导读:本文包含了胚胎干细胞建系论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:猪,体外培养,胚胎干细胞
胚胎干细胞建系论文文献综述
余卓然,张雪,高放,安铁洙,孔庆然[1]（2019）在《猪胚胎体外培养体系优化对胚胎干细胞建系的影响》一文中研究指出为提高体外胚胎发育质量和体外胚胎建立胚胎干细胞系效率,研究以N2B27为基础的干细胞培养体系对猪孤雌胚胎体外发育和后续建立胚胎干细胞系的影响。设立3个试验组:PZM-3组,孤雌激活的胚胎全程PZM-3培养体系中培养; N2B27组,孤雌激活的胚胎全程N2B27培养体系中培养; PZM-3-N2B27组,孤雌胚胎在PZM-3培养体系中培养至桑葚胚后更换为N2B27培养体系。结果表明,N2B27组无法获得囊胚,但PZM-3-N2B27组胚胎可正常发育至囊胚,囊胚率未显着提高,但囊胚细胞总数显着提高(P<0.05)。PZM-3-N2B27组获得孤雌囊胚用于建立猪胚胎干细胞系,显着提高原代克隆形成率(P<0.05),获得猪胚胎干细胞系呈碱性磷酸酶阳性,表达Oct4、Sox2和Nanog等多能性基因。结果表明,采用PZM-3和N2B27培养体系结合获得的猪孤雌囊胚利于猪胚胎干细胞系建立。研究为进一步优化猪胚胎体外培养体系,获得初始态胚胎干细胞系提供参考。(本文来源于《东北农业大学学报》期刊2019年09期）
徐晓荣[2]（2019）在《R6-feeder在胚胎干细胞建系中的应用》一文中研究指出小鼠ES细胞是生物医学研究中不可或缺的工具,为了更高效、拿到更好的干细胞系,研究者一直在不断尝试利用不同的培养体系,建立比囊胚更早期的胚胎干细胞系。目前已有研究从桑椹胚甚至最早从4-cell时期建立胚胎干细胞系,并且可以表达更强的全能性。但是目前没有任何关于2-cell时期ES细胞系建立的报道。Xist基因已经被证实为XCI的关键调控因子,Xist基因的高表达与X染色体失活呈正相关。研究表明利用结合于Xist第一内含子区的抑制性Tale-dTF R6显着提高了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)向iPSC的诱导效率以及SCNT的效率和多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的表达,基于这些优良特性,猜想R6-feeder是否可以建立比4-cell时期更早且全能性更高的ES细胞系。本研究利用Xist Tale抑制性转录因子R6转染MEF制成R6-MEF细胞系,筛选出高表达多能基因的R6-MEF细胞系,运用EDU test和Trypan Blue的双重验证,寻找将R6-MEF制成R6-feeder的最适MMC浓度,之后成功制备R6-feeder。以传统STO-feeder为对照,在R6-feeder上用2i/LIF培养液建立高效率的E3.5-derived ES干细胞并进行初步多能性鉴定,之后成功建立E1.5-derived干细胞系并进行初步多能性鉴定,最后对E1.5-derived干细胞系进行扩展多能性鉴定。此外,首次成功建立了E1.5-derived细胞系,并从分子水平、蛋白水平和发育潜能等方面检测所获得细胞系的多能性。1.利用R6-feeder建立E3.5-derived和E1.5-derived的胚胎干细胞系通过筛选将R6-MEF细胞系制成R6-feeder。在R6-feeder上建立E3.5-derived和E1.5-derived细胞系,通过观察其细胞形态学变化、检测细胞生长、染色体核型、免疫荧光、实时荧光定量PCR和体内畸胎瘤分化能力等一系列实验结果,发现利用R6-feeder建立的E1.5-derived胚胎干细胞系(2-cell全胚胎细胞系简称为E1.5-derived ES,2-cell单卵裂球胚胎细胞系简称为E1.5-derived sES)细胞系除具有传统ESCs(STO-feeder建立)的基本特性外,在多能性鉴定方面还具有略优于传统小鼠ESCs的特征。2.