导读:本文包含了冰城链霉菌论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:冰城链霉菌,米尔贝霉素基因簇,戊二酰亚胺聚酮类化合物,放线菌酮和放线菌酚
冰城链霉菌论文文献综述
颜一军[1]（2013）在《冰城链霉菌基因组及戊二酰亚胺类化合物的功能基因簇研究》一文中研究指出链霉菌是一类广泛分布在地球上，特别是土壤中的，具有分枝丝状体的革兰氏阳性菌，属于细菌域（Bacteria）放线菌目（Actinobacterales）链霉菌科（Streptomycetaceae）。它能产生大量的天然产物，像抗生素类，驱虫剂类，除草剂类，抗肿瘤药物及免疫抑制剂等。而此次测序的冰城链霉菌首次在中国哈尔滨的土壤样本中被分类得到，它能产抗寄生虫药物米尔贝霉素A3和A4，具有潜在的工业化应用前景。我们还从这株菌株分离得到了10个新的米尔贝霉素类似物，包括4个米尔贝霉素α类，2个米尔贝霉素β类，4个米尔贝中间产物，2个新的环肽类化合物bingchamides A and B和大环内酯类化合物ST906。同时这株菌也产一种聚醚类抗生素南昌霉素。此次实验我们首次通过Illumina Solexa测序技术成功获得了冰城链霉菌的全基因组序列信息。并通过软件Glimmer和次级代谢产物数据库，对冰城链霉菌的基因进行了预测和注释，特别是跟次级代谢产物相关的基因簇的分析，初步分析发现在冰城链霉菌中有23个基因簇参与聚酮类，非核糖体多肽类和萜类等次级代谢产物的生物合成。由于冰城链霉菌的基因组是目前为止已测序的链霉菌基因组中最大的，所以我们又对其基因组的构成进行分析，发现有3个因素可能导致了冰城链霉菌基因组的扩展，一是水平基因转移，特别是GC含量比较低的地方；二是重复基因，功能基因的重复在进化上使得链霉菌能更好的适应环境的变化；叁是转坐子及相关的转坐酶，它们的大量存在也使的冰城链霉菌扩大对外源基因吸收。所以这次的全基因组测序除了帮助我们更好的了解米尔贝霉素生物合成的机理，同时也对其他次级代谢产物的合成途径提供参考。从而为今后对冰城链霉菌的遗传改造，以获得米尔贝霉素的高产菌株打下坚实的基础。戊二酰亚胺聚酮类化合物都具有一个戊二酰亚胺的六元环，环的C-4上连着一段聚酮的侧链，侧链大部分成环，也有少数为直链。这一家族的天然抗生素包括cycloheximide, streptimidone,9-methylstreptimidone以及migrastatin类化合物。而且这一家族的成员大多具有抑制癌细胞迁移的活性，因此是很有发展潜力的新型抗肿瘤药物制剂。放线菌酮（Cycloheximide）作为真核生物蛋白合成抑制剂，被广泛应用于体外的生物医学研究，他能特异的结合在真核生物核糖体的60S亚基上，从而阻断蛋白翻译的延伸。但到目前为止，放线菌酮的生物合成途径却并不被人所了解，因而本实验室选取Streptomyces. Sp. YIM56141作为研究对象，对其的放线菌酮的生物合成途径进行了研究。得到放线菌酮和放线菌酚的基因簇后，我们选取了13个基因进行了基因敲除实验，发现敲除chxB、chxC、chxD、chxE后，这两种化合物都不产了，而且根据功能分析，这几个基因都跟聚酮链的合成相关，所以我们就推测6分子的丙二酰辅酶A在ChxB（游离的酰基转移酶）的帮助下结合到聚酮合酶ChxE后形成聚酮链，1分子的谷氨酰胺在ChxD的作用下则参与戊二酰亚胺基团的合成。最后由TE功能域从聚酮合酶上水解下来，就得到了中间产物。接着的工作就由四个后修饰酶起作用了，首先，我们在中断掉chxJ和chxI后，并没有积累到中间产物，说明从聚酮链上水解下来的中间产物并不稳定，难以分离得到，但我们通过功能比对发现ChxJ具有羧酸还原酶特性，能在ATP和NADPH的帮助下可将C14位上的羟基还原，最终在C14位上形成酮基。