导读:本文包含了马慢病毒受体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:SLC,CCR7,骨髓,间充质干细胞,过表达CCR7基因
马慢病毒受体论文文献综述
王志红,陈为民,林芸,尚晋,魏天南[1]（2019）在《慢病毒载体介导CC趋化因子受体7基因过表达可促进大鼠骨髓间充质干细胞归巢》一文中研究指出背景:研究发现,骨髓间充质干细胞特异性地表达CC趋化因子受体7(CC chemokine receptor,CCR7),与其配体次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC)相互作用,有助于骨髓间充质干细胞归巢到损伤部位。目的:探讨CCR7基因过表达对大鼠骨髓间充质干细胞体内外归巢特性的影响。方法:利用慢病毒载体介导大鼠骨髓间充质干细胞过表达CCR7基因,建立过表达CCR7的骨髓间充质干细胞。通过Transwell实验体外检测趋化因子SLC对过表达CCR7的骨髓间充质干细胞体外定向迁移的影响。将SD大鼠分为4组,每组动物10只:①对照组:未接受全身照射大鼠作为对照组;②照射组:大鼠接受全身照射(60Co单次全身照射,总剂量为7.5 Gy,照射量率为0.75 Gy/min),输注生理盐水1 mL;③BMSCs-GFP组:大鼠经全身照射后,输注GFP标记的骨髓间充质干细胞悬液1 mL (含细胞5×105个);④CCR7-BMSCs-GFP组:大鼠经全身照射后,输注携带GFP和CCR7基因的骨髓间充质干细胞1 mL (含细胞5×105个)。移植24 h后取大鼠脾脏做冰冻切片,荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞归巢情况,流式细胞技术检测骨髓间充质干细胞在脾脏的归巢率。ELISA方法检测照射后大鼠外周血中SLC水平。结果与结论:①Transwell实验结果表明,过表达CCR7可促进骨髓间充质干细胞向趋化因子SLC迁移募集;②冰冻切片结果显示,过表达CCR7可明显提高骨髓间充质干细胞归巢至损伤脾脏的效率;③流式细胞术测定过表达CCR7的骨髓间充质干细胞归巢至脾脏数量明显高于BMSCs-GFP组(P <0.05);④ELISA结果显示,照射24 h后大鼠外周血中SLC水平明显升高;⑤结果表明,CCR7及其配体SLC对骨髓间充质干细胞的归巢有促进作用。(本文来源于《中国组织工程研究》期刊2019年25期）
朱伦井,贝朝涌,段江涛,彭称飞,马跃刚[2]（2019）在《脂质体和慢病毒介导P75神经生长因子受体及神经生长因子转染骨髓间充质干细胞的效果比较》一文中研究指出背景:P75神经生长因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75~(NTR))在不同细胞中可以介导截然不同的信号通路,但是在骨髓间充质干细胞中所传导的调节作用还尚未研究;脂质体和慢病毒介导单基因转染细胞技术已趋向成熟,但是其介导双基因转染的差异比较还未见报道。目的:构建大鼠P75~(NTR)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的过表达质粒及慢病毒载体,比较脂质体和慢病毒介导2种基因转染骨髓间充质干细胞的效果和实用性,以便于今后根据不同实验要求选择实验最优方案。方法:设计大鼠P75~(NTR)及NGF的基因引物,提取基因组DNA进行PCR扩增、与质粒载体重组构建表达增强绿色荧光的GV358-P75~(NTR)、表达增强红色荧光的GV492-NGF过表达质粒,转染293T细胞,加入慢病毒载体超速离心,收集目的基因过表达慢病毒,测定病毒样品滴度;选取体外培养的大鼠原代骨髓间充质干细胞,一组用脂质体Lipo3000共转染质粒GV358-P75~(NTR)、GV492-NGF,另一组用慢病毒共感染,同时设置阴性对照组和空白对照组,对转染后的骨髓间充质干细胞常规培养,第3,5,7,9,12天用荧光显微镜观察红绿荧光的表达,Westernblot检测P75~(NTR)及NGF蛋白表达,对转染后培养至7d的骨髓间充质干细胞进行消化传代培养,培养第3,5,7,9,12天用荧光显微镜观察红绿荧光的表达以及Western blot检测P75~(NTR)、NGF蛋白的表达。