获得细胞系的多能性检测与传统STO-feeder建立的ESCs相比,R6-feeder建立的E3.5-derived和E1.5-derived细胞系在一些方面显示出基本的特性:干细胞系克隆形态都呈典型的干细胞形态;碱性磷酸酶染色都呈强阳性;细胞染色体数目未发生异常;多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Klf4的表达水平相似;与传统的STO-feeder建立的ESCs相比,E1.5-derived ES细胞系增殖速度更快;E1.5-derived ES细胞系分化基因c-Myc、Sox17、Sox17的表达低于ESCs;E1.5-derived sES细胞系特异性高表达2-cell基因Tcstv1、Tcstv3。3.获得细胞系的发育潜能检测畸胎瘤实验结果显示,E1.5-derived sES细胞具备分化形成叁胚层组织的能力;通过制备嵌合体,证明E1.5-derived sES细胞系到囊胚时能贡献ICM和TE部分。更重要的是与ESCs和EPSC细胞系相比,E1.5-derived sES细胞对E6.5嵌合体的胚胎外胚层、胚外外胚层、外胎盘锥和原始内胚层都有贡献。综上所述,与传统STO-feeder建立的ESCs和8-cell胚胎来源的EPSC细胞系相比,本实验新型R6-feeder高效建立E3.5-derived细胞系,且首次成功建立E1.5-derived ES和sES细胞系。在基因表达水平和发育潜能等方面,E1.5-derived ES和sES细胞系具有高发育潜能,是一种比4-cell更早的ES细胞系。但是关于R6-feeder建立早期胚胎干细胞的机理仍需进一步研究。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2019-06-05）
陈枕枕,牛昱宇[3]（2018）在《人胚胎干细胞建系的研究进展》一文中研究指出人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)具有自我更新和分化的潜能,自成功建立细胞系以来学者们一直在改进建系方法和培养体系,如避免异源污染(基质胶的研究、无饲养层和无血清培养体系的研究等)以建立优质的细胞系,获得更高全能性的干细胞(采用不同小分子的组合培养干细胞或建系),这些研究已经取得巨大成果。现通过胚胎来源、内细胞团(inner cell mass,ICM)分离、h ESCs培养体系3个方面综述h ESCs建系的研究进展。(本文来源于《生命科学》期刊2018年08期）
陈俏羽[4]（2018）在《猪胚胎干细胞不同状态表达差异比较及microRNA对诱导多能干细胞建系作用》一文中研究指出胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)以及诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)是细胞治疗、药物筛选、胚胎发育机制研究和构建体外疾病模型的重要工具。目前关于干细胞的研究主要集中在小鼠这一动物模型上。由于小鼠寿命短且其与人类生理功能及结构差异较大,使得小鼠在临床上的应用有限。与小鼠相比,猪是很好的人类疾病模型,特别是在异种移植医学、免疫及代谢疾病研究等相关方面。至今符合小鼠ESCs特点的猪ESCs系尚未成功建立,并且没有统一的猪特异性多能性分子标志用于鉴定不同状态的猪多能性干细胞。本研究将猪类na?ve状态的胚胎干细胞转化为primed状态,通过比较两者之间多能性分子标志的差异,初步确定了用于鉴定na?ve猪胚胎干细胞的特异性多能性分子标志;对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪囊胚内细胞团及猪胎儿成纤维细胞叁者之间进行micro RNA(mi RNA)表达谱的分析比较,构建特定mi RNA表达载体,研究其对猪i PSCs建系的影响。以上的研究使我们进一步了解猪多能性相关分子标记,并为mi RNA对猪i PSCs的影响提供了新的见解。目的获得能鉴别猪ESCs的多能性状态的分子标志;研究特定mi RNA对猪i PSCs细胞系建立的影响。方法1.