病机理 |
1.2.1 阻塞学说 |
1.2.2 毒素学说 |
1.3 大丽轮枝菌的致病机制 |
1.3.1 微菌核形成相关基因与致病性研究 |
1.3.2 菌丝生长相关基因与致病性研究 |
1.3.3 大丽轮枝菌分泌蛋白致病性研究 |
1.3.4 大丽轮枝菌分泌细胞壁降解酶致病性研究 |
1.3.5 大丽轮枝菌糖苷水解酶研究进展 |
1.4 棉花抗黄萎病相关基因研究 |
1.5 植物二烯酸还原酶(OPR)研究进展 |
1.6 研究目的与意义 |
2 材料与方法 |
2.1 试验材料 |
2.1.1 菌株及质粒载体 |
2.1.2 植物材料 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 糖基水解酶28(GH28)家族基因的鉴定 |
2.2.2 qRT-PCR检测VdGH28家族基因受棉花诱导表达模式 |
2.2.3 VdGH28家族基因序列扩增 |
2.2.4 烟草瞬时表达VdGH28家族基因观察HR反应 |
2.2.5 VdEPG1在烟草中抑制由BAX引起的HR反应试验 |
2.2.6 酵母信号肽捕获系统分析试验 |
2.2.7 VdEPG1敲除与回补突变体的获得 |
2.2.8 VdEPG1敲除与回补突变体生长表型分析 |
2.2.9 VdEPG1敲除与回补突变体玻璃纸穿透试验 |
2.2.10 VdEPG1敲除与回补突变体在棉花中致病力测定 |
2.2.11 VdEPG1的互作蛋白筛选与验证 |
2.2.12 棉花OPR基因家族分析 |
2.2.13 陆地棉OPR家族基因在不同条件胁迫下表达模式分析 |
2.2.14 验证串联复制事件GhOPR8与VdEPG1互作现象 |
2.2.15 VIGS试验 |
2.2.16 超表达GhOPR9拟南芥植株对黄萎病抗性验证 |
3 结果与分析 |
3.1 VdGH28家族基因鉴定与诱导表达分析 |
3.1.1 VdGH28家族基因鉴定 |
3.1.2 GH28家族基因进化树分析 |
3.1.3 VdGH28家族基因诱导表达分析 |
3.2 VdEPG1在烟草中抑制由BAX引起的细胞坏死 |
3.2.1 11个VdGH28成员均不能引起烟草叶片细胞坏死 |
3.2.2 VdEPG1在烟草中能够抑制由BAX引起的细胞坏死反应 |
3.2.3 VdEPG1在烟草中能够抑制由BAX引起的相关防御基因表达 |
3.2.4 VdEPG1的信号肽具有分泌功能 |
3.3 VdEPG1敲除突变体与回补突变体的获得 |
3.3.1 VdEPG1敲除突变体的获得 |
3.3.2 VdEPG1回补突变体的获得 |
3.4 VdEPG1敲除突变体在不同培养基中生长情况分析 |
3.4.1 VdEPG1敲除突变体在PDA培养中生长缓慢 |
3.4.2 VdEPG1敲除突变体对渗透胁迫敏感 |
3.4.3 VdEPG1参与膜响应十二烷基硫酸钠(SDS)胁迫 |
3.4.4 VdEPG1影响孢子的形成 |
3.4.5 VdEPG1在不同碳源培养基中生长情况分析 |
3.5 VdEPG1敲除突变体在棉花上致病力下降 |
3.6 VdEPG1参与调控大丽轮枝菌穿透玻璃纸 |
3.6.1 VdEPG1敲除突变体不能穿透玻璃纸 |
3.6.2 VdEPG1敲除突变体改变菌丝排列形态 |
3.7 VdEPG1与寄主棉花基因GhOPR9(GH_D05G1193)相互作用 |
3.7.1 VdEPG1与GhOPR9在酵母菌株中存在相互作用 |
3.7.2 VdEPG1与GhOPR9在植物体内互作 |
3.8 棉花OPR基因家族分析 |
3.8.1 棉花OPR家族基因鉴定 |
3.8.2 OPR家族基因进化树分析 |
3.8.3 棉花中OPR家族基因的基因结构,保守motif分析 |
3.8.4 棉花中OPR家族基因的染色体定位 |
3.8.5 棉花中OPR家族基因的共线性分析 |
3.8.6 棉花中OPR家族基因的启动子顺势作用元件预测 |
3.9 陆地棉OPR家族基因胁迫下表达分析 |
3.9.1 陆地棉OPR家族基因在旱胁迫下的表达分析 |
3.9.2 陆地棉OPR家族基因在盐胁迫下的表达分析 |
3.9.3 陆地棉OPR家族基因在大丽轮枝菌胁迫下的表达分析 |
3.10 VdEPG1与GhOPR8不存在互作关系 |
3.11 棉花中沉默GhOPR9对黄萎病抗性降低 |
3.12 拟南芥中超表达GhOPR9对黄萎病抗性增强 |
3.12.1 拟南芥GhOPR9超表达植株的获得 |
3.12.2 拟南芥GhOPR9超表达植株对黄萎病抗性增强 |
3.13 GhOPR9通过调控茉莉酸的合成影响棉花对黄萎病抗性 |
3.13.1 GhOPR9调控棉花中茉莉酸通路基因表达 |
3.13.2 GhOPR9调控棉花中茉莉酸合成 |
