导读:本文包含了囊泡融合论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:锰,可溶性N-甲基马来酰胺敏感因子附属蛋白受体,突触囊泡融合,神经递质释放
囊泡融合论文文献综述
王璨[1]（2019）在《锰干扰SNARE复合物介导的突触囊泡融合导致谷氨酸和γ-氨基丁酸释放障碍的实验研究》一文中研究指出目的:锰(Manganese,Mn)广泛分布于生物圈,在人体内含量甚微但却是必需微量元素,在体内众多代谢过程中扮演重要角色。长时间暴露于锰环境中,锰可通过血脑屏障进入脑内,沉积在黑质及纹状体中,造成广泛的病理性损伤,产生相应的神经系统受损症状,称之为锰中毒。目前研究主要集中于以下几种机制:多巴胺耗竭、线粒体功能障碍、神经递质释放异常和氧化应激,但其具体机制还不明确。有研究表明,锰暴露会干扰脑内神经元的神经递质信号传递,而干扰氨基酸类神经递质释放是锰致神经退行性疾病的一个重要的细胞分子学机制。可溶性N-甲基马来酰胺敏感因子附属蛋白受体(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive accessory protein receptor,SNARE)是突触囊泡融合过程中的核心成分,而且参与几乎所有分泌细胞的胞吐过程,由Syntaxin-1,VAMP-2和SNAP-25叁种蛋白组成。其中SNAP-25能与Synaptotagmin作用,在突触囊泡停泊中发挥重要作用;Syntaxin-1与Munc 18蛋白结合可抑制其正常生理功能,干扰SNARE复合物的形成;VAMP-2可与Synaptophysin结合形成新的复合物,作为VAMP-2储备池,使突触囊泡能应对突然增加的神经递质释放的需求。α-突触核蛋白(Alpha-Synuclein,α-Syn)主要位于中枢神经系统神经突触前膜末梢和细胞核膜上,在生理状态下其单体对神经元有保护作用,可以参与突触传递、调节突触囊泡的密度、提高神经元细胞的可塑性以及维护突触的正常功能。有研究表明α-Syn可以结合VAMP-2,促使SNARE复合物的形成,从而促进囊泡与突触前膜融合。有研究认为α-Syn的寡聚中间体可能是由α-Syn介导的细胞死亡过程中的一个重要进程。大量研究表明α-Syn与突触囊泡形成及融合关系密切,于是我们推测在α-Syn过表达的神经元中,α-Syn易聚集,导致突触囊泡功能失调,最终发展为神经退行性疾病。钙蛋白酶(Calpain)可以裂解多种细胞溶质内、细胞膜上或细胞骨架上的蛋白质,可改变多种内源性蛋白质的完整性、位置和活性,从而激活或抑制其基本生理功能。最近有研究表明,SNAP-25是Calpain的裂解底物之一。本研究分别以原代培养神经元、成年昆明小鼠、SH-SY5Y细胞系为研究对象,建立神经元的锰暴露模型,研究锰对突触囊泡融合的影响;建立SH-SY5Y细胞系的锰染毒模型,研究锰致SNARE复合物形成障碍机制;建立锰短期重复暴露动物模型,研究锰致Glu和GABA释放障碍机制。以锰影响SNARE复合物的形成为出发点,用钙蛋白酶抑制剂抑制Calpain活性,再利用shRNA干扰技术,抑制α-Syn基因和蛋白的表达,进一步探讨锰干扰突触囊泡融合的具体机制,为锰致神经毒性机制的研究提供实验依据。研究方法:1、体外培养新生鼠神经元,经神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)免疫荧光鉴定阳性率90%以上可进行后续实验。先将神经元分为5个剂量组,染毒终浓度分别为0、25、50、100、200μM,每个剂量组都分别在0、6、12、24h时检测噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)及乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH),用以检测神经元活力。根据上述实验结果,选择100μM这一染毒终浓度,分别暴露0、6、12、18、24h,进行后续指标检测。