结果与结论:①构建的GV358-P75~(NTR)、GV492-NGF过表达质粒及慢病毒符合实验设计;②显微镜视野中红绿色荧光的丰度:脂质体共转染组先增加后降低,慢病毒共感染组持续增多;各时间点慢病毒组均多于脂质体组;脂质体转染组传代培养细胞的荧光表达相比于未传代前降低,而慢病毒转染组未见明显变化;③各时间点慢病毒感染组的P75~(NTR)及NGF蛋白表达量明显高于脂质体组,目的基因转染组的P75~(NTR)及NGF蛋白表达量均高于阴性对照组及空白对照组,差异有显着性意义(P<0.05);④P75~(NTR)、NGF双基因均能通过脂质体和慢病毒共转染方法在大鼠骨髓间充质干细胞中过表达;脂质体双基因转染操作相对简便,实验设备依赖性低,费用相对低廉,但感染效率明显低于慢病毒,而慢病毒双基因共感染后目的基因存在着持续表达,传代后基因丢失现象不明显。(本文来源于《中国组织工程研究》期刊2019年21期）
苗素云[3]（2019）在《慢病毒载体介导siRNA沉默海马Orexin受体基因对睡眠剥夺大鼠齿状回细胞增殖的影响》一文中研究指出研究背景睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)是指个体由于自身或环境原因无法满足正常睡眠的情况,其睡眠时间未能满足机体为了保持清醒和警觉所需的睡眠时间,表现为睡眠减少或睡眠中断。睡眠剥夺分为选择性睡眠剥夺(selective sleep deprivation,SSD)和完全性睡眠剥夺(total sleep deprivation,TSD),其中前者又分为快速眼球运动(rapid eye movement,REM)期睡眠剥夺和非快速眼球运动(non-rapid eye movement,NREM)期睡眠剥夺。海马结构是边缘-认知系统的一个重要部分,包括海马、齿状回(dentate gyrus,DG)、内嗅皮层、下托和前下托,其基本作用是接受各个皮层来源的感觉信息,并将获得的信息进行编码、短时储存,在认知功能中起重要作用。睡眠对海马依赖性记忆(hippocampus-dependent memory)的形成至关重要,睡眠时短时记忆碎片被再次激活,经分析、组合后,形成长时记忆,但睡眠剥夺可引起人或动物思维紊乱、学习记忆受损。主要机制如下:(1)睡眠剥夺干扰了齿状回长时程增强(long-term potentiation,LTP)的诱导,降低磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)基础水平及其上游调节因子钙/钙调蛋白激酶Ⅳ(calmodulin kinase Ⅳ,CaMK Ⅳ)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在海马齿状回的表达,进而破坏海马突触的可塑性[1-2]。(2)长期睡眠剥夺能引起谷氨酸受体在海马表达减少及功能降低,海马区NMDA/AMPA受体比例下降,还能引起NMDA受体体系结构变化,损害LTP形成[3-4]。(3)睡眠剥夺后腺苷水平升高,激活腺苷A1受体,可逆性抑制刺激海马CA1区的锥体细胞层产生的动作电位,降低兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs)的频率[5],引起海马功能减退和学习记忆损害。另有研究证实,长期睡眠剥夺或睡眠中断能降低海马活性,抑制海马神经元再生,最终损害海马可塑性和功能,出现认知障碍[6]。目前有关睡眠剥夺和由此引起的学习记忆损害有效的解决办法极为有限。有研究报道,咖啡因能预防睡眠剥夺引起的学习记忆损害[71,但该药物干预睡眠剥夺引起记忆损害的作用靶点不明确,而且能引起REM和NREM期睡眠结构变化,长期应用可导致睡眠紊乱,反而加重记忆损害。因此进一步探讨睡眠剥夺与学习记忆损害的分子与细胞机制和特异性靶点,对开发有效药物治疗睡眠剥夺伴随的学习记忆损害具有重要的临床意义。食欲素Orexin又称为下视丘生成素(Hypocretin,Hcrt),在1998年由两个实验室独立发现[8-9],是兴奋性的下丘脑神经肽,有Orexin-A(也称为Hcrt-1)和Orexin-B(也称为Hcrt-2)两种亚型。早期的研究将Orexin系统的作用放在摄食和能量平衡上,随着对其研究的深入,发现Orexin也参与了睡眠-觉醒、体温调节、血压及神经内分泌调节等许多生理功能,后续对睡眠-觉醒、学习记忆方面的研究较多。