水峥嵘（湖南省肿瘤医院410013）
摘要：目的分析抑制人凋亡抑制蛋白—2（hIAP-2）在MCF-7乳腺癌细胞中的表达增强抗肿瘤药物的抑癌作用。方法选择患有MCF-7乳腺癌患者1例，按照培养方式不同，划分为单纯加药细胞、联合质粒细胞、空白对照组，检测不同浓度药物下处理的细胞凋亡率。结果单纯加药组、联合质粒细胞组、空白对照组不同浓度顺铂、秋水仙素、5-氟尿嘧啶处理下细胞凋亡率组间对比差异有统计学意义（P＜0.05），单纯加药组、联合质粒细胞组随着顺铂浓度的上升，凋亡率呈上升趋势，联合质粒细胞组顺铂、5-氟尿嘧啶处理凋亡率高于单纯加药细胞组，联合质粒细胞组秋水仙素凋亡率低于单纯加药细胞组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论抑制人凋亡抑制蛋白—2在MCF-7乳腺癌细胞中的表达能够增强顺铂、5-氟尿嘧啶的抑癌作用。
关键词：乳腺癌；人凋亡抑制蛋白-2；抗肿瘤药物；抑癌作用
Inhibitionofapoptosissuppressorprotein-2expressioninMcF-7breastcancercellsenhancestheantitumoreffectofanti-tumordrugs
ShuiZhengrong（Hunancancerhospital410013）
[abstract]objective：toanalyzetheinhibitoryeffectofinhibitingapoptosis-2（hiap-2）inMcF-7breastcancercellstoenhancetheanti-tumoreffectofanti-tumordrugs.Methods：1casewithMCF-7breastcancerpatients，accordingtothetraininginadifferentway，pidedintopuredosingcells，combinedqualitativegranulocyte，blankcontrolgroup，testunderdifferentconcentrationsofdrugtreatmentofcellapoptosisrate.Results：simpledosing，combinedqualitativegranulocytegroup，blankcontrolgroup，differentconcentrationsofcisplatin，colchicine，5-fluorouraciltreatmentundertheapoptosisrateofcontrastdifferencesbetweengroupswasstatisticallysignificant（P<0.05），puredosinggroup，thejointqualitativegranulocytegroupalongwiththerisingoftheconcentrationsofcisplatin，apoptosisrateisontherise，thejointqualitativegranulocytegroupofcisplatin，5-fluorouraciltreatmentapoptosisrateishigherthanpuredosingcellgroup，thejointqualitygranulocytegroupofcolchicineapoptosisratelowerthanpuredosingcellgroup，thedifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05）.Conclusion：inhibitingapoptosisinhibitingprotein-2expressioninMcF-7breastcancercellscanenhancetheanti-cancereffectofcisplatinand5-fluorouracil.
[keywords]breastcancer；Humanapoptoticinhibitoryprotein-2；Antitumordrugs；Tumorsuppressorrole
乳腺癌是我国增长速度最快的一类肿瘤，约99%患者为女性，已成为女性三大恶性肿瘤之一，在沿海经济发达地区，发病率达到接近发达国家地区[1]。用药是治疗乳腺癌的主要方法，但不同患者对不同药物的敏感性不尽相同，部分患者甚至可出现耐药。乳腺癌的耐药的分子机制，涉及多基因、多步骤综合作用的结果，抗凋亡基因表达增高和凋亡基因表达降低耐药的重要机制之一[2]。人凋亡抑制蛋白-2表达肿瘤细胞发生、增殖、转移、凋亡关系密切，大量研究证实当hIAP-2表达后，其能够抑制肿瘤细胞的凋亡，增强肿瘤的耐药性[3]。本次研究尝试分析抑制hIAP-2表达，是否能够增强抗肿瘤药物的抑癌作用。
1材料与方法
1.1试验材料
细胞株，来源于2017年1月收治确诊的MCF-7乳腺癌患者，雌激素受体ER阳性，女性，32岁，2016年12月月底检出乳腺癌，术后切除诊断为MCF-7乳腺癌。
1.2主要仪器与试剂