将本实验室在LIF/3i(MEF)条件下建立的猪类na?ve ESCs(以下简称n ESCs)正常传代后,使用LIF/3i培养液培养两天后,更换为FGF/Activin(STO)条件继续培养2-3天;采用机械切割法,对形态扁平、呈片状的猪primed ESCs(reversed primed ESCs,rp ESCs)进行传代;将rp ESCs重新在LIF/3i(MEF)条件下培养,观察是否能重新获得类na?ve的状态;对第5代rp ESCs进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色,传代至第10代时对rp ESCs进行核型鉴定;通过RT-PCR检测不同状态的猪ESCs表达FGF/Activin及LIF/STAT3信号通路相关基因的情况;类胚体形成实验、叁胚层相关基因表达检测及免疫荧光染色鉴定rp ESCs的体外分化潜能;荧光实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)检测细胞谱系及多能性相关因子在转化过程中的表达改变;利用Western blot及免疫荧光染色进一步检测n ESCs和rp ESCs中OCT4,LIN-28,CDX2,SOX17,c-MYC,NANOG,KLF4,Nr0B1,TBX3在蛋白质水平上的表达情况。2.对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)及猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)叁者之间进行mi RNA表达谱的分析比较,筛选出在猪内细胞团细胞中高表达的mi RNA-205。通过PCR扩增mi RNA-205前体序列,并将其克隆于基础表达载体p CAGDNA3-h Fat1,构建过表达载体p CAG-mi R205。用脂质体将该载体转染到经基因修饰的猪胎儿成纤维细胞中(含有鼠源干细胞多能性转录因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)。经干细胞培养液诱导培养建立猪i PSCs,利用实时QPCR检测转染前后细胞内的mi RNA-205的表达情况,比较分析mi RNA-205对猪诱导性多能干细胞的建系效率的影响。结果1.nESCs可在FGF/Activin(STO)条件下转化为rp ESCs。当rp ESCs重新在LIF/3i(MEF)条件下培养时,可重新获得类na?ve的状态的细胞,我们将其称为转化得到的na?ve ESCs(reversed na?ve ESCs,rn ESCs);rp ESCs的核型正常(38XX),AP染色呈阳性,表明rp ESCs具有自我更新能力;类胚体分化实验显示rp ESCs表达叁胚层相关基因,具有体外分化能力;RT-PCR分析信号通路,结果显示primed胚胎干细胞依赖于FGF/Activin信号通路,虽然rp ESCs表达LIF/STAT3信号通路的相关因子,但Western-blot检测STAT3磷酸化结果显示,第6代的rp ESCs几乎不表达磷酸化的SATA3,说明rp ESCs不再依赖于LIF/STAT3信号通路;而n ESCs则明显依赖于LIF/STAT3信号通路。QPCR检测两种状态细胞之间多能性因子的表达差异表明,CDX2,SOX17,EOMES,FGF5,FOXA,PITX2在n ESCs中很少表达甚至不表达,而primed细胞中这些基因呈较高表达水平;LIN28,OCT4,SOX2,NOG,DPPA5,Nr0B1,KLF4在primed细胞中表达下降;NANOG,TBX3,c-MYC在primed细胞中表达上升;通过Western-blot和免疫荧光染色进一步在蛋白水平上检测两种状态下细胞中CDX2,SOX17,OCT4,NANOG,c-MYC,KLF4,Nr0B1,LIN28,TBX3的表达差异,发现与QPCR所得结果一致。2.成功构建了p CAG-mi R205过表达载体;相较于未转染细胞,转染该载体的细胞mi RNA-205表达量显着升高(P<0.01);利用干细胞培养液诱导培养细胞,转染后的i PSCs克隆长出率高于未转染细胞组。结论1.本实验室建系的猪类naive ESCs可实现与primed状态细胞的互相转化,且n ESCs依赖于LIF/STAT3信号通路而rp ESCs依赖于FGF/Activin信号通路;2.