Orexin通过激活两种G蛋白偶联细胞表面Orexin受体(Orexin receptor,OXR)(又称Hypocretin受体(Hypocretin receptor,Hcrtr))发挥作用,这两种受体为OX1R(Hcrtr 1)和OX2R(Hcrtr 2)。Orexin神经元主要起源于外侧下丘脑,发出兴奋性广泛投射到除小脑之外的中枢神经系统,其中主要投射到促觉醒的细胞群,如结节乳头体核的组织胺能细胞、腹侧被盖区的多巴胺和非多巴胺能细胞、中缝背核的5-羟色胺能细胞、蓝斑的去甲肾上腺素能细胞以及背外侧被盖核/脑桥脚被盖核和基底前脑的胆碱能细胞。在脑内Orexin受体的表达和这些投射脑区一致,但是OX1R和OX2R在脑内的分布不同。OX1R主要分布在蓝斑,而OX2R主要分布在结节乳头体核,此外OX1R和OX2R共同分布在背外侧被盖核/脑桥脚被盖核、中缝背核和腹侧被盖区。近年来研究发现,Orexin-A通过调节乙酰胆碱能、谷氨酸能、肾上腺素能和丫-氨基丁酸(GABA)能系统诱导海马突触可塑性形成,参与海马的学习记忆过程[10--11]。有研究进一步证实,Orexin-A可通过调控细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)激活,促进大鼠海马齿状回颗粒细胞的发生和迁移,调节学习记忆[12]。但Orexin神经元对睡眠剥夺非常敏感,睡眠剥夺后Orexin-A的合成、分泌和受体表达增加[13],而且REM期睡眠剥夺引起的Orexin-A表达增多可导致大鼠双侧海马神经元损害[14]。这些研究提示可以从Orexin-A相关信号通路探讨睡眠剥夺损害学习记忆的分子与细胞机制。若能特异性阻断这一信号通路上的某一靶点,既可调整睡眠,又可改善睡眠剥夺所致的学习记忆损害,因此对这一靶点的探讨具有重要的应用价值。大多数对细胞增殖的研究建立在5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine,BrdU)的应用上,BrdU是一种合成的胸苷尿嘧啶类似物,被分裂细胞摄取,能够在DNA合成的S期代替胸腺嘧啶(T)掺入正在复制的DNA分子中。BrdU作为分裂细胞的标志物,被认为是判断细胞增殖的重要指标。BrdU、微管相关蛋白(doublecortin,DCX)和神经元核抗原(neuronal nuclear antigen,NeuN)等标志能很好地观察到海马齿状回神经干细胞在睡眠剥夺后的动态发育过程,其中,BrdU+细胞被认为是新生细胞,而BrdU+/DCX+双标细胞被认为是新生的正在迁移的不成熟神经元,而BrdU+/NeuN+双标细胞则是新生的成熟神经元。在成年神经再生过程中,DCX表达开始于神经干细胞生成时,在第二周达到高峰,随着成熟神经元标志NeuN的出现开始下调[15-16]。通常选择BrdU注射后的第14天和第28天两个时间点来标记新生细胞的分化和成熟。目的本研究目的在于观察睡眠剥夺后大鼠下丘脑Orexin-A神经元及海马齿状回细胞增殖的变化,以及慢病毒(Lentivirus,LV)载体介导的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默海马Orexin受体基因对睡眠剥夺大鼠海马齿状回细胞增殖的影响,探讨经Orexin-A相关信号通路睡眠剥夺损害学习记忆的分子与细胞机制。方法实验分为两部分:免疫组化部分和免疫荧光部分。免疫组化部分利用免疫组织化学技术观察睡眠剥夺后大鼠下丘脑Orexin-A神经元的变化。免疫荧光部分利用慢病毒载体转染、siRNA基因沉默、免疫荧光双标及共聚焦等技术方法,研究睡眠剥夺对大鼠海马齿状回细胞增殖、分化和成熟的影响。1.免疫组化部分经过筛选后的24只健康成年雄性Wistar大鼠随机分为①空白对照组(cage control group,CC)、②环境对照组(treadmill control group,TC)和③睡眠剥夺组(sleep deprivation group,SD)3个亚组,每个亚组8只。A.采用间歇性跑步机对SD组大鼠进行72 h全睡眠剥夺。跑步机速度设定为10cm/s,运行3 s,停止12 5;TC组运行15min,停止600min,运行和停止循环进行。该设置不限制TC组睡眠,在75min的周期内能有60 min的休息时间,但达到和SD组同等距离的运动量。