然后ChxI作为P450氧化还原酶，它能将C8位上的羟基氧化成酮基，使的C9位上的电子云密度增高，从而攻击C14位，发生亲核反应，然后再经烯醇互变，最终形成带苯环的产物Actiphenol，Actiphenol进一步水解就得到了Phenatic acid A。而Cycloheximide的形成就复杂的多，根据之前的发酵实验中断掉chxG和chxH后，就只产Actiphenol不产Cycloheximide，说明Cycloheximide的形成还需要这两个酶的参与，ChxG功能为NADH-黄素依赖的氧化还原酶，在这个推测的生物合成途径中，它可能起俩个作用，首先是将C12和C13之间的双键还原，导致成环后就不能形成苯环，接着再成环后C14和C9之间的双键还原，再经烯醇互变最终形成ChxH这个酮基还原酶的前体物质Cycloheximide H1。而ChxH作为NADPH依赖的酮基还原酶，就能将Cycloheximide H1的C8位上的酮基还原成羟基，再经烯醇互变成最终的产物Cycloheximide。最终推测得到Cycloheximide和Actiphenol的生物合成途径。此次实验首次提供了为什么一个基因簇能产生放线菌酮（带环己烷基团）和放线菌酚（带苯环基团）的假设，为以后此类化合物的生物合成途径推测提供了参考。同时放线菌酮和放线菌酚基因簇的获得及序列分析发现其为AT-less I类聚酮合酶，为这一戊二酰亚胺类化合物家族的研究增加了一个基因簇结构更简单的对象。对今后TE的重置，戊二酰亚胺的形成等研究提供参考。接着我们又对Cycloheximide和Actiphenol的生物合成途径中相关蛋白进行了体外实验，克隆表达其生物合成途径中最后一步酮基还原酶ChxH，成功得到有活性的蛋白，并优化得到ChxH蛋白反应条件，通过一系列底物的反应，初步获得ChxH酶对底物的选择性结果，同时进行了对天然底物cycloheximide H1及相应逆反应底物cycloheximide的酶活动力学分析，发现在NADPH饱和的情况下，以不同浓度Cycloheximide H1为底物,获得的酶最大反应速度Vmax和在Cycloheximide H1饱和的情况下，不同浓度NADPH下获得的酶最大反应速度Vmax差不多，从而印证了数据的可靠性。而且在比较Cycloheximide H1为底物和以Cycloheximide为底物的酶活参数时，我们发现Km值， Cycloheximide H1更低，说明ChxH与Cycloheximide H1的结合能力更好， Cycloheximide H1的转换数（kcat）是Cycloheximide的1.48倍，催化效率（kcat/Km）是3.36倍，说明Chx还原Cycloheximide H1成Cycloheximide的能力比氧化Cycloheximide成Cycloheximide H1要强的多，这也从生物合成途径说明为什么Cycloheximide是最终的产物的原因。同时通过模型构建我们也推测了ChxH的还原反应机制。基因簇的异源表达是研究基因簇的功能，也是未来组合生物学发展的一个重要基础。通过一个基因簇成功的在异源宿主中表达，就有可能提高相应化合物的产量，也有可能通过基因簇聚酮合酶模块的改造或后修饰基因的变化，从而得到一些新化合物。本次实验我们成功的构建了放线菌酮和放线菌酚的生物合成基因簇的异源表达载体，并通过导入chxA基因。在异源表达菌株S. lividans K4-114中成功表达了放线菌酮和放线菌酚的生物合成蛋白，通过对发酵产物的HPLC分析，发现了放线菌酮但没看到放线菌酚。说明异源表达的复杂性，相关结果还得进一步的实验验证。但初步获得的结果为以后异源表达或者组合生物合成新的戊二酰亚胺类化合物奠定基础。接着我们又通过分析iso-MGS基因簇，LTM基因簇及CHX基因簇，发现mgsA基因及它的同源基因chxA在MGS和CHX基因簇中分别存在，但在LTM基因簇中却没有；在之前的实验中，mgsA基因的失活彻底丧失了iso-MGS的产生；通过把iso-MGS基因簇转化到不同的异源表达菌株，并对基因簇中的各个基因进行RT-PCR监测，发现mgsA几乎并不转录。