通过比较两种状态细胞之间多能性分子标志的表达差异,我们初步确定了几个标准化标记来区分primed和na?ve这两种状态。细胞谱系相关基因如CDX2,SOX17,EOMES,FOXA2,以及多能性基因FGF5和PITX的表达可鉴定猪ESCs的primed状态;传统的小鼠ESCs的na?ve标记物(TBX3,Nanog和c-MYC)也可作为猪ESCs的primed状态的分子标志。此外,多能性基因(Lin28,Oct4,SOX2,NOG,DPPA5,Nr0B1,KLF4)可以作为猪ESCs的na?ve状态的分子标志。3.已构建的mi RNA-205过表达载体将有助于在后续研究中建立稳定表达mi RNA205的细胞系,为进一步深入研究mi RNA205在干细胞重编程和多能性维持中的作用机制奠定基础。(本文来源于《南京医科大学》期刊2018-05-01）
靳木子,吴慧,邰大鹏,杨文亮,仓明[5]（2015）在《蒙古绵羊体外受精胚胎干细胞建系培养研究》一文中研究指出蒙古绵羊体外受精的胚胎干细胞(SESC)一直未能成功建系,确定一种适合的培养体系及传代方法对其成功建系有着重要的意义。本研究将获得的体外受精胚胎直接培养,以胎鼠成纤维细胞为饲养层,运用机械传代法传代,采用培养液Ⅰ和培养液Ⅱ两种不同的培养液培养绵羊胚胎干细胞。采用形态鉴定、碱性磷酸酶染色、类胚体形成,免疫荧光染色等方法对获得的SESC进行干细胞检测。结果显示:培养液Ⅰ和培养液Ⅱ都可用于SESC的培养,而无血清的培养液Ⅱ更利于细胞的生长;机械传代法适合于SESC的传代培养;冷冻复苏之后经过形态鉴定、碱性磷酸酶染色、体外分化以及免疫荧光染色,均与胚胎干细胞的形态特征一致。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2015年11期）
冯涛[6]（2015）在《猪诱导多能性干细胞及胚胎干细胞建系相关研究》一文中研究指出猪因为与人更为相似的身体结构和生理特征而成为新兴的模式动物,关于其胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)的研究自然也受到人们的广泛关注。但是目前为止,猪ES细胞尚未建系成功,iPS细胞也没有生殖嵌合的报道。这严重制约了药物筛选、细胞治疗、器官移植和大动物基因修饰方面的研究。为了获得高质量的猪iPS细胞,本研究分别采用piggyBac(PB)转座子质粒和episome非整合质粒诱导得到了猪iPS细胞。所得iPS细胞碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AP)染色呈阳性,多能性因子的免疫荧光染色呈阳性,核型正确,能够在SCID鼠体内形成有叁胚层分化的畸胎瘤。进一步对所得细胞进行体外嵌合能力的检测时发现,利用胚胎注射和囊胚聚合两种方法均能成功获得有iPS细胞参与发育的嵌合囊胚。嵌合囊胚可以在代孕母猪体内发育到期生成仔猪,但是在这些仔猪体内均检测不到iPS细胞来源的成分。本研究通过进一步分析发现,内源多能性基因不激活导致了体细胞重编程不完全,这是猪iPS细胞生成嵌合体失败的主要原因之一。为了简单方便地观察内源OCT4的启动情况,本研究分别构建了 PB系统和非PB系统的猪源、鼠源和人源的OCT4-EGFP报告系统。结果发现,猪源的OCT4-EGFP报告系统在体细胞克隆(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎中能够被很好地被激活,但是在iPS细胞中不能被激活。这进一步证实了猪iPS细胞内源多能性基因沉默的推测;同时发现,曲古柳菌素A(Trichostatin A,TSA)能够解除再克隆胚胎中OCT4-EGFP沉默的现象。为了更加全面地研究多能性基因在猪早期胚胎中的表达,本研究分别构建了猪源的SOX2-tdTomato和REX1-tdTomato报告系统,结果发现SOX2在早期胚胎中能被很好地激活,而同时期的REX1表达水平相对较低。另外,为了找到阻碍猪体细胞重编程的关键基因,本研究引入了基于CRISPR/Cas文库的筛选系统,并且发现它在猪iPS细胞中能很好地发挥作用,这为解决目前猪iPS细胞研究的困境提供了强大的支持。猪ES细胞建系一直未能成功,并且导致失败的最主要原因是什么,并不确定。