CC组大鼠放鼠笼正常饲养。B.72 h睡眠剥夺后即刻提取标本,通过免疫组化检测大鼠下丘脑Orexin-A阳性神经元的数量。2.免疫荧光部分经过筛选后的60只健康成年雄性Wistar大鼠随机分为①空白对照组(CC)、②环境对照组(TC)、③睡眠剥夺组(SD)、④空病毒组(Lentivirus group,LV)和⑤慢病毒介导siRNA组(Lentivirus mediated siRNA group,LM)5个亚组,每个亚组12只。A.对LV和LM组大鼠行海马立体定位注射手术。海马坐标为前囟后3.6 mm,中线左右2.0 mm,颅骨表面下3.0 mm。LV组注射1.6 uL空病毒,LM组注射1.6 uL Hcrtr-siRNA(Hcrtr 1-siRNA:Hcrtr 2-siRNA为0.6:1)B.采用间歇性跑步机对SD、LV和LM组大鼠进行72 h全睡眠剥夺,跑步机速度设定为10cm/s,运行3 s,停止12 s;TC组运行15 min,停止60 min,运行和停止循环进行。该设置不限制TC组睡眠,在75min的周期内能有60 min的休息时间,但达到和SD、LV及LM组同等距离的运动量。CC组大鼠放鼠笼正常饲养。C.睡眠剥夺期间各组大鼠给予BrdU 50 mg/kg腹腔注射,每天注射2次,共注射3天。D.在睡眠剥夺结束后第5天、14天和28天提取标本,每个时间点4只,通过免疫荧光技术在3个时间点分别检测海马齿状回区BrdU+、BrdU+/DCX+和BrdU+/NeuN+细胞表达。结果1.免疫组化结果显示:SD组大鼠下丘脑Orexin-A阳性细胞数表达较TC组增多(P<0.05),但CC组和TC组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。2.免疫荧光结果显示·:与TC组相比,SD组大鼠海马齿状回区BrdU+、BrdU+/DCX+及BrdU+/NeuN+细胞表达减少(P<0.05),但CC组和TC组相比,差异无统计学意义(P>0.05);与LV组相比,LM组大鼠海马齿状回区BrdU+、BrdU+/DCX+及BrdU+/NeuN+细胞表达增多(P<0.05);但LV组和SD组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.睡眠剥夺可导致大鼠下丘脑Orexin-A神经元表达增多。2.睡眠剥夺能抑制大鼠海马齿状回细胞增殖、分化和成熟。3.慢病毒载体介导siRNA沉默海马Orexin受体基因,可促进睡眠剥夺大鼠海马齿状回的细胞增殖、分化和成熟。4.睡眠剥夺诱导的Orexin-A过度表达可抑制海马齿状回细胞再生,而阻断Orexin受体基因能减弱睡眠剥夺大鼠的海马齿状回细胞增殖抑制,睡眠剥夺可能通过Orexin信号通路影响海马齿状回的神经细胞增殖和学习记忆。(本文来源于《山东大学》期刊2019-02-06）
冉江霞,石胜良,王成志[4]（2018）在《小鼠髓样细胞触发受体-2基因小发卡状RNA慢病毒载体构建》一文中研究指出目的构建小鼠髓样细胞触发受体-2(TREM2)基因小发卡状RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,并检测其功能。方法针对小鼠TREM2基因设计合成3对sh RNA序列,将其分别与线性化GV248载体连接,转化至感受态大肠埃希菌DH5α,构建TREM2基因sh RNA重组慢病毒载体(TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3)。用重组载体转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光(GFP)后,进行滴度测定。取对数生长期BV2小胶质细胞,分为TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组及空白对照组。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组分别感染TREM2-sh RNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3、sh RNA空质粒,空白组不做任何处理。感染120 h取各组细胞,Q-PCR法检测各组TREM2 m RNA,计算细胞沉默效率。