而这些发现对弄清楚天然产物的基因簇在异源体系中是如何表达就显的很重要。因此我们成功构建了chxA和mgsA调控基因的表达质粒pUWL201PW-chxA，pKC1139-chxA，pUWL201PW-mgsA，pKC1139-mgsA；并分别导入相应的异源表达宿主及野生型菌株中，并通过对得到的工程菌株的发酵产物的HPLC分析，发现mgsA对iso-MGS表达菌株的产量提高有限，在20%-96%之间，说明mgsA对iso-MGS基因簇的调控并不明显，可能是由于iso-MGS基因簇本身就含有mgsA，增加的拷贝对基因簇的调控没有迭加效应。对Lactimidomycin表达菌株，mgsA的引入导致Lactimidomycin基因簇的沉默，但同时也有可能激活了其它代谢产物的产生。而chxA则使得Lactimidomycin的产量提高了近一倍。由于iso-MGS，LTM，CHX这叁个基因簇的相关性，这一现象的发现对研究这一类化合物的调控提供了重要线索，但还得后续的实验，如新产物的分离鉴定，chxA和mgsA的RT-PCR验证等来进一步的证实。本研究成功获得了冰城链霉菌的基因组，并对整个基因组结构进行了分析和比较，推测得到米尔贝霉素的生物合成基因簇及其他相关次级代谢产物的基因簇，为以后对冰城链霉菌的研究打下基础。同时通过一系列分子生物学手段，如基因中断，互补等实验推测得到戊二酰亚胺聚酮类化合物Cycloheximide和Actiphenol的生物合成途径，并成功构建了异源表达体系，并对戊二酰亚胺聚酮类化合物家族的相关调控基因chxA和mgsA进行了研究，为以后此类化合物的研究奠定了基础。(本文来源于《东北农业大学》期刊2013-06-01）
贺祖宏[2]（2012）在《冰城链霉菌属间接转移体系及南昌霉素中断菌株的构建》一文中研究指出冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是从中国哈尔滨土壤中分离得到的一种产多种化合物的吸水链霉菌,主要产物有聚醚类化合物南昌霉素(nanchangmycin)和大环内酯类化合物米尔贝霉素(milbemycin)。米尔贝霉素是一种十六元环大环内酯混合物,具有广谱、高效的抗寄生虫活性,在农业害虫防治中具有重要的经济价值。南昌霉素是一种聚醚类混合物,具有较强的杀虫活性,可被用于鸡球虫病的防治中。冰城链霉菌是米尔贝霉素的高产菌株,但由于其发酵产物多、成分复杂,这就为米尔贝霉素的纯化带来了困难,所以对其他抗生素的合成进行中断,构建米尔贝霉素单一表达的工程菌株是冰城链霉菌工业化生产的前提条件。外源遗传物质导入链霉菌的方法主要有电转化和接合转移。由于大肠杆菌-链霉菌属间结合转移操作简单,不要求宿主菌具有原生质体制备和再生技术,并且能有效的避免宿主菌的限制性系统障碍,所以目前被广泛应用。在前期对冰城链霉菌属间接和转移条件的的探索中,采用整合质粒pIJ8600作为转移质粒在孢子萌发的温度影响、接合转移培养基的选择、接合转移培养基中MgCl2浓度的选择、孢子萌发时间的选择、供体和受体比例的选择及抗生素覆盖时间的选择等方面做出了探索,最后确定冰城链霉菌接合转移效率最高时的条件为：冰城链霉菌孢子在接合转移操作前需要28℃孵育30min；接合转移选择在含有30mM MgC12的MS培养基上进行；大肠杆菌与冰城链霉菌孢子的供受比为1/10;抗生素覆盖时间为20小时。南昌霉素是一种具有杀虫活性的聚醚类化合物,其完整的PKS基因簇已于2003年从南昌链霉菌(Streptomyces nanchangensis)扣克隆得到。本实验室于2010年完成冰城链霉菌的测序工作,得到的南昌霉素PKS基因序列与南昌链霉菌中的序列相似性极高。