3.14 VdEPG1通过影响GhOPR9表达调节棉花对黄萎病抗性 |
4 讨论 |
4.1 病原物与寄主植物协同进化 |
4.2 VdEPG1作为毒力因子影响大丽轮枝菌致病性 |
4.3 VdEPG1调控大丽轮枝菌生长发育 |
4.4 VdEPG1可能参与激活寄主棉花茉莉酸合成从而抵抗黄萎病菌的侵染 |
参考文献 |
附录 |
附表 |
攻读期间发表论文情况 |
致谢 |
(4)全基因组关联分析解析棉花代谢产物的遗传和生化基础(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
1 文献综述 |
1.1 代谢组学概述 |
1.1.1 代谢组学的含义 |
1.1.2 代谢组学研究的技术手段 |
1.1.3 非靶向代谢组学的数据预处理 |
1.1.4 代谢物鉴定策略 |
1.2 植物代谢组学研究 |
1.2.1 代谢谱分析 |
1.2.2 代谢物的驯化分析 |
1.2.3 基于代谢性状的全基因组关联分析 |
1.2.4 基于代谢组学解析植物复杂性状 |
1.2.5 多组学整合促进功能基因组学发展 |
1.3 棉花代谢组学的研究进展 |
1.4 本研究的目的和意义 |
2 材料与方法 |
2.1 棉花材料来源和取样 |
2.1.1 棉花材料的来源 |
2.1.2 关联群体材料的种植和取样 |
2.2 样品准备与提取 |
2.2.1 化学试剂及仪器 |
2.2.2 昆虫口腔分泌物收集和处理 |
2.2.3 棉花DNA提取 |
2.2.4 棉花RNA提取与目的基因表达量检测 |
2.2.5 棉花半极性代谢物提取 |
2.3 UPLC-QTOF-MS条件和参数 |
2.4 数据处理和分析 |
2.4.1 代谢数据预处理 |
2.4.2 代谢物驯化分析 |
2.4.3 关联群体基因型检测 |
2.4.4 群体特征分析 |
2.4.5 全基因组关联分析 |
2.4.6 转录组分析 |
2.4.7 e QTL分析 |
2.4.8 进化树分析 |
2.4.9 基因表达分析 |
2.4.10 统计分析 |
2.5 载体构建与转化 |
2.5.1 病毒诱导的基因沉默载体构建及转化 |
2.5.2 超表达载体构建及转化 |
2.5.3 体外表达载体构建及原核表达 |
2.5.4 Western Blot |
2.5.5 体外活性检测 |
2.6 棉花干旱处理 |
2.7 ABA-GE检测 |
3 结果与分析 |
3.1 棉花代谢组学研究方法的建立 |
3.1.1 棉花代谢组学检测方法 |
3.1.2 代谢产物的鉴定和注释 |
3.2 棉花代谢谱研究 |
3.2.1 模拟昆虫取食下陆地棉代谢谱研究 |
3.2.2 不同棉种的代谢谱差异研究 |
3.2.3 陆地棉代谢产物的驯化研究 |
3.3 棉花代谢产物遗传基础解析 |
3.3.1 陆地棉栽培种中代谢产物的自然变异 |
3.3.2 自然群体的基因组遗传变异分析 |
3.3.3 棉花自然群体的m GWAS分析 |
3.4 候选基因的功能验证 |
3.4.1 一个代谢热点区域的功能解析 |
3.4.2 多组学分析验证候选基因 |
3.4.3 糖基转移酶对ABA-GE合成的调控 |
3.5 抗虫相关代谢产物的发掘 |
4 讨论 |
4.1 多种平台的结合促进代谢物检测和鉴定 |
4.2 非靶向代谢组学的挑战和机遇 |
4.3 多组学分析促进候选基因鉴定 |
4.4 代谢组学促进棉花功能基因组学研究 |
5 棉花代谢组学研究展望 |
参考文献 |
附录1 关联群体中棉花材料的信息及数据源 |
附录2 用于代谢驯化分析的棉花材料详情 |
附录3 RNA-Seq数据来源 |
附录4 试剂配制 |
附录5 本研究所用部分引物 |
附录6 作者简介 |
已发表和待发表的论文 |
已申请专利 |
致谢 |
(5)大豆对孢囊线虫Heterodera glycines的分子遗传抗性机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第1章 引言 |
1.1 大豆孢囊线虫病 |
1.1.1 大豆孢囊线虫病的特点及危害 |
1.1.2 大豆孢囊线虫病防治 |
1.2 大豆孢囊线虫的种群多样性及抗性资源 |
1.3 大豆孢囊线虫的遗传抗性及分子标记 |
1.4 抗大豆孢囊线虫基因rhg1和Rhg4 |
1.5 QTL定位的连锁分析与关联分析 |
1.5.1 遗传分离群体构建及连锁分析 |
1.5.2 关联分析 |
1.6 超亲遗传抗性 |
1.7 转录组测序技术 |
1.8 存在的问题及研究内容、目的与意义 |
第2章 SCN抗性筛选及rhg1和Rhg4位点的单倍型分析 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 植物材料 |
2.1.2 线虫接种 |