结果 TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3转染293T后镜下均观察到GFP,包装浓缩的慢病毒滴度分别为(4×108)、(4×108)、(5×108) TU/m L。与空白对照组和阴性对照组比较,TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组TRME2 m RNA相对表达量均降低(P均<0. 05);与TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-3感染组比较,TREM2-shRNA-2感染组TRME2 m RNA相对表达量降低(P均<0. 05)。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组的沉默效率分别为49. 4%±3. 98%、79. 7%±2. 01、65. 3%±2. 41%和39. 2%±6. 98%,TREM2-shRNA2组沉默效率最高。结论成功构建TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3。TREM2-sh RNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3均可沉默小鼠BV2小胶质细胞中TREM2基因表达,以TREM2-shRNA-2沉默效果最好。(本文来源于《山东医药》期刊2018年43期）
林海,王向鹏,王威,徐蛟天,陈孝祥[5]（2018）在《核受体相关蛋白1基因慢病毒载体的构建》一文中研究指出目的构建使用绿色荧光蛋白(GFP)标记的核受体相关蛋白1 (nuclear receptor related 1 protein,Nurr1)慢病毒表达载体(DCE-Nurr1)并鉴定。方法使用引物设计软件Primier5设计基因Nurr1引物并采用聚合酶链反应(PCR)对其进行扩增,利用XbaI和Not I分别将基因Nurr1和载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP进行双酶切,利用T4链接酶将已酶切的基因Nurr1和已酶切的载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP连接起来,完成慢病毒表达载体的构建。结果通过PCR成功地扩增了Nurr1基因并连接到载体pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP上,序列与GenBank登记的序列一致。结论成功构建DCE-Nurr1慢病毒表达载体,为进一步在体内或体外研究Nurr1基因功能及其对多巴胺神经元的保护作用提供了基础。(本文来源于《昆明医科大学学报》期刊2018年11期）
陆彩霞,孙晓梅,王文广,匡德宣,李娜[6]（2018）在《慢病毒载体介导HCV受体基因OCLN/CD81转染对树鼩骨髓间充质干细胞的影响》一文中研究指出目的观察在体外培养条件下,慢病毒载体介导的HCV受体基因OCLN/CD81转染对树鼩骨髓间充质干细胞生物学特性的影响及基因的表达情况。方法利用本室分离鉴定保存的树鼩BM-MSCs,构建含人OCLN/CD81基因的慢病毒载体,并分别将CD81和OCLN基因转染到BM-MSCs中,荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测转染效率,CCK8法检测转染后BM-MSCs的细胞增殖情况,成骨成脂细胞诱导分化检测其多向分化潜能。采用实时荧光定量及WB方法检测HCV受体(OCLN/CD81)基因mRNA和蛋白表达情况和转染后BM-MSCs干性基因的表达。结果以MOI为100转染含人OCLN/CD81基因的慢病毒载体后,LV-CD81转染效率达99.4%,LV-OCLN转染效率22.6%。细胞增殖趋势与未转染基因的BM-MSCs相似,转染后的BM-MSCs仍可以向成骨成脂细胞分化,但能力有所下降。干性基因NANOG mRNA表达增高,差异有显着性(P<0.05),LIN28A mRNA表达下降,差异有显着性(P<0.05)。转染后树鼩BM-MSCs能高效表达所转入的外源基因。结论构建的含人OCLN/CD81基因的慢病毒载体可以成功转染树鼩BM-MSCs,并高效表达所转入的基因,转染后对树鼩BM-MSCs的多向分化潜能有一定的影响。(本文来源于《中国实验动物学报》期刊2018年06期）