分别用PCR和Western blotting方法测定Syntaxin-1,VAMP-2,SNAP-25,Synaptophysin,Synaptotagmin 1和Munc 18的mRNA及蛋白表达;免疫荧光和免疫共沉淀方法检测Syntaxin-1和Munc 18及Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用;用非变性Western blotting方法检测SNARE复合物形成水平;FM1-43荧光染色检测活动性突触囊泡的融合。2、将SH-SY5Y细胞分为六个剂量组,分别为对照组,200μM锰处理组,shRNA转染组,shRNA转染+200μM锰处理组,错译shRNA转染组,错译shRNA转染+200μM锰处理组。用倒置荧光和分子学实验方法鉴定慢病毒转染效率;检测细胞活力及培养液中LDH的释放量;测定Syntaxin-1,VAMP-2,SNAP-25和Synaptophysin的mRNA及蛋白表达;检测α-Syn与VAMP-2及Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用;检测SNARE复合物的形成以及活动性突触囊泡的融合。3、用成年SPF级昆明小鼠48只,按体重随机分为8组,分别为生理盐水对照组,25、50、100μmol/kg氯化锰染毒组,100μg/kg钙蛋白酶抑制剂——Calpeptin对照组,Calpeptin预处理组:分别用25、50、100μg/kg Calpeptin预处理2h后,再注射100μmol/kg氯化锰。每组6只,雌雄各半。连续染毒24天,分别在第8、16、24天进行旷场实验,24天旷场实验结束后取大脑基底核进行指标检测。用微波消解-原子吸收法检测脑内锰含量;测定细胞内Ca~(2+)浓度及Calpain活性;通过透射电镜进行基底核突触体观察;用高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)法检测大脑基底核神经突触间隙内源性谷氨酸(Glutamate,Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)浓度;测定Syntaxin-1,VAMP-2和SNAP-25的mRNA及蛋白表达;检测SNARE复合物形成水平和活动性突触囊泡的融合。结果:1、随着染锰剂量的增加(0-200μM)及时间的延长(0-24h),神经元的活力不断下降,呈剂量-时间依赖效应关系。在染锰剂量为100μM时最有利于后续实验的毒性判断,故选择此剂量进行不同时点染毒。各组神经元Synaxtin-1蛋白表达未发生明显改变,SNAP-25蛋白表达呈时间依赖性下降,VAMP-2和Munc 18蛋白呈时间依赖性升高。Syntaxin-1和Munc 18之间的蛋白相互作用在18h和24h时明显升高,VAMP-2和Synaptophysin之间的蛋白相互作用可见二者结合在12h时明显升高;但在24h显着下降。100kDa的SNARE复合物形成一直处于下降趋势,而80kDa的SNARE复合物在染锰12h时出现升高现象,但在染锰24h下降。突触囊泡融合水平与80kDa的SNARE复合物形成结果趋势一致。2、慢病毒干扰α-Syn表达模型,转染效率达到90%以上,可以有效的降低α-Syn mRNA和蛋白的表达。锰处理细胞24h后,LDH释放量,细胞凋亡率,α-Syn及VAMP-2的mRNA和蛋白表达均升高,并且α-Syn与VAMP-2之间的相互作用增强,Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用减弱,使VAMP-2不能行使正常的生理功能,SNARE复合物的形成及FM1-43标记的突触囊泡释放减少。用100μM锰分别处理α-Syn表达下调细胞和正常细胞对比发现,α-Syn表达下调细胞损伤程度明显下降,Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用明显恢复,并且α-Syn与VAMP-2之间的相互作用也减弱,SNARE复合物的形成及FM1-43标记的突触囊泡释放增多。携带错译shRNA慢病毒转染的细胞对各项指标没有影响。3、与对照组相比,100μmol/kg染锰组小鼠连续染毒24天后,旷场实验显示其平均速度和在中心区域停留时间与对照组相比都明显下降,且随着染锰剂量的升高,小鼠基底核内锰含量明显升高,电镜结果显示100μmol/kg染锰组小鼠突触囊泡数量下降,突触前后膜融合,突触后致密物增厚,这些结果提示了小鼠亚急性锰暴露模型建立成功。