所以可在南昌链霉菌的南昌霉素PKS相关研究基础上,设计实验实现冰城链霉菌中南昌霉素的中断表达。通过对冰城链霉菌基因组序列的生物信息学分析,确定南昌霉素生物合成基因簇起始模块的位置。设计引物nanloading-L1和nanloading-L2,以冰城链霉菌226541的总DNA为模板,扩增出loading模块的左翼序列,与pMD19-T Vector连接构建出质粒pBC2325;然后在质粒中插入卡那霉素抗性基因(neo)构建出质粒pBC1066;再设计引物nanloading-R1和nanloading-R2,扩增出loading模块的右翼序列并与pBC1066连接,构建出质粒pBC1797;用HindⅢ和EcoRI酶切并回收连接有neo的长片段,与同样经HindⅢ和EcoRI酶切的pKC1139进行连接,构建出质粒pBC5188,最后对中断质粒进行PCR鉴定。将质粒pBC5188从大肠杆菌DH5a中提出并转入ET12567(pUZ8002),构建出用于接合转移的大肠杆菌ET12567(pUZ8002/pBC5188)。利用接合转移方法将质粒pBC5188导入冰城链霉菌226541,筛选阳性接合子并进行鉴定。综上,本实验为冰城链霉菌工程菌株的构建及下一步遗传改造奠定了基础。(本文来源于《东北农业大学》期刊2012-05-04）
刘维娣[3]（2012）在《冰城链霉菌C5-酮基属间接合转移中断菌株的构建》一文中研究指出米尔贝霉素具有广谱、高效的抗寄生虫活性,对宿主不良反应极低,是目前理想的驱虫、杀虫药物。其C5-肟米尔贝霉素的活性更高,并且杀虫谱更广,效果更好。而5-酮基米尔贝霉素由于其C5位酮基的化学性质比较活泼,很容易合成5-肟米尔贝素衍生物,是化学合成5-肟米尔贝霉素衍生物的最佳前体,因此研究从米尔贝霉素A3、A4到5-酮基米尔贝霉素A3、A4的生物合成途径具有重要的意义。冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是本实验室发现的一株新的吸水链霉菌菌株,是米尔贝霉素(milbemycin)和冰城霉素(bingchengmycin)的重要产生菌。冰城链霉菌的代谢产物具有较好的杀虫活性和高效防治能力。接合转移作为基因转移工具已在多种链霉菌中成功应用,此方法既可以避开胞外核酸酶使DNA免遭降解,在一定程度上还可以克服宿主对外源DNA的限制性修饰提高转化效率。binF基因(C5-酮基还原酶基因)是在冰城链霉菌中负责编码催化大环内酯类抗生素C5位的酮基转化为羟基的还原酶基因,序列较保守。本研究通过分子生物学的方法对binF基因进行失活,从而获得产生C5-酮基米尔贝霉素的生产菌株。以冰城链霉菌226541为研究材料,进行了大肠杆菌-冰城链霉菌属间接合转移系统的实验,尝试了冰城链霉菌中binF基因的中断工作。为了进一步研究binF基因在冰城链霉菌226541中的功能,本研究利用生物信息学分析冰城链霉菌的基因组信息,确定binF基因位置及相邻序列,设计引物binF-L1、binF-L2和binF-R1、binF-R2,在冰城链霉菌226541总DNA中扩增binF基因的两翼序列,与pMD19-T Vector连接构建出质粒pBCl130,在两翼中间插入硫链丝菌素抗性基因(tsr)构建出质粒pBC810。然后利用HindⅢ和BamHI酶切两翼,与pKCl139连接构建中断质粒pBC3129,并用PCR和测序比对验证了中断质粒构建的正确性。将binF中断质粒pBC3129转入ET12567(pUZ8002)获得接合转移供体菌ET12567(pUZ8002/pBC3129),通过接合转移导入冰城链霉菌226541中,得到阳性接合子。对接合子进行抗生素稳定性和分子生物学筛选,最终得到binF基因中断菌株。冰城链霉菌226541与大肠杆菌ET12567(pUZ8002/pBC3129)的接合转移体系为：冰城链霉菌226541孢子28℃孵育30mmin,大肠杆菌OD600值为0.2,混合涂布于含有30mM MgCl2的MS培养基上,培养16h覆盖抗生素。(本文来源于《东北农业大学》期刊2012-04-04）