徐琴,李贵芳,金婷婷,李頔,熊永红[7]（2018）在《慢病毒介导炭疽毒素受体1基因靶向沉默对γ珠蛋白基因表达的影响》一文中研究指出目的探讨沉默炭疽毒素受体1 (anthrax toxin receptor 1,ANTXR1)基因对γ珠蛋白基因表达的影响。方法构建ANTXR1基因特异性序列的shRNA重组质粒及阴性对照重组质粒,经酶切验证及测序鉴定后,将干扰载体和慢病毒质粒共转染入293T细胞后收集病毒上清液,再将其转染至K562细胞中,并经puromycin筛选稳转细胞株。通过实时荧光定量PCR技术检测各组ANTXR1基因和γ珠蛋白基因mRNA的表达情况;通过Western蛋白印迹技术检测各组ANTXR1蛋白和γ珠蛋白的表达情况。采用t检验进行统计分析。结果获得有效干扰ANTXR1基因的K562稳转细胞株,实时荧光定量PCR结果显示,ANTXR1-shRNA实验组中ANTXR1基因和γ珠蛋白基因mRNA相对表达水平分别为0.19±0.02和1.46±0.24;Western蛋白印迹技术结果显示,蛋白相对表达水平分别为0.20±0.01和1.45±0.14。ANTXR1-shRNA实验组与阴性对照组、空质粒载体组和空白对照组相比,ANTXR1基因相对低表达,γ珠蛋白基因相对高表达,差异均有统计学意义(P <0.05)。结论靶向沉默ANTXR1基因后,促进γ珠蛋白基因mRNA和蛋白水平的表达。(本文来源于《发育医学电子杂志》期刊2018年04期）
尚振华,贾春松,颜灏,王巨昆,王旭[8]（2018）在《膀胱平滑肌细胞乙酰胆碱M_3受体干扰RNA慢病毒载体的构建》一文中研究指出目的构建膀胱平滑肌细胞(bladder smooth muscle cells,BSMCs)M_3型受体干扰RNA慢病毒载体。方法合成4条M_3受体干扰序列,构建GV118-sh-M_3慢病毒载体,测序验证序列。将GV118-sh-M_3慢病毒载体与质粒p Helper1.0、p Helper 2.0叁个载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用荧光法检测4组病毒滴度。体外原代培养BSMCs,4组GV118-sh-M_3慢病毒(KD1、KD2、KD3和KD4)转染BSMCs,观察绿色荧光蛋白表达并通过RT-PCR、Western blotting法检测各组干扰效率。结果成功构建4个GV118-sh-M_3慢病毒载体,测序结果符合设计序列。4组GV118-sh-M_3慢病毒滴度分别为2×10~8、6×10~8、5×10~8和5×10~8TU/m L。分别转染BSMCs后,KD1组绿色荧光蛋白表达量最高且干扰效率最高。结论成功包装并筛选了GV118-sh-M_3慢病毒载体,为后续进一步研究干扰M_3受体在神经源性膀胱中的作用奠定了基础。(本文来源于《首都医科大学学报》期刊2018年03期）
高鑫[9]（2018）在《EGFR特异性嵌合抗原受体慢病毒载体构建及荧光素酶标记靶细胞制备》一文中研究指出目的:制备特异性抗人表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体(scFv),并鉴定其生物学功能。构建靶向人EGFR的慢病毒载体,通过转染293T细胞制备病毒液,测定病毒滴度,感染293FT细胞鉴定表达。构建稳定表达萤火虫荧光素酶(Fluc)和红色荧光蛋白(RFP)的人肺癌细胞系,为建立活体成像的人肺癌裸鼠移植瘤模型建立及进一步研究基于EGFR单链抗体的免疫治疗奠定基础。方法:从分泌抗人EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞系提取总RNA,利用5’RACE技术扩增轻链和重链可变区(V_L、V_H)基因,构建具有V_L、V_H基因的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中进行表达和鉴定。ELISA鉴定单链抗体对抗原的特异性;Fortebio检测抗原抗体间的亲和力,流式细胞术检测单链抗体结合肺癌细胞系天然EGFR的功能活性。