50、100μmol/kg染锰组小鼠细胞内钙离子浓度和钙蛋白酶活性均明显升高;各染毒组小鼠Syntaxin-1蛋白表达未发生明显改变,SNAP-25蛋白表达发生不同程度下降,在50、100μmol/kg染锰组小鼠出现SNAP-25-N端裂解碎片,VAMP-2蛋白表达出现不同程度的升高;SNARE复合物80kDa蛋白复合物在25、50μmol/kg染锰组明显升高,在100μmol/kg染锰组下降,100kDa蛋白复合物没有明显变化;FM1-43染色显示50μmol/kg染锰组小鼠活动性囊泡明显升高,100μmol/kg染锰组小鼠明显下降。用Calpeptin干预后,与100μmol/kg染锰组小鼠比较,基底核内锰浓度和钙离子浓度均未发生改变;随着钙蛋白酶抑制剂浓度升高,各干预组小鼠Syntaxin-1蛋白表达未发生明显改变,SNAP-25蛋白表达发生不同程度升高,100μg/kg Calpeptin干预组小鼠未检出SNAP-25-N端裂解碎片,VAMP-2蛋白表达未出现明显改变;SNARE复合物100kDa蛋白复合物在50、100μg/kg Calpeptin干预组明显升高,80kDa蛋白复合物没有明显变化;FM1-43染色显示100μg/kg Calpeptin干预组活动性囊泡明显增多。结论:锰可通过干扰SNARE复合物相关蛋白表达导致SNARE复合物形成障碍。其具体机制可能为:锰致细胞内钙离子超载,活化Calpain,特异性地裂解SNAP-25;同时促使α-Syn蛋白表达升高,与VAMP-2蛋白结合增加,束缚了VAMP-2与Synaptophysin的正常结合,影响其正常生理功能,干扰SNARE复合物形成,引起突触囊泡融合下降,Glu和GABA释放降低,引发神经毒性。此研究不仅为预防和治疗锰中毒及其他神经退行性疾病提供一定的实验和理论依据,而且在加强锰中毒防治和保护锰接触者健康方面有重要的现实意义。(本文来源于《中国医科大学》期刊2019-05-01）
秦文娟[2]（2019）在《核孔膜在诱导脂质囊泡膜融合和细胞内递送的应用研究》一文中研究指出核孔膜作为一种孔径均一和圆柱形孔形的微孔滤膜,已在各行业的精密过滤领域有广泛的应用,基于较小孔径核孔膜(100-300 nm)的挤出法也用于控制脂质体粒径。由此,本文将基于核孔膜的挤出法用于诱导脂质体或脂质囊泡膜融合。首先研究了挤出法能否诱导荧光标记脂质体和空白脂质体膜融合,继而研究了挤出法能否诱导荧光标记脂质体和外泌体发生膜融合。此外,基于物理性细胞内递送技术的原理和研究进展,推测较大孔径附核孔膜(7-11 μm)可用于细胞内递送。分别利用挤出法将荧光标记的右旋糖酐大分子递送至小鼠结肠癌细胞株CT26和人髓性白血病细胞株K562，并对影响递送效率的主要因素进行了初步考察,此外还对不同分子量右旋糖酐是否进入细胞核、入核途径及时机进行了研究。具体研究内容及结果如下:1)挤出法诱导脂质体膜融合制备了空白脂质体和含FRET荧光分子对的标记脂质体,通过挤出法诱导脂质体发生膜融合,动态光散射法(DLS)检测脂质体粒径,激光共聚焦(CLSM)观察脂质体膜融合现象,荧光分光光度计定量检测荧光强度变化并计算膜融合率,以冻融法作为对照;并考察了挤出次数、压力和温度等对膜融合效率的影响。结果显示,挤出法能诱导两种脂质体发生高效膜融合,这可从处理后的脂质体共聚焦照片中荧光强度的变化证实,此外对荧光强度变化的定量分析显示挤出75次时膜融合效率达27%。与冻融法相比,挤出法的膜融合效率相当,但是所制得的膜融合脂质体粒径分布更均一。此外,低挤出压力、生理温度和高挤出次数有利于促进膜融合和脂质混合。2)挤出法构建杂化外泌体从K562上清利用超速离心法提取外泌体,然后与荧光标记脂质体混合后挤出处理诱导膜融合,构建杂化外泌体,并与冻融法进行对照。利用透射电镜对外泌体和杂化外泌体进行观察和鉴定,CLSM观察荧光标记脂质体和外泌体的膜融合现象,DLS检测各种脂质囊泡粒径,利用荧光分光光度法检测荧光强度变化并计算膜融合效率。结果显示,挤出法能诱导脂质体和外泌体膜融合,从而构建杂化外泌体。透射电镜下,杂化外泌体仍然保持了外泌体典型的茶托样结构。CLSM观察证实二者发生了膜融合。与冻融法相比,挤出法(100次)的膜融合效率也即脂质稀释率稍低,但是挤出法制备的杂化外泌体具有均一的粒径,且挤出过程耗时短。