2.1.3 大豆品种SCN抗性表型鉴定 |
2.1.4 抗病及感病大豆品种根部染色 |
2.1.5 DNA提取 |
2.1.6 标记分析、聚合酶链式反应及测序 |
2.1.7 RNA提取和实时荧光定量PCR |
2.1.8 基因组DNA的拷贝数变异检测 |
2.1.9 统计分析 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 大豆对SCN4号及5号生理小种的表型鉴定 |
2.2.2 抗病及感病大豆品种SCN发育形态的比较 |
2.2.3 GmSHMT08和GmSNAP18基因位点单倍型鉴定 |
2.2.4 利用DNA标记对大豆品种进行基因分型 |
2.2.5 rhg1位点的拷贝数变异 |
2.2.6 GmSNAP18和GmSHMT08基因的表达分析 |
2.3 讨论 |
第3章 利用Graded Pool-seq和靶向测序基因型检测技术定位大豆F_2群体对SCN的抗性QTL |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 植物材料 |
3.1.2 线虫培养及F_2的表型鉴定 |
3.1.3 Graded Pool-seq测序 |
3.1.4 靶向测序基因型检测(GBTS) |
3.1.5 QTL定位 |
3.1.6 统计分析 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 F_2及其亲本对SCN4的表型鉴定 |
3.2.2 Gradseq Pool-seq测序 |
3.2.3 Graded Pool-seq关联分析 |
3.2.4 利用GBTS技术检测SNPs及其分析 |
3.2.5 通过非参数和MQM方法定位与SCN FI相关的SNPs |
3.2.6 Graded Pool-seq结合GBTS定位SNPs及基因预测 |
3.2.7 通过非参数和MQM方法分析与SCNCGR相关的SNPs的累加效应 |
3.3 讨论 |
第4章 利用感病亲本构建的染色体代换系群体定位SCN超亲抗性QTL |
4.1 植物材料 |
4.1.1 植物材料 |
4.1.2 线虫培养及CSSLs的表型鉴定 |
4.1.3 通过全基因组重新测序进行高通量基因分型 |
4.1.4 QTL定位 |
4.1.5 统计分析 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 CSSLs及其亲本对SCN的表型评估 |
4.2.2 单倍型模块的构建及QTL定位 |
4.2.3 根重与线虫繁殖相关的QTL定位 |
4.3 讨论 |
第5章 利用全长RNA-seq分析大豆与Heterodera glycines互作 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 植物材料、线虫培养及样品准备 |
5.1.2 RNA提取及全长转录组测序 |
5.1.3 实时定量PCR验证 |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 大豆根部线虫发育形态 |
5.2.2 测序数据及其质量控制 |
5.2.3 转录本的去冗余及功能注释 |
5.2.4 与参考转录组序列比对 |
5.2.5 转录本及基因表达分布 |
5.2.6 lncRNA、可变剪接与转录因子统计 |
5.2.7 差异表达基因筛选 |
5.2.8 差异表达基因分析 |
5.3 讨论 |
第6章 结论与展望 |
6.1 研究结论 |
6.2 研究展望 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
(6)中国野生山葡萄抗灰霉病转录因子VaERF99功能及其作用机理(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 引言 |
1.2 葡萄灰霉病的研究进展 |
1.2.1 葡萄灰霉病的危害 |
1.2.2 葡萄灰霉病的防治 |
1.2.3 葡萄抗灰霉病分子机制的研究 |
1.3 植物激素与抗病 |
1.4 ERF转录因子的研究进展 |
1.4.1 ERF转录因子的分类及结构特点 |
1.4.2 ERF转录因子抗病功能研究进展 |
1.4.3 ERF转录因子抗病调控机理研究 |
1.5 本研究的目的及意义 |
第二章 中国野生山葡萄VaERF99 基因的克隆及功能研究 |
2.1 材料 |
2.1.1 植物材料 |
2.1.2 供试菌株及载体 |
2.1.3 供试试剂 |
2.1.4 仪器设备 |
2.1.5 培养基及试剂配制 |
2.1.6 引物 |
2.2 方法 |
2.2.1 葡萄材料的处理 |
2.2.2 葡萄RNA的提取以及实时荧光定量PCR |
