本文主要研究内容
作者何剑,廖红伍,阳学风（2019）在《ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体的构建》一文中研究指出：目的设计并构建针对ECEL1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(shRNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo。利用Age I和EcoR I双酶线性化GV115载体。把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定。再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用"HIV-1p24抗原ELISA法"测定样品滴度。选取检测合格的慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,荧光观察感染率。并使用Real-time PCR法及Western blot检测人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲减后mRNA和蛋白质的表达量。2组间比较采用两独立样本t检验。结果 (1)根据ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆。经过质粒抽提,转染以及浓缩纯化后,成功构建ECEL1基因RNAi慢病毒。物理检测与无菌检测合格。(2)通过HIV-1 p24抗原ELISA法测定ECEL1基因RNAi慢病毒样品病毒滴,测定样品病毒滴度为3×108TU/ml;表明已成功构建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干扰慢病毒。(3)用ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),荧光观察结果显示细胞感染效率达到80%,细胞状态稳定;使用Real-time PCR的方法及Western blot检测实验组人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因在mRNA和蛋白质水平的表达量受到抑制(P值均<0. 05),敲减效率达到70. 5%。结论成功构建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体并获得稳定高滴度的病毒样品,并获得稳定的ECEL1基因敲减的人肝癌细胞(BEL-7404)。
Abstract
mu de she ji bing gou jian zhen dui ECEL1ji yin de RNAgan rao man bing du zai ti 。fang fa yi zhao ECEL1ji yin wei mo ban ,she ji RNAgan rao ba dian ,gen ju shua ding de ba dian xu lie ,she ji duan fa ga RNA(shRNA)gan rao xu lie ,zai liang duan tian jia xiang ying de xian zhi xing nei qie mei mei qie wei dian ,ge cheng chan lian DNA oligo,tui huo huan chong ye zhong pei dui xing cheng shuang lian DNA oligo。li yong Age Ihe EcoR Ishuang mei xian xing hua GV115zai ti 。ba zai ti he DNA oligoxiang lian jie ,ji lian jie chan wu zhuai hua da chang gan jun gan shou tai xi bao ,jing PCRkuo zeng bing ce xu jian ding 。zai tong guo zhi li chou di ,zhuai ran ,nong su yu chun hua hou huo de chong zu de ECEL1ji yin RNAiman bing du ,yong "HIV-1p24kang yuan ELISAfa "ce ding yang pin di du 。shua qu jian ce ge ge de man bing du gan ran ren gan ai xi bao (BEL-7404),bing she zhi dui zhao zu ,ying guang guan cha gan ran lv 。bing shi yong Real-time PCRfa ji Western blotjian ce ren gan ai xi bao (BEL-7404)zhong ECEL1ji yin qiao jian hou mRNAhe dan bai zhi de biao da liang 。2zu jian bi jiao cai yong liang du li yang ben tjian yan 。jie guo (1)gen ju ECEL1ji yin mo ban she ji hou ,shua ding psc48784pian duan zuo wei RNAgan rao ba dian ,zhi bei shuang lian DNA oligo,PCRjian ding yang xing chong zu zi bing ce xu ,yan zheng psc48784wei zheng que de ke long 。jing guo zhi li chou di ,zhuai ran yi ji nong su chun hua hou ,cheng gong gou jian ECEL1ji yin RNAiman bing du 。wu li jian ce yu mo jun jian ce ge ge 。(2)tong guo HIV-1 p24kang yuan ELISAfa ce ding ECEL1ji yin RNAiman bing du yang pin bing du di ,ce ding yang pin bing du di du wei 3×108TU/ml;biao ming yi cheng gong gou jian gao di du ju ge ge de ECEL1ji yin RNAgan rao man bing du 。(3)yong ECEL1ji yin RNAiman bing du gan ran ren gan ai xi bao (BEL-7404),ying guang guan cha jie guo xian shi xi bao gan ran xiao lv da dao 80%,xi bao zhuang tai wen ding ;shi yong Real-time PCRde fang fa ji Western blotjian ce shi yan zu ren gan ai xi bao (BEL-7404)zhong ECEL1ji yin zai mRNAhe dan bai zhi shui ping de biao da liang shou dao yi zhi (Pzhi jun <0. 05),qiao jian xiao lv da dao 70. 5%。jie lun cheng gong gou jian ECEL1ji yin PSCSI-GFPman bing du zai ti bing huo de wen ding gao di du de bing du yang pin ,bing huo de wen ding de ECEL1ji yin qiao jian de ren gan ai xi bao (BEL-7404)。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自临床肝胆病杂志的何剑,廖红伍,阳学风，发表于刊物临床肝胆病杂志2019年06期论文，是一篇关于基因论文,慢病毒载体论文,肝肿瘤论文,临床肝胆病杂志2019年06期论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自临床肝胆病杂志2019年06期论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：基因论文; 慢病毒载体论文; 肝肿瘤论文; 临床肝胆病杂志2019年06期论文;