3)利用挤出法将右旋糖酐递送入CT26细胞利用挤出法诱导CT26细胞变形及短暂膜穿孔而将不同分子量右旋糖酐递送入细胞内,观察了挤出对细胞贴壁生长和增殖的影响,采用流式细胞术(FACS)分析递送效率和细胞死亡率,并考察了核孔膜孔径和右旋糖酐分子量对递送效率的影响。CLSM观察了细胞内右旋糖酐的亚细胞分布,也即质核比。结果表明,挤出法处理的细胞保持了 CT26的贴壁生长和增殖能力。核孔膜孔径和右旋糖酐分子量影响了细胞内递送效率,孔径和分子量与递送效率负相关。3种不同分子量右旋糖酐在挤出处理后都能进入细胞核,进入细胞核的量与分子量呈负相关。4)利用挤出法将右旋糖酐递送入悬浮细胞K562利用挤出法诱导K562细胞变形及短暂膜穿孔而将不同分子量右旋糖酐递送入细胞内,观察了挤出对细胞生长和增殖的影响,FACS分析递送效率,并考察了核孔膜孔径和右旋糖酐分子量对递送效率的影响。CLSM观察了细胞内右旋糖酐的分布,也即质核比,以确定2 MDa右旋糖酐细胞核的途径和时机。结果表明,挤出法不影响K562细胞的生长和增殖。核孔膜孔径和递送材料分子量是影响递送效率的重要因素,孔径越小,则递送效率越高,同时孔径越小,则细胞的死亡率也越高。2 MDa右旋糖酐通过挤出诱导的核膜破裂进入细胞核,并在核膜修复后保持了质核比的稳定。总之,基于核孔膜的挤出法可用于诱导脂质囊泡的膜融合并用于构建杂化外泌体,有望成为新的外泌体修饰方法;此外,基于核孔膜的挤出法可用于递送各种大分子至贴壁细胞CT26和悬浮细胞K562,有望成为新的物理性细胞内递送方法。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2019-05-01）
王璨,马卓,闫冬莹,刘畅,邓宇[3]（2018）在《锰干扰SNARE复合物介导的囊泡融合的分子机制》一文中研究指出目的锰是人体必需微量元素之一,参与体内重要的代谢过程,但环境中的锰过量蓄积于脑内则会干扰突触囊泡融合,影响神经递质释放,进而导致神经毒性。我们前期研究发现锰可以通过影响SNARE复合物(soluble NSF accessory protein receptor)核心蛋白SNAP-25和VAMP-2的表达,从而干扰SNARE复合物形成。为了探寻其机制,本研究应用SH-SY5Y细胞建立体外模型,用钙蛋白酶抑制剂——calpeptin抑制钙蛋白酶(calpain)活性,利用shRNA干扰技术,抑制α-Syn表达,进一步探讨SNAP-25裂解及α-Syn过表达在锰干扰SNARE复合物形成中的作用,为锰致神经毒性机制的研究提供实验依据。方法实验分为8个剂量组,分别为对照组,100μM锰处理组,4μM calpeptin对照组,4μM calpeptin+100μM锰预处理组,shRNA转染组,shRNA转染+100μM锰处理组,错译shRNA转染组,错译shRNA转染+100μM锰处理组。观察细胞活力及培养液中LDH的释放量,测定细胞内Ca~(2+)浓度及calpain活性,测定SNARE复合物相关蛋白的基因及蛋白表达,检测α-Syn与VAMP-2及Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用,以及活动性突触囊泡的释放。结果锰处理组LDH释放量,细胞凋亡率,α-Syn及VAMP-2的mRNA和蛋白表达均升高,SNAP-25蛋白表达下降并出现N端裂解碎片,并且使α-Syn与VAMP-2之间的相互作用增强,Synaptophysin与VAMP-2之间的相互作用减弱,FM1-43标记的突触囊泡释放减少。4μM calpeptin+100μM锰处理组预处理组SNAP-25蛋白表达明显增加,且碎片消失,突触囊泡释放增多。shRNA干扰α-Syn表达模型,可以有效的降低α-Syn mRNA和蛋白的表达达到80%以上。用100μM锰分别处理α-Syn抑制细胞和正常细胞发现,细胞损伤程度明显下降,并且α-Syn与VAMP-2之间的相互作用也减弱,突触囊泡释放增多。4μM calpeptin单纯处理组及携带错译shRNA慢病毒的细胞对各项指标没有影响。结论锰诱导calpain活化可裂解SNAP-25,α-Syn过表达会与VAMP-2结合增多,影响SNARE复合物的形成,从而导致囊泡释放紊乱。(本文来源于《2018环境与健康学术会议--精准环境健康：跨学科合作的挑战论文汇编》期刊2018-08-13）