2.2.3 VaERF99 克隆及过表达载体的构建 |
2.2.4 VaERF99 编辑载体的构建 |
2.2.5 VaERF99 生物信息学分析 |
2.2.6 VaERF99 亚细胞定位分析 |
2.2.7 VaERF99 瞬时转化葡萄叶片 |
2.2.8 Western-blot检测 |
2.2.9 VaERF99 遗传转化无核白葡萄 |
2.2.10 实验数据与统计分析 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 VaERF99 克隆及序列分析 |
2.3.2 葡萄ERF99 的表达分析 |
2.3.3 VaERF99 亚细胞定位 |
2.3.4 VaERF99 过表达载体的构建 |
2.3.5 VaERF99 编辑载体的构建 |
2.3.6 VaERF99 瞬时转化葡萄后的表型分析 |
2.3.7 VaERF99 遗传转化无核白葡萄 |
2.4 讨论 |
第三章 中国野生山葡萄VaERF99 互作蛋白的筛选及验证 |
3.1 材料 |
3.1.1 植物材料 |
3.1.2 供试菌株及载体 |
3.1.3 供试试剂 |
3.1.4 培养基及缓冲液配制 |
3.1.5 引物 |
3.2 方法 |
3.2.1 VaERF99 互作蛋白的筛选及回复验证 |
3.2.2 Split-Luc实验验证蛋白互作 |
3.2.3 蛋白质免疫共沉淀验证 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 VaERF99 诱饵载体的构建 |
3.3.2 VaERF99 诱饵蛋白自激活及自毒性检测 |
3.3.3 VaERF99与VaTLP3 互作回复验证 |
3.3.4 Split-Luc实验验证VaERF99与VaTLP3 互作 |
3.3.5 免疫共沉淀实验验证VaERF99与VaTLP3 互作 |
3.3.6 VaERF99 互作蛋白VaTLP3 的表达分析 |
3.4 讨论 |
第四章 中国野生山葡萄VaERF99 上游调控基因的筛选及验证 |
4.1 材料 |
4.1.1 植物材料 |
4.1.2 供试菌株及载体 |
4.1.3 供试试剂 |
4.1.4 培养基及缓冲液配制 |
4.1.5 引物 |
4.2 方法 |
4.2.1 供试葡萄叶片DNA的提取 |
4.2.2 酵母单杂交筛选互作蛋白 |
4.2.3 双荧光素酶试验验证上游调控 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 VaERF99 启动子的克隆及调控元件分析 |
4.3.2 VaERF99 上游调控基因的筛选 |
4.3.3 VaERF99 启动子与上游筛选基因的回复验证 |
4.3.4 启动子关键作用区域的确定 |
4.3.5 VaERF99 启动子片段与VaERF20 互作双荧光素酶试验验证 |
4.4 讨论 |
第五章 结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
(7)拟南芥zar1的RNA-seq分析及ZAR1的配体筛选(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 研究背景 |
1.1 合子发育 |
1.1.1 双受精 |
1.1.2 胚胎发育 |
1.2 不对称分裂 |
1.2.1 细胞骨架在不对称分裂中的作用 |
1.2.2 合子极性的建立 |
1.2.3 生长素信号的作用 |
1.2.4 钙信号在不对称分裂中发挥作用 |
1.3 LRR RLK类受体蛋白激酶 |
1.4 ZAR1 的研究进展 |
1.5 富含半胱氨酸肽CRPs |
1.6 本研究的目的及意义 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 植物材料 |
2.1.2 菌株 |
2.1.3 质粒载体 |
2.2 试剂及仪器 |
2.2.1 试剂和试剂盒 |
2.2.2 试剂配制 |
2.3 实验方法和步骤 |
2.3.1 植物种子的灭菌以及生长条件 |
2.3.2 植物基因组DNA和总RNA的提取 |
2.3.3 载体的构建 |
2.3.4 酵母双杂交 |
2.3.5 RNA-seq生物信息学分析过程 |
2.3.6 多序列比对和系统进化树构建 |
3 结果分析 |
3.1 RNA-seq分析 |
3.1.1 数据的收集和处理 |
3.1.2 与参考基因组的比对和组装 |
3.1.3 基因定量分析结果 |
3.1.4 差异基因分析 |
3.1.5 差异基因的功能富集分析 |
3.1.6 WGCNA |
3.1.7 讨论 |
3.2 ZAR1 的配体鉴定 |
3.2.1 ZI1 |
3.2.2 ZI2 |