孙晓琳[4]（2010）在《冰城链霉菌C5-O-methyltransferase基因克隆、表达及体外功能分析》一文中研究指出本研究为了阐明米尔贝霉素A3和A4转化为C5-O-甲基米尔贝霉素A3和A4的生物催化途径,通过对冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因(binD)全长序列的扩增、原核表达及体外功能分析,证明了米尔贝霉素A3和A4转化为C5-O-甲基米尔贝霉素A3和A4是由C5-O-甲基转移酶(BinD)催化完成。主要研究结果如下:(1)冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因(binD)全长序列的扩增。根据已报道的Streptomyces griseochromogenes,Streptomyces avermitilis,Streptomyces cyaneogriseus叁种链霉菌的C5-O-甲基转移酶氨基酸序列进行比对,设计部分序列的上下游引物,扩增得到部分序列(795 bp),运用Blast程序比对,结果表明部分序列与Streptomyces griseochromogenes的C5-O-甲基转移酶基因(milD)一致性高达91%。根据milD序列设计全长序列的上下游引物,扩增得到846 bp的全长序列(GenBank登陆号:FJ531497.2),蛋白序列比对结果表明,与Streptomyces griseochromogenes C5-O-甲基转移酶(MilD)一致性为87%;与Streptomyces cyaneogriseus C5-O-甲基转移酶(NemD)和Streptomyces avermitilis C5-O-甲基转移酶(AveD)一致性分别为56%和53%。(2)冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶基因(binD)的原核表达。设计带有BamHI和HindIII的酶切位点引物,将全长片段克隆,并插入到表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-binD,随后将其转化到E.coli BL21(DE3)中,诱导表达后,经SDS-PAGE分析表明,在31 KDa附近获得了预期条带,且表达产物在大肠杆菌中以包涵体形式存在。(3)大肠杆菌生物转化米尔贝霉素A3和A4。分别以milbemycin A3和A4为底物,用含有重组质粒的E.coli BL21(DE3)于28℃进行生物转化,细胞浸提液处理后进行LC-MS检测,结果初步表明:含有重组质粒的E.coli BL21(DE3)可以将milbemycinA3和A4生物转化成C5-O-甲基milbemycinA3(r.t. 8.95 min; [M+H]+ m/z = 543)和C5-O-甲基milbemycinA4(r.t. 10.24 min; [M+H]+ m/z = 557)。(4)冰城链霉菌C5-O-甲基转移酶(BinD)体外功能分析。利用纯化复性后的BinD蛋白来分别催化底物milbemycinA3和A4,HPLC检测到产物C5-O-甲基milbemycinA3(r.t. 8.95 min)和C5-O-甲基milbemycinA4(r.t. 10.24 min)的存在。这与生物转化的结果一致,从而证明在冰城链霉菌中,milbemycinA3和A4转化为C5-O-甲基milbemycinA3和A4的生物途径由BinD催化完成。(5)本实验还探究了pH、温度对酶活的影响,结果表明BinD催化的最适pH为7.4,温度为28℃。综上,本研究为进一步探究冰城链霉菌米尔贝霉素生物合成基因簇及基因中断奠定了重要基础。(本文来源于《东北农业大学》期刊2010-04-08）