为了探索不同因素对猪ES细胞体外建系的影响,本研究分别使用了猪孤雌激活(Parthenogenetic activation,PA)胚胎、体外受精(In vitro fertilization,IVF)胚胎、带有荧光报告系统的SCNT胚胎和体内胚胎为原始材料,向培养基中分别加入碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)、胎猪血清、猪卵泡液以及小分子抑制剂PD0325901和CHIR99021(2i)等尝试分离培养猪ES细胞。结果发现,多能性基因OCT4和SOX2在类ES细胞克隆生成之初就已经被沉默;bFGF和胎猪血清利于类ES细胞克隆的快速增长,而猪卵泡液和2i/LIF却抑制类ES细胞克隆的生成。虽然在含bFGF和胎猪血清的培养基中类ES细胞克隆能够快速生长,但是在传代之后这些细胞均发生分化或者死亡。综上所述,PB质粒和episome质粒诱导得到的猪iPS细胞能在体外参与形成嵌合囊胚,但是都不能形成嵌合个体。利用OCT4-EGFP报告系统,本研究发现猪iPS细胞中内源多能性基因未被激活。另外,本研究分别用了不同的培养条件,从不同来源的猪囊胚中分离培养得到了类ES细胞克隆,结果发现,OCT4和SOX2在类ES细胞克隆生长之初就已经被沉默,bFGF和胎猪血清对类ES细胞的生长有利。这些结果为大动物中多能性细胞建系奠定了坚实的基础。(本文来源于《中国农业大学》期刊2015-10-01）
李鑫[7]（2015）在《大鼠单倍体胚胎干细胞建系及功能研究》一文中研究指出大鼠是最早被应用于科学研究的哺乳类模式动物。虽然小鼠作为模式动物广泛应用于科学研究,但和小鼠相比,大鼠体现出了很多优势,比如大鼠体型比小鼠大很多,便于进行各种外科手术,并且与小鼠相比在生理调节和药理反应等方面与人类的更相近,因此大鼠已经被广泛地应用于生理学、免疫学、移植医学、神经科学、癌症学、遗传学和老化等领域。1981年第一株小鼠胚胎干细胞系被成功建立,其能够在体外无限扩增,且具有发育的多能性,因此在基因功能研究、基因修饰以及细胞治疗和临床等方面都有广阔的应用前景。第一只克隆小鼠由日本科学家Wakayama首次成功完成,虽然之后大鼠克隆也由周琪通过调整卵母细胞激活周期而完成,但一直以来大鼠胚胎干细胞没有被成功建立,因此在构建基因敲除动物模型领域,大鼠的研究远远落后于小鼠。2008年,华人科学家应其龙等利用无血清培养体系,即基础培养液N2B27添加GSK3及ERK/MEK信号通路的抑制因子(2i:CHIR99021,PD0325901)及大鼠Lif,首次建立了具有种系嵌合能力的真正的大鼠胚胎干细胞系,从而解决了限制大鼠转基因模型研究的瓶颈。但是相比较于小鼠,获得转基因大鼠以及基因敲除大鼠仍然花费更大,这严重影响了大鼠模型在生物研究及医疗领域的应用。2010年,研究人员建立了斑马鱼的单倍体胚胎干细胞系,这些单倍体干细胞只有一套染色体,因此通过正反向遗传筛选技术能够快速地分析哺乳动物发育和一些性状基因调控网络,还可以建立产生纯合子基因突变文库作为发现基因-性状的资源。2011年,第一株哺乳动物孤雌单倍体胚胎干细胞被建立,使得哺乳动物单倍体胚胎干细胞成为了年度研究的热点。2012年,周琪研究组和李劲松研究组同时建立了孤雄单倍体胚胎干细胞系,证明了这些细胞仍然具有雄性配子功能——这些细胞能够代替精子,注入卵母细胞后可以产生健康的小鼠。本研究探索了获得单倍体孤雄及孤雌胚胎的“精子克隆法”和“受精卵去原核法”两种方法,比较了单倍体胚胎体内和体外的发育效率,获得了大鼠单倍体囊胚继而在优化后的5%knock-out serum replacement的N2B27并添加抑制因子PD0325901,CHIR99021,A8301,Y27632以及Lif的培养体系中完成了大鼠孤雄及孤雌单倍体胚胎干细胞的建系。从克隆形态上看,大鼠单倍体胚胎细胞系具有典型的大鼠胚胎干细胞形态,呈克隆状,贴壁或悬浮生长。通过流式细胞分选技术对大鼠单倍体胚胎细胞系根据DNA含量进行分选,通过数次分选可以将单倍体细胞富集。大鼠单倍体胚胎细胞系具有大鼠单倍体(21条)核型,体外培养超过30代的大鼠单倍体胚胎细胞系进行aCGH实验后发现,体外经过反复传代后的大鼠单倍体胚胎干细胞系具有完整的大鼠单倍基因组,并且没有明显的拷贝数变异。