3.2.3 ZI3 |
3.2.4 ZI4 |
3.2.5 ZI5 |
3.2.6 ZI6 |
3.2.7 ZI7 |
3.2.8 ZI8 |
3.2.9 ZI9 |
3.2.10 ZI10 |
3.2.11 ZI11 |
3.2.12 ZI12 |
3.2.13 ZI13 |
3.2.14 ZI14 |
3.2.15 ZI15 |
4 结论与讨论 |
5 创新点 |
6 研究展望 |
参考文献 |
攻读学位期间公开发表的论文目录 |
引物附表 |
致谢 |
(8)棉花腺体形成相关基因GhERF105的功能分析(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
第一章 文献综述 |
1.1 棉花色素腺体和棉酚 |
1.1.1 棉花色素腺体性状 |
1.1.2 棉酚的结构和特性 |
1.1.3 色素腺体与棉酚的关系 |
1.1.4 色素腺体研究的重要性 |
1.2 色素腺体性状控制基因的遗传研究 |
1.2.1 棉花色素腺体相关控制基因遗传研究 |
1.2.2 棉花色素腺体相关复等位基因的遗传研究 |
1.3 显性无腺体基因GL_2~e的研究 |
1.3.1 GL_2~e基因的发现与遗传分析 |
1.3.2 GL_2~e基因的研究进展 |
1.4 棉花色素腺体发育相关基因的克隆 |
1.5 棉酚生物合成途径及相关基因的研究 |
1.5.1 棉酚的生物合成途径 |
1.5.2 棉酚生物合成途径中有关基因的研究 |
1.6 低酚棉育种进展 |
1.7 植物ERF转录因子研究进展 |
1.7.1 ERF转录因子 |
1.7.2 ERF类转录因子转录激活活性的调控 |
1.7.3 ERF转录因子在非生物胁迫中的作用 |
1.7.4 ERF转录因子在生物胁迫中的作用 |
1.8 VIGS技术在验证基因功能中的应用 |
1.8.1 VIGS技术简介 |
1.8.2 VIGS技术在棉花基因功能研究中的应用 |
1.9 DUALhunter酵母双杂交系统简介及应用 |
1.10 双分子荧光互补技术(BiFC)及其应用 |
1.11 研究目的与意义 |
第二章 腺体形成相关的候选基因GhERF105克隆与功能分析 |
2.1 实验仪器、材料与方法 |
2.1.1 实验仪器 |
2.1.2 实验材料 |
2.1.3 菌株和表达载体 |
2.1.4 实验试剂 |
2.1.5 棉苗的培育 |
2.1.6 棉花总RNA提取 |
2.1.7 cDNA合成及质量验证 |
2.1.8 质粒大量提取 |
2.1.9 PCR产物扩增 |
2.1.10 PCR产物纯化 |
2.1.11 热击法转化大肠杆菌感受态 |
2.1.12 菌液PCR |
2.1.13 测序与序列比对 |
2.1.14 重组质粒小量提取 |
2.1.15 冻融法转化农杆菌感受态 |
2.1.16 棉酚含量测定 |
2.1.17 荧光定量PCR结果统计分析 |
2.1.18 候选基因生物信息学分析 |
2.1.19 qRT-PCR验证候选基因在有腺体和无腺体材料中的差异性表达 |
2.1.20 病毒诱导的基因沉默(VIGS)筛选棉花腺体相关基因 |
2.1.21 陆地棉GhERF105基因组织特异性分析 |
2.1.22 陆地棉GhERF105基因在有腺体和无腺体序列分析 |
2.1.23 候选基因GhERF105启动子的作用元件分析 |
2.1.24 陆地棉GhERF105基因启动子在有腺体和无腺体序列分析 |
2.1.25 陆地棉GhERF105基因诱导表达分析 |
2.1.26 陆地棉GhERF105蛋白亚细胞定位 |
2.1.27 酵母双杂交 |
2.1.28 互作蛋白亚细胞定位 |
2.1.29 双分子荧光互补(BiFC)验证 |
2.1.30 酵母单杂交 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 RNA纯度检测 |
2.2.2 陆地棉GhERF105基因克隆 |
2.2.3 陆地棉GhERF105生物信息学分析 |
2.2.4 陆地棉候选基因GhERF105在不同棉花品种叶茎差异性表达 |
2.2.5 利用VIGS方法获得棉花沉默候选基因植株 |
2.2.6 陆地棉GhERF105基因组织特异性分析 |
2.2.7 陆地棉GhERF105基因诱导表达分析 |
2.2.8 陆地棉GhERF105蛋白的亚细胞定位 |
2.2.9 陆地棉GhERF105基因在不同棉花材料叶片中序列分析 |
2.2.10 陆地棉GhERF105基因启动子作用元件分析、序列和活性分析 |
2.2.11 陆地棉Gh ERF105 基因与Gh MYC2-like的关系 |
2.2.12 酵母双杂交筛选互作蛋白 |
2.2.13 互作蛋白的亚细胞定位 |