设计以EGFR-scFv靶向EGFR的CAR结构,将此目的基因连接到慢病毒载体并转染293T细胞,收集病毒液后,利用qRT-PCR法检测病毒的滴度。构建荧光素酶和红色荧光蛋白的慢病毒载体pHBLV-Fluc-RFP,转染293T细胞进行病毒包装,完整病毒感染人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,用嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株,分别用荧光显微镜、定量PCR检测确证红色荧光蛋白和荧光素酶表达。结果:获得唯一的轻重链可变区序列V_L、V_H,成功构建EGFR-scFv,特异性与天然EGFR蛋白结合,亲和力达3.22×10~(-9)mol/L。构建含有EGFR-scFv的慢病毒载体,将构建好的慢病毒载体转染293T细胞。收集的病毒浓缩液经稀释后感染293T细胞,采用qRT-PCR方法成功完成病毒滴度的测定,且用慢病毒感染293T细胞显示病毒可以正常表达。成功构建pHBLV-Fluc-RFP慢病毒载体,获得了稳定表达荧光素酶和红色荧光蛋白的A549、H1975和K562细胞。结论:成功构建了抗人EGFR单链抗体,并以此为基础构建了EGFR-scFv-CD28-CD137-CD3结构慢病毒表达载体,通过转染293T细胞包装成慢病毒颗粒,获得了该基因的病毒液,并测定了病毒液滴度,通过感染细胞后用流式细胞术鉴定了外源修饰目的基因的表达,为肺癌免疫导向治疗研究奠定了基础。获得的红色荧光蛋白和荧光素酶双表达人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,为人肺癌细胞免疫缺陷小鼠模型活体成像提供新荧光配色细胞模型。(本文来源于《北京市结核病胸部肿瘤研究所》期刊2018-04-01）
张文雅[10]（2017）在《海马神经元转染沉默AP4M1基因的慢病毒后AMPA受体的表达变化》一文中研究指出目的原代培养胎鼠海马神经元,并转染包装了沉默衔接蛋白复合物-4μ亚基(adaptor-related protein complex 4,mu 1 subunit;AP4M1)基因的慢病毒后,观察细胞AP4M1、GluR1及GluR2(AMPA受体)的表达变化,以探究AP4M1可能介导的AMPA受体运输变化的分子机制。材料及方法本课题将原代培养海马神经作为实验对象,应用免疫荧光来标记神经元特异性烯醇化酶(neuron-specifice nolase,NSE),来鉴定所培养细胞中神经元的纯度。细胞培养中进行慢病毒(沉默AP4M1基因)转染,并进行荧光检测,以鉴定转染效率,实验分组:阴性慢病毒转染组及阳性慢病毒转染组(AP4M1基因表达沉默)。分别应用Real-time PCR和Western blotting方法研究AP4M1、GluR1及GluR2的mRNA及蛋白水平的表达变化。结果1、海马神经元的培养、鉴定及转染原代培养的SD大鼠胎鼠的海马神经细胞生长良好,在种植后第7天神经元基本发育成熟,神经元免疫荧光染色检测结果显示所培养细胞中的神经元纯度大于95%。在培养第2天可行慢病毒的转染,在转染8-12小时后换液,并于72小时后重复转染1次,再转染8-12h,72小时后进行荧光检测,转染率大于85%。2、海马神经元转染慢病毒后AP4M1、GluR1及GluR2的表达变化1)Real-time PCR检测:阳性病毒组AP4M1 mRNA表达量较阴性病毒组显着下调(t=68.193,P<0.01,n=8);转染后GluR1、GluR2 mRNA表达量较阴性病毒组也明显下降(t=8.060,P<0.01,n=8);(t=8.154,P<0.01,n=8)。2)Western blot检测:转染阳性病毒后AP4M1、GluR1及GluR2蛋白表达量较阴性病毒组显着下调(F=7.566,t′=15.966,P<0.01,n=8),(F=0.408,t′=8.690,P<0.01,n=8)(F=5.560,t′=13.770,P<0.01,n=8)。结论海马神经元在转染了包埋沉默AP4M1基因的慢病毒后,AP4M1的mRNA和蛋白表达明显下调,说明转染有效,进而海马神经元的GluR1、2的mRNA和蛋白表达也明显下调;AP4M1可能直接或间接调控海马神经元中的GluR1、2的转运。(本文来源于《郑州大学》期刊2017-05-01）