黄春明[4]（2018）在《低氧及微囊泡对细胞融合的作用机制研究》一文中研究指出细胞融合是指两个或两个以上的亲代细胞通过发生细胞膜融合、细胞质混合甚至细胞核融合后形成杂交细胞的现象。通过细胞融合,子代细胞具有双亲代细胞的表型。细胞融合能够促进肿瘤细胞发生侵袭、转移,对肿瘤的发展具有重要意义。同时,肿瘤微环境的建立,对肿瘤的生存及发展具有重要作用。然而,肿瘤微环境和细胞融合在肿瘤的发展过程中的具体作用并未得到证实,其调控作用及机制目前尚不清楚。肿瘤微环境与肿瘤的进展密切相关。目前研究证实,低氧使得肿瘤发生EMT,从而能够上皮样细胞的极性发生改变,上皮特异性蛋白E-钙黏素(E-Cad)表达降低而间质特异性蛋白N-钙黏素(N-Cad)表达增加,使得癌细胞在细胞与细胞之间的束缚降低,肿瘤细胞从瘤体上脱落,更加利于肿瘤细胞的转移,这和细胞融合状态表现是类似的。有学者将两者之间的联系一起进行讨论,但缺乏相关实验的支撑。细胞外囊泡是细胞膜源性的细胞释放的囊性结构,其内包含了大量的生物活性物质(如蛋白、RNA、脂类等),对靶细胞的调节具有重要作用,有助于塑造和改造肿瘤微环境。可以按尺寸来区分可以分为:20-100nm的外泌体和100-1OOOnm的微囊泡。作为肿瘤微环境的一员,对肿瘤的增殖、侵袭、转移都有重要作用。微环境中的间质细胞可以接受肿瘤细胞释放的囊泡,从而改变自己以适应肿瘤的增殖、侵袭、转移。内皮细胞是重要的一类间质细胞,肿瘤的血性转移必须破坏血管内皮的完整性,从而有位置予以肿瘤细胞生长或者转移进入血管腔内。一方面可以通过肿瘤的直接接触或者间接接触改变内皮的极性,从而破坏了内皮的完整性,也可以通过肿瘤细胞和内皮细胞融合,直接破坏内皮细胞的完整性。肿瘤源性微囊泡可以将内皮细胞改造成更加适合与肿瘤细胞融合的状态,一方面增加细胞融合的可能性,直接破坏血管内皮的完整性,一方面也改变了内皮细胞的极性,两者都为肿瘤的转移提供了便利。本研究通过观察低氧及微囊泡对口腔鳞癌细胞和黏膜上皮细胞或者内皮细胞融合中的作用,并进一步探讨低氧促进细胞融合的可能作用机制。第一部分低氧促进CAL-27/HIOEC融合的初步研究目的:探讨低氧对口腔鳞癌细胞与人永生化上皮细胞(HIOEC)融合的调控作用,及EMT在其中所起的作用。方法:利用慢病毒空载体将口腔鳞癌细胞系CAL-27及人永生化上皮细胞分别转染红色荧光蛋白(RFP-)及绿色荧光蛋白(GFP-)。将两者转染72小时后,通过嘌呤霉素和流式细胞荧光分选技术(FACS)筛选出荧光强度较为稳定的细胞株:染有红色荧光的CAL-27(RFP-CAL-27)以及染有绿色荧光的HIOEC(GFP-HIOEC);然后将等量的RFP-CAL-27和GFP-HIOEC共培养,利用普通荧光显微镜(FM)观察细胞融合情况及计数;在共聚焦专用观察皿内共培养RFP-CAL-27和GFP-HIOEC3天,固定后利用DAPI染色细胞核,通过激光扫描共聚焦荧光显微镜(LSCM)观察融合细胞形态。将等量的GFP-HIOEC与RFP-CAL-27在1.0%02,37℃培养箱共培养,连续观察。分别在第1、3天,随便选取6个视野,利用人工计数法(Artificial Cell Counting)分别计算出低氧实验组及对照组融合细胞的数目;并在共培养的第3天,利用流式细胞仪技术(FACS),计算出两组共培养体系的细胞融合率,从而探究低氧对CAL-27与HIOEC细胞融合的影响。将HIOEC在低氧培养箱(1.0%O2,37℃)培养24小时后,提取蛋白,进行Western Blot检测,检测EMT指标。并将GFP-HIOEC在低氧培养箱(1.0%O2,37℃)培养24小时后,再与RFP-CAL-27在常氧环境下共培养3天,采用人工计数法和流式细胞术检测融合细胞率。再予以低氧及(或)DAPT(EMT的一种阻滞剂),并再次检测EMT指标,并采用人工计数法和流式细胞术检测融合细胞率。结果:1.FM观察结果显示:CAL-27与HIOEC能够发生自发融合,融合细胞呈现橙色荧光,且荧光强度较为稳定。2.LSCM观察结果显示:融合细胞胞膜完整,无皱缩及发泡现象;核膜完整,细胞核无固缩现象。3.