郭锁莲[5]（2009）在《nsdA基因和bldA基因的中断对冰城链霉菌形态分化及次级代谢的影响》一文中研究指出冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是由本实验室发现的链霉菌家族中的新成员,次级代谢产物是米尔贝霉素(milbemycin)和冰城霉素(bingchengmycin)。前者是一类具有广谱抗虫活性的十六元大环内酯聚酮类化合物,对各种螨类都有高的防治效果;后者是一聚醚类抗生素,抗球虫活性强;二者在农业和畜牧业生产中已广泛应用。nsdA基因(negative regulator of Streptomyces differentiation)是首先在天蓝色链霉菌(S. coelicolor)中发现的一个全局性负调节基因,对天蓝色链霉菌的产孢形态分化与抗生素的合成有负调控作用。随后的研究发现在多种链霉菌中nsdA均保守存在。bldA是目前研究最透彻的形态分化调节基因之一,编码链霉菌基因组中唯一有效识别亮氨酸稀有密码子UUA的tRNA,通过控制稀有密码子UUA的翻译在多水平级联调控系统中发挥着重要作用。基于链霉菌代谢调控网络的复杂性,nsdA和bldA基因普遍性和多效性,冰城链霉菌的新颖性,本实验的研究目的是验证nsdA和bldA基因存在于冰城链霉菌中的可能性,并探索它们对形态分化和次级代谢产物的合成的影响。根据基因组已知的阿维链霉菌、天蓝色链霉菌nsdA和bldA基因及相邻的保守序列,设计引物,在冰城链霉菌226541总DNA中扩增得到nsdA和bldA基因(GeneBank登陆号EU779992,FJ380950),通过生物信息学分析发现与其他链霉菌相比,冰城链霉菌nsdA基因序列同源一致性可达75%以上,而bldA基因的序列同源一致性高达86%。利用λRed-mediated PCR-targeting方法构建nsdA和bldA基因置换载体,以含有39nt同源序列的引物进行PCR制备线性基因片段,电转化BW25113,利用其中的λRED重组系统,将目的基因用抗性卡壳置换,进而构建nsdA基因置换载体pBC929和bldA置换载体pBC529。然后通过属间结合转移进入冰城链霉菌中,通过抗性筛选,完成染色体上目的基因的置换,实验得到nsdA的基因置换菌株BC29和bldA基因置换菌株LC29。与野生株相比,nsdA基因置换菌株BC29表现出孢子颜色加深和色素产量增加的表型变化,HPLC分析发现突变株BC29发酵液中米尔贝霉素和冰城霉素的产量较野生株分别提高了250%和67% ;bldA基因置换菌株LC29,产孢受抑制,表现为“光秃’表型,菌落颜色由黄白色变为鲜黄色,HPLC分析发现LC29的发酵液中不含米尔贝和冰城霉素组分。为了排除由于极性效应或其他位点突变造成的影响,进行了遗传互补实验,扩增含有完整目的基因的DNA片段酶切后联到整合载体pIJ8600的对应酶切位点,构建用于遗传互补的重组质粒pJC3和pJC5,经过属间结合转移进入相应基因中断菌株。在相同条件下培养,nsdA基因置换菌株BC29的遗传互补菌株BC39和bldA基因置换菌株LC29的遗传互补菌株LC39均恢复到野生株的状态,进一步证明突变株的变化是由于目的基因的中断引起的。以上研究表明nsdA基因参与了冰城链霉菌形态分化和次级代谢抗生素合成的调控途径,并起着负调控作用;bldA基因通过控制含有TTA密码子的基因的时空表达,调控着冰城链霉菌形态分化和次级代谢抗生素合成。(本文来源于《东北农业大学》期刊2009-04-09）