从多能性角度分析,大鼠单倍体胚胎细胞系具有较高的多能性水平,主要体现在:碱性磷酸酶染色结果呈阳性;经RT-PCR,免疫荧光染色和western blot等方法检测,我们所建立的大鼠单倍体胚胎干细胞系表达Oct4,Nanog,Sox2和SSEA-1等细胞多能性marker;能够维持自我更新且具有无限传代能力;在随机分化条件下可以在体外分化成拟胚体(Embryoid bodys,EBs);体内囊胚嵌合实验可以得到高比例嵌合的二倍体嵌合体大鼠,且大部分嵌合体大鼠可以存活至成年,将获得的雌性嵌合体大鼠与SD品系雄性大鼠交配后能够得到种系嵌合的子代大鼠,这首次证明了单X染色体的单倍体孤雄胚胎干细胞具有种系传递能力;利用大鼠单倍体胚胎干细胞的单倍性以及其可自我更新和复制的干细胞特点用PB转座酶系统进行随机位点插入和基因捕获操作获得了突变库;利用cas9系统对大鼠单倍体细胞进行了定点的基因编辑,为研究各种基因功能提供了资源;利用大鼠孤雄单倍体的精子来源特点进行了胞浆内单倍体注射(ICAI),最终我们获得了到期可育的转基因大鼠。综上所述,本研究所建立的大鼠孤雌及孤雄单倍体胚胎干细胞系具有种系嵌合能力及配子功能,是世界上首次得到的大鼠单倍体胚胎干细胞系。该研究成果对于模式动物大鼠的应用有重要意义,最终为人类疾病研究和药物研发提供更为便捷的模型。(本文来源于《东北农业大学》期刊2015-06-01）
李妍[8]（2015）在《猪类胚胎干细胞建系过程中对培养液的优化研究》一文中研究指出胚胎干细胞是研究基因功能、建立疾病模型和促进再生医学领域发展的一种重要工具。猪由于生理结构与人类相似,长期以来被人们作为疾病模型广泛的应用于临床研究中,因此猪胚胎干细胞的建立对于生物医学领域有着重大意义。不仅如此,猪作为农业经济动物,其胚胎干细胞的建立可以在基因工程水平上来帮助改善猪的健康水平和生长性状提高经济效益。但在猪胚胎干细胞的研究中,人们始终没有获得一株真正的胚胎干细胞系,同时猪胚胎干细胞所需要的培养条件也不能确定,在2014年我们实验组获得了一株猪类胚胎干细胞系,512506具有一定的干细胞特点,其培养液(MXV培养液),经研究是一组比较适合猪类胚胎干细胞生长的干细胞培养液。但是由于其成分过于复杂,操作性差,并不利于猪胚胎干细胞的进一步研究。在猪胚胎干细胞培养条件的探索中,人们依据大鼠胚胎干细胞的成功,2i体系也得到了广泛的应用。但却存在着相反的两种作用效果。本实验针对MXV培养液的缺点,我们对其进行了优化,找出MXV培养液中必需成分。并探索了2i对猪胚胎干细胞建系的影响。首先是针对MXV培养液的五种主要成分bFGF,hLif,BSA,N2B27,KOSR,进行逐一简化,分别通过半量降低这五种成分的培养液和全量降低这五种成分的培养液分别培养512506细胞系最终可以去掉MXV培养液中的不重要成分。得到成分简化的MXV培养液,随后,我们对MXV培养液中基础培养液进行优化,X中的基础培养液为叁种基础培养液Neurobasal,KO-DMEM,和DMEM/F1的混合物。我们用单一的培养液成分来替代这个混合体系。最后可以获得简化的MXV培养液。为了进一步确定简化的MXV培养液是否可以完全替代MXV培养液,本实验探索了简化MXV培养液对猪类胚胎干细胞建系效率的影响。同时针对CHIR99021,PD0325901简称2i对于有猪多能性细胞研究中相对立的研究结果,我们探究了2i对猪胚胎干细胞建系效率的影响。经过上述内容研究的结果显示:KOSR可以从MXV培养液中去除获得MXV-K培养液,不添加KOSR的优化MXV培养液可以使512506的细胞状态更好,细胞排列紧密,脂滴消失,形态更接近人胚胎干细胞系。其他叁组主要成分虽然没有bFGF对MXV培养液那么大的影响,但去除后,512506细胞系状态仍然会变差。所以在五种成分中我们只能将KOSR去除.而针对基础培养液的简化,最终可获得两组单一的基础培养液KO-DMEM和DMEM/F12的优化MXV培养液,可以完全代替MXV培养液培养512506细胞系,获得的512506P5K和512506P5D在形态上比512506细胞系更接近人胚胎干细胞系,多能性状态与512506细胞系相似。