人工计数法统计结果表明:两组共培养体系中融合细胞数目都随着时间的变化而增加;而低氧实验组的融合细胞数目明显多于对照组,约1.5-2倍(P<0.05)。4.FACS实验结果显示:实验组细胞融合率为0.85%±0.06%,而对照组融合率为0.39%±0.08%。两组实验结果的差异具有明显的统计学意义(P<0.05)。5.通过低氧预处理后,HIOEC可以发生EMT。人工计数和FACS统计分析发现低氧预处理组较对照组,具有更高的融合率。6.通过DAPT部分阻断EMT后,其融合率也明显下降。结论:综合FM,LSCM,人工计数法与FACS分析结果,证实了 口腔鳞癌细胞CAL-27与人永生化上皮细胞HIOEC能够发生自发融合。低氧能介导CAL-27与HIOEC细胞融合。EMT是低氧介导二者融合增效作用的一种机制。第二部分微囊泡调控CAL-27/HUVEC融合的机制研究目的:探讨微囊泡对CAL-27和HUVEC细胞融合的影响,并探究VCAM-1在微囊泡促进CAL-27与HUVEC融合中的潜在作用。方法:差速离心法提取CAL-27释放的微囊泡(TMVs),通过扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、动态光散射等方法验证TMVs。将TMVs加入到RFP-CAL-27与GFP-HUVEC的共培养体系,共培养3天后,采用人工计数法和FACS分别统计融合细胞数和细胞融合率。将TMVs与HUVEC共培养,分别于6、12、24h通过实时逆转录PCR技术(quantitative Real-time RT-PCR)检测 VCAM-1mRNA 的表达量。使用siRNA干扰GFP-HUVEC中的VCAM-1的表达,将TMVs加入(或不加)到siRNA干扰后的GFP-HUVEC(或无干扰的GFP-HUVEC)与RFP-CAL-27的共培养体系中,连续观察3天,在第1、3天利用人工计数法计算融合细胞数目;并利用FACS检测第叁天的细胞融合率。结果:1.人工计数法和FACS结果显示:TMVs刺激组较对照组,融合细胞数和细胞融合率的差异均有统计学意义(p<0.05)。2.RT-PCR显示:TMVs刺激后,VCAM-1的表达增加,且在第6h时,达到峰值。3.VCAM-1沉默后,利用人工计数法计算融合细胞数量。结果显示siRNA干扰组融合细胞数明显低于对照组(P<0.05)。FACS结果显示:对照组细胞融合率为1.29%±0.05%,明显高于siRNA干扰组(0.94%±0.15%),两者具有显着的统计学差异(P<0.05)。结论:TMVs正向调控HUVEC中VCAM-1的表达,从而影响CAL-27与HUVEC细胞融合。第叁部分微囊泡内miR-146a-5p对CAL-27/HUVEC融合的作用研究目的:探讨常氧和低氧刺激下CAL-27来源的微囊泡(TMVs)在促进CAL-27与HUVEC细胞融合的潜在分子机制,重点关注微囊泡的内容物miR-146a-5p对CAL-27与HUVEC细胞融合的影响。方法:通过实时定量逆转录PCR技术(quantitative Real-time RT-PCR)检测HUVEC、CAL-27、TMVs 内含有 miR-146a-5p 的表达。通过对 HUVEC 转染 miR-146a-5p mimics和inhibitor,观察CAL-27和实验组与对照组HUVEC的融合率的差别。并通过RT-PCR检测常氧和低氧状态下CAL-27释放的TMVs的miR-146a-5p的变化,以及这种改变对细胞融合的影响。并将miR-146a-5p转染入CAL-27,提取转染后的TMVs,检验TMVs内miR-146a-5p的含量,对比单纯的TMVs和转染后TMVs后对融合的影响。结果:1.RT-PCR结果显示:CAL-27内含有miR-146a-5p的表达。且相对HIOEC、口腔角质化细胞(OKC)、HGF和HUVEC,CAL-27表达量较高。2.RT-PCR 结果显示:miR-146a-5p mimics 和 inhibitor 转染入 HUVEC 的效率较高。3.相较对照组的HUVEC,转染mimics和inhibitor的HUVEC和CAL-27的融合情况发生了明显改变。转染miR-146a-5p mimics的HUVEC的融合率人工计数融合细胞和FACS检测的细胞融合率明显提高了,而转染入miR-146a-5p inhibitor的HUVEC的融合率人工计数法和FACS统计明显降低了。