马慢病毒受体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景:P75神经生长因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75~(NTR))在不同细胞中可以介导截然不同的信号通路,但是在骨髓间充质干细胞中所传导的调节作用还尚未研究;脂质体和慢病毒介导单基因转染细胞技术已趋向成熟,但是其介导双基因转染的差异比较还未见报道。目的:构建大鼠P75~(NTR)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的过表达质粒及慢病毒载体,比较脂质体和慢病毒介导2种基因转染骨髓间充质干细胞的效果和实用性,以便于今后根据不同实验要求选择实验最优方案。方法:设计大鼠P75~(NTR)及NGF的基因引物,提取基因组DNA进行PCR扩增、与质粒载体重组构建表达增强绿色荧光的GV358-P75~(NTR)、表达增强红色荧光的GV492-NGF过表达质粒,转染293T细胞,加入慢病毒载体超速离心,收集目的基因过表达慢病毒,测定病毒样品滴度;选取体外培养的大鼠原代骨髓间充质干细胞,一组用脂质体Lipo3000共转染质粒GV358-P75~(NTR)、GV492-NGF,另一组用慢病毒共感染,同时设置阴性对照组和空白对照组,对转染后的骨髓间充质干细胞常规培养,第3,5,7,9,12天用荧光显微镜观察红绿荧光的表达,Westernblot检测P75~(NTR)及NGF蛋白表达,对转染后培养至7d的骨髓间充质干细胞进行消化传代培养,培养第3,5,7,9,12天用荧光显微镜观察红绿荧光的表达以及Western blot检测P75~(NTR)、NGF蛋白的表达。结果与结论:①构建的GV358-P75~(NTR)、GV492-NGF过表达质粒及慢病毒符合实验设计;②显微镜视野中红绿色荧光的丰度:脂质体共转染组先增加后降低,慢病毒共感染组持续增多;各时间点慢病毒组均多于脂质体组;脂质体转染组传代培养细胞的荧光表达相比于未传代前降低,而慢病毒转染组未见明显变化;③各时间点慢病毒感染组的P75~(NTR)及NGF蛋白表达量明显高于脂质体组,目的基因转染组的P75~(NTR)及NGF蛋白表达量均高于阴性对照组及空白对照组,差异有显着性意义(P<0.05);④P75~(NTR)、NGF双基因均能通过脂质体和慢病毒共转染方法在大鼠骨髓间充质干细胞中过表达;脂质体双基因转染操作相对简便,实验设备依赖性低,费用相对低廉,但感染效率明显低于慢病毒,而慢病毒双基因共感染后目的基因存在着持续表达,传代后基因丢失现象不明显。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
马慢病毒受体论文参考文献
[1].王志红,陈为民,林芸,尚晋,魏天南.慢病毒载体介导CC趋化因子受体7基因过表达可促进大鼠骨髓间充质干细胞归巢[J].中国组织工程研究.2019
[2].朱伦井,贝朝涌,段江涛,彭称飞,马跃刚.脂质体和慢病毒介导P75神经生长因子受体及神经生长因子转染骨髓间充质干细胞的效果比较[J].中国组织工程研究.2019
[3].苗素云.慢病毒载体介导siRNA沉默海马Orexin受体基因对睡眠剥夺大鼠齿状回细胞增殖的影响[D].山东大学.2019
[4].冉江霞,石胜良,王成志.小鼠髓样细胞触发受体-2基因小发卡状RNA慢病毒载体构建[J].山东医药.2018
[5].林海,王向鹏,王威,徐蛟天,陈孝祥.核受体相关蛋白1基因慢病毒载体的构建[J].昆明医科大学学报.2018
[6].陆彩霞,孙晓梅,王文广,匡德宣,李娜.慢病毒载体介导HCV受体基因OCLN/CD81转染对树鼩骨髓间充质干细胞的影响[J].中国实验动物学报.2018
[7].徐琴,李贵芳,金婷婷,李頔,熊永红.慢病毒介导炭疽毒素受体1基因靶向沉默对γ珠蛋白基因表达的影响[J].发育医学电子杂志.2018
[8].尚振华,贾春松,颜灏,王巨昆,王旭.膀胱平滑肌细胞乙酰胆碱M_3受体干扰RNA慢病毒载体的构建[J].首都医科大学学报.2018
[9].高鑫.EGFR特异性嵌合抗原受体慢病毒载体构建及荧光素酶标记靶细胞制备[D].北京市结核病胸部肿瘤研究所.2018
[10].张文雅.海马神经元转染沉默AP4M1基因的慢病毒后AMPA受体的表达变化[D].郑州大学.2017