在建系效率的研究中,实验结果显示发育至6d的体外受精胚胎在KO-DMEM培养液中贴壁率和原代克隆形成率显着高于DMEM/F12培养液,添加2i后两种培养液中的胚胎贴壁率和原代克隆形成率均下降。在KO-DMEM培养液中可获得稳定传代的细胞系,细胞形态与512506细胞系不同,无脂滴,细胞排列紧密,形态更类似与人胚胎干细胞系。细胞系呈碱性磷酸酶阳性,核型正常,表达Oct4、Sox2和Nanog,不表达Cdx2。细胞系可成功进行转基因操作。结果表明以KO-DMEM为基础培养液的优化MXV培养液体系可以获得猪类胚胎干细胞,2i不利于胚胎贴壁和原代克隆形成。该研究为猪胚胎干细胞建系培养体系选择与推断猪胚胎干细胞多能性细胞信号调控通路提供了重要的实验依据。(本文来源于《东北农业大学》期刊2015-06-01）
李妍,薛冰华,张雪,赫义龙,伟人悦[9]（2015）在《基础培养液和小分子对猪类胚胎干细胞建系效率的影响》一文中研究指出猪是人类疾病模型的重要候选动物之一,建立真正的猪胚胎干细胞系将极大地推动该领域的进展。培养液和细胞信号通路是目前限制猪胚胎干细胞系建立的两个主要影响因素。该研究探索了基础培养液(KO-DMEM和DMEM/F12)和小分子(PD0325901和CHIR99021,简称2i)对猪类胚胎干细胞建系效率的影响。实验结果显示,发育至6 d的体外受精胚胎在KO-DMEM培养液中贴壁率和原代克隆形成率显着高于DMEM/F12培养液;添加2i后,两种培养液中的胚胎贴壁率和原代克隆形成率均下降。在KO-DMEM培养液中可获得稳定传代的细胞系,获得的细胞系呈碱性磷酸酶阳性,核型正常,表达Oct4、Sox2和Nanog,不表达Cdx2。细胞系可成功进行转基因操作。结果表明,以KO-DMEM为基础培养液的培养体系可以获得猪类胚胎干细胞,2i不利于胚胎贴壁和原代克隆形成。该研究为猪胚胎干细胞建系培养体系的选择及推断猪胚胎干细胞多能性细胞信号调控通路提供了重要的实验依据。(本文来源于《中国细胞生物学学报》期刊2015年05期）
蒋伟民,黄元华,马燕琳[10]（2014）在《人胚胎干细胞建株与维持培养条件的优化》一文中研究指出人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESCs)是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞,它具有无限增殖、自我更新和全能分化的特性。无论在体内还是体外环境,人胚胎干细胞都能分化为机体几乎所有类型的细胞。基于其全能分化性,胚胎干细胞成为治疗各种退行性疾病的理想细胞来源。然而,在目前培养条件下所建立的胚胎干细胞株,仍然存在动物源性物质潜在污染的问题。因此,更优化的建株及培养条件十分重要。(本文来源于《生命科学研究》期刊2014年04期）
胚胎干细胞建系论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
小鼠ES细胞是生物医学研究中不可或缺的工具,为了更高效、拿到更好的干细胞系,研究者一直在不断尝试利用不同的培养体系,建立比囊胚更早期的胚胎干细胞系。目前已有研究从桑椹胚甚至最早从4-cell时期建立胚胎干细胞系,并且可以表达更强的全能性。但是目前没有任何关于2-cell时期ES细胞系建立的报道。Xist基因已经被证实为XCI的关键调控因子,Xist基因的高表达与X染色体失活呈正相关。研究表明利用结合于Xist第一内含子区的抑制性Tale-dTF R6显着提高了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)向iPSC的诱导效率以及SCNT的效率和多能性基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的表达,基于这些优良特性,猜想R6-feeder是否可以建立比4-cell时期更早且全能性更高的ES细胞系。本研究利用Xist Tale抑制性转录因子R6转染MEF制成R6-MEF细胞系,筛选出高表达多能基因的R6-MEF细胞系,运用EDU test和Trypan Blue的双重验证,寻找将R6-MEF制成R6-feeder的最适MMC浓度,之后成功制备R6-feeder。