4.低氧促进CAL-27表达miR-146a-5p,能促进HUVEC和CAL-27的融合。并且低氧处理后提取的TMVs所含miR-146a-5p量也增加。低氧处理后提取的TMVs能促进二者的融合。5.Mimics 和 inhibitor 转染入 CAL-27 后,提取的 TMVs 中的 miR-146a-5p 的表达也发生了明显改变。TMVs(NC、mimics、inhibitor)刺激HUVEC后,人工计数法和FACS统计融合率也有显着性差异。结论:miR-146a-5p能够介导CAL-27与HUVEC细胞融合。肿瘤细胞表达的miR-146a-5p能够通过TMVs传递至HUVEC,增强HUVEC与CAL-27的融合能力。低氧可以促进CAL-27表达miR-146a-5p并能通过载体TMVs调控二者融合。综上所述,我们可以得知,在肿瘤微环境中,低氧和微囊泡能促进细胞融合,在融合过程,低氧、EMT、促融合蛋白VCAM-1和TMVs均在融合过程起到了重要作用;低氧一方面可以促进HIOEC发生EMT,从而促进其与CAL-27发生融合。另一方面,低氧能增加TMVs内miR-146a-5p的表达来影响CAL-27/HUVEC细胞融合。以上均是低氧促进细胞融合的机制。(本文来源于《武汉大学》期刊2018-04-01）
孙盼盼,郑利强[5]（2017）在《基于弱相互作用构筑的囊泡及囊泡融合体系的研究》一文中研究指出囊泡是两亲分子在溶液中形成的分子双层发生弯曲闭合而构筑的层状聚集体。由于其独特的结构,在生物膜、药物释放以及微反应器领域受到了广泛的关注。本工作通过弱相互作用构筑了两亲分子[MimA-DBS]_2-EDA和[MimA-DS]_2-EDA,并通过调节溶液的pH实现了囊泡和囊泡融合的可控自组装。基于氢键和静电引力作用的[MimA-DS]_2-EDA在溶液中仅可以自发形成胶束。而[MimA-DBS]_2-EDA是基于静电引力、氢键和π-π堆积作用构筑而成,在较低pH下形成胶束,而在较高pH下可自发形成囊泡,并随着浓度的升高,出现了囊泡向囊泡簇及管状聚集体的转变。进一步向该体系中加入无机盐(NaCl),[MimA-DBS]_2-EDA头基之间的静电斥力降低,氢键作用增强,促进了囊泡向管状聚集体的转变。(本文来源于《中国化学会第十六届胶体与界面化学会议论文摘要集——第一分会：两亲分子有序组合体》期刊2017-07-24）
陈立强,王洋洋,司艳辉,梁洁玲,李海珠[6]（2015）在《SNAREs蛋白复合物与囊泡融合分子调节机制的研究进展》一文中研究指出细胞内大分子物质及颗粒性物质不能自由穿过细胞膜,必须以囊泡运输的方式进行跨膜转运,囊泡介导的转运方式,无论是正向或是逆向转运,都包括3个主要步骤,分别是外壳蛋白的选择,囊泡的出芽与形成和转运物质的选择[1]。研究表明在囊泡运输过程中N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNAREs)发挥着重要作用,自从SNAREs蛋白复合物被发现,它就作为细胞膜融合的关键组分而被广泛深入研究[2];现(本文来源于《检验医学与临床》期刊2015年10期）
宋锐,顾翔,陈知己,袁伟[7]（2015）在《突触囊泡融合蛋白Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的定位表达》一文中研究指出目的研究突触囊泡融合蛋白Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的表达及定位。方法应用激光共聚焦成像技术,通过免疫荧光单标法检测Munc18-1蛋白在小鼠耳蜗内毛细胞中的表达,免疫荧光双标法检测其与带状突触蛋白Ct BP2的定位关系。结果通过激光共聚焦成像技术检测发现,免疫荧光单标染色显示内毛细胞胞质中有高浓度的Munc18-1蛋白表达,免疫荧光双标染色结果显示Munc18-1蛋白聚集在Ct BP2蛋白附近。结论 Munc18-1蛋白在耳蜗内毛细胞中有表达,聚集在突触蛋白Ct BP2周围,可能与维持突触囊泡融合、胞吐功能紧密相关。(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2015年05期）