冰城链霉菌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是从中国哈尔滨土壤中分离得到的一种产多种化合物的吸水链霉菌,主要产物有聚醚类化合物南昌霉素(nanchangmycin)和大环内酯类化合物米尔贝霉素(milbemycin)。米尔贝霉素是一种十六元环大环内酯混合物,具有广谱、高效的抗寄生虫活性,在农业害虫防治中具有重要的经济价值。南昌霉素是一种聚醚类混合物,具有较强的杀虫活性,可被用于鸡球虫病的防治中。冰城链霉菌是米尔贝霉素的高产菌株,但由于其发酵产物多、成分复杂,这就为米尔贝霉素的纯化带来了困难,所以对其他抗生素的合成进行中断,构建米尔贝霉素单一表达的工程菌株是冰城链霉菌工业化生产的前提条件。外源遗传物质导入链霉菌的方法主要有电转化和接合转移。由于大肠杆菌-链霉菌属间结合转移操作简单,不要求宿主菌具有原生质体制备和再生技术,并且能有效的避免宿主菌的限制性系统障碍,所以目前被广泛应用。在前期对冰城链霉菌属间接和转移条件的的探索中,采用整合质粒pIJ8600作为转移质粒在孢子萌发的温度影响、接合转移培养基的选择、接合转移培养基中MgCl2浓度的选择、孢子萌发时间的选择、供体和受体比例的选择及抗生素覆盖时间的选择等方面做出了探索,最后确定冰城链霉菌接合转移效率最高时的条件为：冰城链霉菌孢子在接合转移操作前需要28℃孵育30min；接合转移选择在含有30mM MgC12的MS培养基上进行；大肠杆菌与冰城链霉菌孢子的供受比为1/10;抗生素覆盖时间为20小时。南昌霉素是一种具有杀虫活性的聚醚类化合物,其完整的PKS基因簇已于2003年从南昌链霉菌(Streptomyces nanchangensis)扣克隆得到。本实验室于2010年完成冰城链霉菌的测序工作,得到的南昌霉素PKS基因序列与南昌链霉菌中的序列相似性极高。所以可在南昌链霉菌的南昌霉素PKS相关研究基础上,设计实验实现冰城链霉菌中南昌霉素的中断表达。通过对冰城链霉菌基因组序列的生物信息学分析,确定南昌霉素生物合成基因簇起始模块的位置。设计引物nanloading-L1和nanloading-L2,以冰城链霉菌226541的总DNA为模板,扩增出loading模块的左翼序列,与pMD19-T Vector连接构建出质粒pBC2325;然后在质粒中插入卡那霉素抗性基因(neo)构建出质粒pBC1066;再设计引物nanloading-R1和nanloading-R2,扩增出loading模块的右翼序列并与pBC1066连接,构建出质粒pBC1797;用HindⅢ和EcoRI酶切并回收连接有neo的长片段,与同样经HindⅢ和EcoRI酶切的pKC1139进行连接,构建出质粒pBC5188,最后对中断质粒进行PCR鉴定。将质粒pBC5188从大肠杆菌DH5a中提出并转入ET12567(pUZ8002),构建出用于接合转移的大肠杆菌ET12567(pUZ8002/pBC5188)。利用接合转移方法将质粒pBC5188导入冰城链霉菌226541,筛选阳性接合子并进行鉴定。综上,本实验为冰城链霉菌工程菌株的构建及下一步遗传改造奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
冰城链霉菌论文参考文献
[1].颜一军.冰城链霉菌基因组及戊二酰亚胺类化合物的功能基因簇研究[D].东北农业大学.2013
[2].贺祖宏.冰城链霉菌属间接转移体系及南昌霉素中断菌株的构建[D].东北农业大学.2012
[3].刘维娣.冰城链霉菌C5-酮基属间接合转移中断菌株的构建[D].东北农业大学.2012
[4].孙晓琳.冰城链霉菌C5-O-methyltransferase基因克隆、表达及体外功能分析[D].东北农业大学.2010
[5].郭锁莲.nsdA基因和bldA基因的中断对冰城链霉菌形态分化及次级代谢的影响[D].东北农业大学.2009
标签：冰城链霉菌; 米尔贝霉素基因簇; 戊二酰亚胺聚酮类化合物; 放线菌酮和放线菌酚;