以传统STO-feeder为对照,在R6-feeder上用2i/LIF培养液建立高效率的E3.5-derived ES干细胞并进行初步多能性鉴定,之后成功建立E1.5-derived干细胞系并进行初步多能性鉴定,最后对E1.5-derived干细胞系进行扩展多能性鉴定。此外,首次成功建立了E1.5-derived细胞系,并从分子水平、蛋白水平和发育潜能等方面检测所获得细胞系的多能性。1.利用R6-feeder建立E3.5-derived和E1.5-derived的胚胎干细胞系通过筛选将R6-MEF细胞系制成R6-feeder。在R6-feeder上建立E3.5-derived和E1.5-derived细胞系,通过观察其细胞形态学变化、检测细胞生长、染色体核型、免疫荧光、实时荧光定量PCR和体内畸胎瘤分化能力等一系列实验结果,发现利用R6-feeder建立的E1.5-derived胚胎干细胞系(2-cell全胚胎细胞系简称为E1.5-derived ES,2-cell单卵裂球胚胎细胞系简称为E1.5-derived sES)细胞系除具有传统ESCs(STO-feeder建立)的基本特性外,在多能性鉴定方面还具有略优于传统小鼠ESCs的特征。2.获得细胞系的多能性检测与传统STO-feeder建立的ESCs相比,R6-feeder建立的E3.5-derived和E1.5-derived细胞系在一些方面显示出基本的特性:干细胞系克隆形态都呈典型的干细胞形态;碱性磷酸酶染色都呈强阳性;细胞染色体数目未发生异常;多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Klf4的表达水平相似;与传统的STO-feeder建立的ESCs相比,E1.5-derived ES细胞系增殖速度更快;E1.5-derived ES细胞系分化基因c-Myc、Sox17、Sox17的表达低于ESCs;E1.5-derived sES细胞系特异性高表达2-cell基因Tcstv1、Tcstv3。3.获得细胞系的发育潜能检测畸胎瘤实验结果显示,E1.5-derived sES细胞具备分化形成叁胚层组织的能力;通过制备嵌合体,证明E1.5-derived sES细胞系到囊胚时能贡献ICM和TE部分。更重要的是与ESCs和EPSC细胞系相比,E1.5-derived sES细胞对E6.5嵌合体的胚胎外胚层、胚外外胚层、外胎盘锥和原始内胚层都有贡献。综上所述,与传统STO-feeder建立的ESCs和8-cell胚胎来源的EPSC细胞系相比,本实验新型R6-feeder高效建立E3.5-derived细胞系,且首次成功建立E1.5-derived ES和sES细胞系。在基因表达水平和发育潜能等方面,E1.5-derived ES和sES细胞系具有高发育潜能,是一种比4-cell更早的ES细胞系。但是关于R6-feeder建立早期胚胎干细胞的机理仍需进一步研究。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
胚胎干细胞建系论文参考文献
[1].余卓然,张雪,高放,安铁洙,孔庆然.猪胚胎体外培养体系优化对胚胎干细胞建系的影响[J].东北农业大学学报.2019
[2].徐晓荣.R6-feeder在胚胎干细胞建系中的应用[D].内蒙古大学.2019
[3].陈枕枕,牛昱宇.人胚胎干细胞建系的研究进展[J].生命科学.2018
[4].陈俏羽.猪胚胎干细胞不同状态表达差异比较及microRNA对诱导多能干细胞建系作用[D].南京医科大学.2018
[5].靳木子,吴慧,邰大鹏,杨文亮,仓明.蒙古绵羊体外受精胚胎干细胞建系培养研究[J].畜牧与兽医.2015
[6].冯涛.猪诱导多能性干细胞及胚胎干细胞建系相关研究[D].中国农业大学.2015
[7].李鑫.大鼠单倍体胚胎干细胞建系及功能研究[D].东北农业大学.2015
[8].李妍.猪类胚胎干细胞建系过程中对培养液的优化研究[D].东北农业大学.2015
[9].李妍,薛冰华,张雪,赫义龙,伟人悦.基础培养液和小分子对猪类胚胎干细胞建系效率的影响[J].中国细胞生物学学报.2015
[10].蒋伟民,黄元华,马燕琳.人胚胎干细胞建株与维持培养条件的优化[J].生命科学研究.2014