2.2.14 Bi FC验证Gh ERF105 与互作蛋白的互作 |
2.2.15 Gh ERF105与GCC-box及 DRE顺式作用元件结合和转录激活活性的分析 |
2.3 讨论 |
2.3.1 陆地棉GhERF105蛋白序列分析 |
2.3.2 陆地棉GhERF105基因表达分析 |
2.3.3 陆地棉GhERF105基因与腺体形成或棉酚代谢的关系 |
2.3.4 陆地棉GhERF105基因启动子序列分析 |
2.3.5 陆地棉GhERF105基因诱导表达分析 |
2.3.6 陆地棉GhERF105基因其他功能分析 |
2.3.7 陆地棉GhERF105基因作用机制推测 |
2.4 结论 |
第三章 后续研究与展望 |
参考文献 |
附录A 引物序列汇表 |
附录B 实验试剂和培养基配制 |
附录C 候选基因的功能注释 |
附录D 互作蛋白的功能注释 |
附录E 作者介绍 |
致谢 |
(9)棉花转录因子GhWRKY21调控植株抗旱和耐高温的分子机理研究(论文提纲范文)
符号说明 |
中文摘要 |
Abstract |
1 前言 |
1.1 WRKY转录因子的结构特征与分类 |
1.2 WRKY转录因子的功能 |
1.2.1 WRKY转录因子参与调节植物生长发育 |
1.2.2 WRKY转录因子参与植物对生物逆境的响应 |
1.2.3 WRKY转录因子参与植物对非生物逆境的响应 |
1.3 WRKY转录因子调控应激反应的分子机制 |
1.3.1 WRKY转录因子的自调控和交叉调控作用 |
1.3.2 WRKY转录因子在蛋白水平的调控作用 |
1.3.3 WRKY转录因子参与植物激素信号转导 |
1.4 WRKY转录因子在棉花中的研究进展 |
1.5 本研究的目的和意义 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 植物材料 |
2.1.2 菌株与质粒 |
2.1.3 酶及生化试剂 |
2.1.4 引物 |
2.1.5 培养基配置 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 植物材料的培养条件及处理方法 |
2.2.2 植物RNA提取 |
2.2.3 RNA样品中基因组DNA的去除 |
2.2.4 实时荧光定量PCR检测 |
2.2.5 目的基因序列的扩增 |
2.2.6 PCR产物的回收 |
2.2.7 目的片段与载体的连接 |
2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 |
2.2.9 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
2.2.10 重组质粒酶切验证 |
2.2.11 农杆菌感受态细胞的制备与转化 |
2.2.12 农杆菌介导的植物瞬时侵染 |
2.2.13 VIGS技术沉默棉花植株 |
2.2.14 农杆菌介导的叶盘转化法 |
2.2.15 转基因烟草萌发率和根长实验 |
2.2.16 二氨基苯丙胺组织化学染色法 |
2.2.17 氮蓝四?组织化学染色法 |
2.2.18 测定叶片失水率 |
2.2.19 测定叶片保卫细胞气孔开度 |
2.2.20 酵母感受态细胞的制备 |
2.2.21 酵母单杂交实验 |
2.2.22 重组蛋白的原核表达及纯化 |
2.2.23 Westernblot检测目的基因 |
2.2.24 EMSA试验 |
3 结果与分析 |
3.1 棉花GhWRKY21 基因的分离及生物信息学分析 |
3.1.1 GhWRKY21 基因的分离及序列分析 |
3.1.2 GhWRKY21 生物信息学分析 |
3.2 棉花GhWRKY21 基因的亚细胞定位 |
3.3 棉花GhWRKY21 基因的表达模式分析 |
3.4 棉花中GhWRKY21 基因的功能分析 |
3.4.1 GhWRKY21 基因沉默棉花的获得与鉴定 |
3.4.2 GhWRKY21 基因沉默棉花的抗旱性分析 |
3.4.3 GhWRKY21 基因沉默棉花的耐热性分析 |
3.5 超表达GhWRKY21 转基因烟草的抗旱性分析 |
3.5.1 GhWRKY21 超表达转基因烟草的获得与鉴定 |
3.5.2 GhWRKY21 超表达植株对干旱胁迫的敏感性增加 |
3.6 GhWRKY21 通过影响ABA信号通路调节植物的抗旱性 |
3.6.1 GhWRKY21 介导的棉花抗旱性与ABA有关 |
3.6.2 棉花中A族PP2Cs的鉴定及启动子分析 |
3.6.3 GhWRKY21 通过结合GhHAB的启动子来调控其表达 |
3.6.4 GhHAB负调控棉花对干旱胁迫的耐受性 |
3.7 超表达GhWRKY21 转基因烟草的耐热性分析 |
3.7.1 GhWRKY21 超表达植株对热胁迫的敏感性增加 |