使用的材料和试剂：mU6pro空载体是来自美国研究所惠赠，哺乳类传染系统在PROMAGE公司购买，使用的广谱抗肿瘤药物由南宁学子医化研究中心提供。试剂包括胰蛋白酶、PBS缓冲液、小牛血清、胎牛血清、乙醇、琼脂糖、TRIzoltotalRNA提取试剂、小鼠抗人-hIAP-2单克隆抗体、小鼠抗GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记鼠的二抗、ECL监测试剂盒、AV-PI凋亡检测试剂盒、MTT检测试剂盒等。仪器包括高速离心机，酶标仪，超低温冰箱，移液器，荧光定量PCR仪等。
1.3方法
1.3.1分组
分为三组：单纯加药细胞组（即mU6pro与对应抑制剂）、联合质粒细胞组（mU6pro、对应抑制剂以及二甲基亚砜（DMSO））、mU6pro空载体空白对照组。
1.3.2观察指标及检测方法
（1）细胞培养和转移：取RPMI-1640型完全培养基以0.5U/mL的胰岛素（上海第一生化药业有限公司，国药准字H31020519）、100U/mL青霉素（辽宁科泰生物基因制药股份有限公司，国药准字H21021677）、小牛血清（15%）和100ug/mL的链霉素（山东鲁抗医药股份有限公司，国药准字H37020187）配比成营养液后，将从患者中穿刺取出的癌细胞放置其中进行培养。生长环境：37℃，CO2含量5%，孵箱中恒温恒湿培养。培养结果显示，细胞在光镜下贴壁生长，细胞状态良好，不规则形状较少，细胞密度在70%以上，满足后续试验的要求。根据哺乳类传染系统试剂盒中所含说明书选择磷酸钙法对其进行转染。转染比例为pEGFP-N1：mU6/hIAP-2=1：3，转染率要求超过80%，mU6pro空载体即空白对照。（2）增敏性实验：按照操作对样本进行展开后，选择一定浓度梯度的顺铂（德州德药制药有限公司，国药准字H20023236）、秋水仙素碱（广州绿滋食品有限公司生产，批准文号：440113011846）、5-氟尿嘧啶（齐鲁制药（海南）有限公司，国药准字H20084571）分别加入其中展开培养，条件同上。细胞凋亡检测：每隔24h换新鲜的培养基，48h后，吸出离心管中的培养基，PBS洗涤贴壁细胞1次，胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，转移到离心管，800g离心5min，弃上清，加入1×Bindingbuffer稀释细胞密度为1×106/ml，去100μl细胞悬液至1.5mlEP管中，按照试剂说明步骤5μlAnnexinV和1μlPI（100μg/ml），室温避光孵育15min，加入1×Bindingbuffer轻柔混匀，冰上放置30min，采用流式细胞仪检测，分析细胞凋亡情况。
1.4观察指标
单纯加药细胞组、联合质粒细胞组、mU6pro空载体空白对照组，不同浓度顺铂、秋水仙素家、5-氟尿嘧啶下凋亡率。
1.5统计学处理
采用SPSS20.0软件进行数学分析，细胞凋亡率服从正态分布，采用（均值±标准差）（x±s）表示，组间比较采用t检验，不同浓度同组内比较采用F检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1三组在不同浓度顺铂下细胞凋亡率
单纯加药组、联合质粒细胞组、空白对照组不同浓度顺铂下细胞凋亡率组间对比差异有统计学意义（P＜0.05），单纯加药组、联合质粒细胞组随着顺铂浓度的上升，凋亡率呈上升趋势，联合质粒细胞组凋亡率高于单纯加药细胞组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。
3讨论
本次研究显示，在通过抑制抑制人凋亡抑制蛋白—2在MCF-7乳腺癌细胞中的表达后，能够抗肿瘤药物的抑癌作用，特别是顺铂、5-氟尿嘧啶处理后，联合质粒细胞组的细胞凋亡率显著上升，高于单纯加药组。需要注意的是，在较小剂量的5-氟尿嘧啶、顺铂处理下，MCF-7乳腺癌细胞凋亡率反而呈下降趋势，即出现刺激性增殖，随着剂量浓度的上升，细胞凋亡明显上升，细胞本身对细胞毒性药物的敏感性呈剂量依赖[4]。在抑制人凋亡抑制蛋白—2表达后，能够增强各个剂量中顺铂、5-氟尿嘧啶处理中的MCF-7乳腺癌细胞对药物的敏感性，提示通过抑制该基因的表达，能够增强药物作用后肿瘤细胞凋亡效应。
有报道显示，shRNA-hIAP2增强能够调节鼻咽癌对放疗的敏感性，在诱导细胞凋亡中发挥重要作用[5]。但hIAP2表达所起作用的具体机制尚不完全清楚，可能与相关信号通路的异常激活有关。分子检测技术、基因检测技术的发展，可尝试在临床开展，进行靶向药物耐药靶点分析，指导用药。
参考文献
[1]中国抗癌协会乳腺癌专业委员会.中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2015版）[J].中国癌症杂志，2015，25（9）：692-754.
[2]孟琳，王天一，李晓曦，马萍.MicroRNA在乳腺癌中作用的研究进展[J].现代肿瘤医学，2015，23（09）：1302-1306.
[3]李丹，郭丽英.microRNA与乳腺癌浸润转移关系的研究进展[J].中国普外基础与临床杂志，2014，21（05）：654-657.
[4]辛建会，张雪鹏.MCF-7乳腺癌细胞的国内研究进展[J].中国民族民间医药，2014，23（08）：47-48.
[5]袁媛，蒋文娟，姜武忠.shRNA-hIAP2增强CNE-1鼻咽癌细胞对放射敏感性的实验研究[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2013，19（05）：393-398.
作者简介：水峥嵘女，1982.3河北保定，主治医师，乳腺外科，本科，乳腺肿瘤专业