3.7.2 GhWRKY21 超表达植株中热应激响应相关基因的表达水平 |
4 讨论 |
4.1 GhWRKY21 是典型的Ⅱd族 WRKY转录因子 |
4.2 棉花中GhWRKY21 通过调节GhHAB的表达来调控ABA介导的耐旱性 |
4.3 GhWRKY21 负调控植物的热应激反应 |
5 结论 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表论文情况 |
(10)Gh4CL30和GhWRKY70D13在棉花抗黄萎病中的功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩略表 |
引言 |
第一章 文献综述 |
1.1 植物抗病机制研究进展 |
1.2 棉花黄萎病及其防治 |
1.2.1 棉花黄萎病及其危害 |
1.2.2 棉花黄萎病菌的侵染过程和致病机理 |
1.2.3 棉花黄萎病防治技术 |
1.3 棉花黄萎病抗性机制研究 |
1.3.1 次生代谢产物在棉花与黄萎病菌互作中的作用 |
1.3.2 植物激素在棉花与黄萎病菌互作中的作用 |
第二章 棉花黄萎病菌胁迫后的转录组学研究 |
2.1 材料 |
2.1.1 植物材料、菌株 |
2.1.2 实验试剂 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 棉花材料的准备 |
2.2.2 黄萎病病原菌的活化、培养和接种 |
2.2.3 棉花材料抗病性鉴定 |
2.2.4 黄萎病菌恢复培养和真菌相对含量检测 |
2.2.5 棉花总RNA的提取和质量检测 |
2.2.6 cDNA文库构建及转录组测序 |
2.2.7 数据质量评估与差异表达基因筛选 |
2.2.8 差异表达基因GO和 KEGG富集分析 |
2.2.9 加权基因共表达网络分析(WGCNA) |
2.2.10 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证转录组测序结果 |
2.3 结果分析 |
2.3.1 陆地棉品种SD和 JM抗病性鉴定 |
2.3.2 测序数据质量评估及可靠性验证 |
2.3.3 接种黄萎病菌前SD和 JM之间差异表达基因挖掘 |
2.3.4 SD和 JM之间差异基因WGCNA分析 |
2.3.5 SD和 JM之间的差异基因参与棉花响应黄萎病菌侵染 |
2.3.6 SD和 JM接种黄萎病菌后差异基因筛选 |
2.3.7 SD和 JM接种黄萎病菌后差异基因GO和 KEGG富集分析 |
2.3.8 木质素合成相关基因参与棉花响应黄萎病菌侵染 |
2.3.9 激素与棉花抗病反应 |
2.4 讨论 |
2.4.1 棉花响应黄萎病菌侵染转录组学研究 |
2.4.2 木质素参与棉花抗黄萎病反应 |
2.4.3 植物激素参与棉花抗黄萎病反应 |
第三章 Gh4CL30 在棉花抗黄萎病中的功能验证 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 植物材料、菌株及载体 |
3.1.2 实验试剂 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 棉花材料的准备 |
3.2.2 棉花黄萎病菌的活化、培养和接种 |
3.2.3 RNA提取、反转录以及qRT-PCR分析 |
3.2.4 病毒诱导的基因沉默(VIGS) |
3.2.5 棉花接种黄萎病菌后发病率及病情指数统计 |
3.2.6 黄萎病菌恢复培养和真菌相对含量检测 |
3.2.7 木质素组织化学染色 |
3.2.8 棉花总木质素和木质素单体含量测定 |
3.2.9 棉花内源SA和 JA含量测定 |
3.2.10 棉花总黄酮含量测定 |
3.2.11 棉花茎秆甲醇提取物的抑菌性鉴定 |
3.2.12 HPLC-MS/MS法测量棉花咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸和香豆酸含量 |
3.2.13 咖啡酸和阿魏酸抑菌性测定 |
3.3 结果分析 |
3.3.1 Gh4CL30 组织表达与黄萎病菌诱导表达模式分析 |
3.3.2 沉默Gh4CL30 对棉花黄萎病抗性的影响 |
3.3.3 Gh4CL30 沉默植株中木质素含量变化 |
3.3.4 Gh4CL30 沉默植株中木质素单体含量变化 |
3.3.5 沉默Gh4CL30对SA和 JA信号通路的影响 |
3.3.6 Gh4CL30 沉默对黄酮的生物合成的影响 |
3.3.7 Gh4CL30 沉默植株茎秆中出现红棕色物质积累 |
3.3.8 Gh4CL30 沉默植株抗病性增强与咖啡酸和阿魏酸的关系 |
3.4 讨论 |
3.4.1 沉默Gh4CL30 改变木质素的生物合成 |
3.4.2 Gh4CL30 沉默抑制SA和 JA信号通路和黄酮生物合成 |
3.4.3 咖啡酸和阿魏酸的积累有助于提高Gh4CL30 沉默植株抗病性 |
第四章 GhWRKY70D13 在棉花抗黄萎病中的功能分析 |
4.1 材料 |
4.1.1 植物材料、菌株及载体 |
4.1.2 实验试剂 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 棉花GhWRKY70 家族基因的查找和生物信息学分析 |
4.2.2 棉花GhWRKY70 家族基因启动子顺式作用原件分析 |
4.2.3 棉花材料的准备 |
4.2.4 黄萎病病原菌菌的活化、培养和接种 |
4.2.5 水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利处理棉花 |
4.2.6 RNA提取、反转录以及qRT-PCR分析 |
4.2.7 病毒诱导的基因沉默(VIGS) |
4.2.8 棉花接种黄萎病菌后发病率及病情指数统计 |
4.2.9 黄萎病菌恢复培养和真菌相对含量检测 |
4.2.10 GhWRKY70A05a、GhWRKY70A06及Gh WRKY70D13 基因的克隆 |
4.2.11 GhWRKY70D13 基因干扰表达载体构建及棉花遗传转化 |
4.2.12 黄萎病菌处理后GhWRKY70D13 干扰材料的转录组分析 |
4.2.13 差异表达基因KEGG富集分析 |
4.2.14 HPLC-MS/MS法测量棉花内源1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、SA和 JA含量 |
4.3 结果分析 |
4.3.1 陆地棉GhWRKY70 家族基因的全基因鉴定 |
4.3.2 陆地棉GhWRKY70 家族基因结构域和进化分析 |
4.3.3 陆地棉GhWRKY70 家族基因启动子顺式作用原件分析 |
4.3.4 陆地棉GhWRKY70 家族基因的组织表达模式分析 |
4.3.5 陆地棉GhWRKY70 家族基因在不同激素处理表达模式分析 |
4.3.6 陆地棉GhWRKY70 家族在黄萎病菌接种后表达模式分析 |
4.3.7 TRV:GhWRKY70D13 干涉植株提高棉花对黄萎病的抗性 |
4.3.8 GhWRKY70D13-RNAi转基因棉花抗病性鉴定 |
4.3.9 抑制表达GhWRKY70D13 后的转录组分析 |
4.3.10 抑制GhWRKY70D13 表达激活ET信号通路 |
4.3.11 抑制GhWRKY70D13 表达对JA信号通路的影响 |
4.3.12 抑制GhWRKY70D13 表达降低SA的生物合成 |
4.4 讨论 |
第五章 全文结论、创新点与展望 |
5.1 全文结论 |
5.2 全文创新点 |
5.3 展望 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简介 |
导师评阅表 |
四、Cloning of Two Genes Related to Plant Defense Response ofSea Island Cotton (Gossypium barbaden.se L. )(论文参考文献)
- [1]海岛棉GhDAHP同源基因的克隆及抗黄萎病功能初步验证[D]. 郭楠楠. 新疆农业大学, 2021
- [2]GhMAPKKK3、GhF-box及三个GhBsr-d1基因在棉花抗黄萎病中的功能鉴定[D]. 王倩. 新疆农业大学, 2021
- [3]大丽轮枝菌致病因子VdEPG1的致病机制研究[D]. 刘世超. 华中农业大学, 2021
- [4]全基因组关联分析解析棉花代谢产物的遗传和生化基础[D]. 斯欢. 华中农业大学, 2021
- [5]大豆对孢囊线虫Heterodera glycines的分子遗传抗性机制研究[D]. 黄铭慧. 中国科学院大学(中国科学院东北地理与农业生态研究所), 2021
- [6]中国野生山葡萄抗灰霉病转录因子VaERF99功能及其作用机理[D]. 柴生樾. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [7]拟南芥zar1的RNA-seq分析及ZAR1的配体筛选[D]. 孙梦坤. 烟台大学, 2021(11)
- [8]棉花腺体形成相关基因GhERF105的功能分析[D]. 吴朝峰. 华中农业大学, 2020(05)
- [9]棉花转录因子GhWRKY21调控植株抗旱和耐高温的分子机理研究[D]. 王佳玉. 山东农业大学, 2020(01)
- [10]Gh4CL30和GhWRKY70D13在棉花抗黄萎病中的功能研究[D]. 熊显鹏. 石河子大学, 2020(08)