何立鹏,屈芳,卜伟锋[8]（2014）在《超分子囊泡融合现象的研究》一文中研究指出囊泡融合问题起源于生物膜融合。由于生物膜融合的复杂性和快速性,科学家们很难通过TEM观察到囊泡融合的系列结构转变中间体。本课题组利用阳离子型的超分子金属聚电解质Fe-MSP和终端带有阴离子的聚苯乙烯ST-Sn的静电组装制备了金属超分子聚合物刷MSBs(Fig.1)1。TEM研究发现该类分子刷在氯仿/甲醇(v/v=1)中自组装形成囊泡结构,同时还清晰地观察到了囊泡融合的一系列结构转变中间体:通过范德华吸引相互作用而靠近的囊泡、囊泡突起、类茎秆和半融合中间体、融合孔洞、逐渐变大的孔洞、最后形成大尺寸的囊泡。这一囊泡融合过程可持续达到6~7小时。通过终端带有磺酸根的聚苯乙烯和阳离子平面型铂(II)配合物的静电自组装所得到的高分子/铂(II)配合物发光杂化材料SBCs在氯仿/甲醇混合溶剂中形成囊泡,同时也清晰地观察到了囊泡融合的一系列结构转变中间体2。(本文来源于《中国化学会第29届学术年会摘要集——第18分会：超分子组装与软物质材料》期刊2014-08-04）
何立鹏[9]（2013）在《Fe（Ⅱ）超分子刷囊泡及其融合现象的研究》一文中研究指出将超分子化学和高分子化学结合,借助分子间弱相互作用,如静电相互作用、金属配位作用、氢键、π-π堆积作用以及亲疏水相互作用等构建星形聚合物、嵌段聚合物、交联聚合物等复杂大分子,是当前高分子领域内的研究热点。超分子聚合物一般对光、电、酸碱等外界刺激有响应,是环境响应性聚合物,这一特性使得它们在药物运输及释放,新颖材料制备等方面有潜在应用价值。以金属配位作用连接金属离子和有机配体,构建金属高分子聚合物。这种金属离子-有机配体嵌段的聚合物能够改善聚合物的电子转移过程、磁性、催化反应和氧化还原的能力,是新型光电材料的良好构筑基元。通过阴阳离子相互吸引,静电组装构建超分子,是最常见的构建超分子聚合物的方法之一。这种方法有自己的缺点,但是这种超分子优点也很突出,制备和功能化简单、能在极性溶剂中弱结合和解离,具有良好的可逆性,这是其它超分子所不能比拟的。因此,基于静电组装的超分子一直是研究的热点。对星状和刷状两种典型的高分子聚合物的研究一直没有停止过。超分子发展到现在,科学家们已经利用氢键,主客体识别、金属配位,静电相互作用等弱相互作用合成了星状聚合物,但是利用非共价键相互作用来设计和制备新颖性能的分子刷聚合物还是鲜有报道的。综上所述,我们以金属配位的方式构建了超分子聚合物主链Fe-MSP,再以静电结合的方式将Fe-MSP和磺酸封端的聚苯乙烯ST-Sn组装成超分子刷MSBs。该分子刷在氯仿／甲醇混合溶剂中自组装成囊泡结构,而且通过SEM和TEM,我们观测到囊泡发生融合,我们研究认为来自Fe-MSP的张力是囊泡融合的关键。我们期望通过这些研究可以为制备功能性超分子刷提供借鉴,还希望本文中观测到的超分子囊泡融合的stalk-like和hemifusion中间体能为今后研究生物膜融合提供理论支持。(本文来源于《兰州大学》期刊2013-05-01）
姜爽,王晓波,袭荣刚,张英鸽[10]（2012）在《AFM观察囊泡融合法形成支撑磷脂膜的微观形成过程》一文中研究指出目的:利用原子力显微镜(AFM)观察重组于云母表面支撑人工磷脂膜的微观形成过程。方法 :冰浴超声法制备磷脂脂质体溶液,囊泡融合法形成人工磷脂双分子层,用AFM进行观察。结果 :利用AFM观察到磷脂在云母表面形成磷脂膜主要经过叁个阶段,依次为磷脂膜形成的初始阶段、连接阶段和融合阶段;磷脂膜微观形成过程的关键节点依次为脂质体囊泡吸附→脂质体囊泡之间发生粘着→脂双层之间形成接触点→磷脂囊泡破裂→形成磷脂分子层→磷脂分子层间流动进行融合形成大片磷脂膜。结论 :AFM可观察磷脂膜的微观形成过程,进而为细胞膜和膜蛋白的功能研究提供基础。(本文来源于《2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集》期刊2012-11-19）
囊泡融合论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
核孔膜作为一种孔径均一和圆柱形孔形的微孔滤膜,已在各行业的精密过滤领域有广泛的应用,基于较小孔径核孔膜(100-300 nm)的挤出法也用于控制脂质体粒径。由此,本文将基于核孔膜的挤出法用于诱导脂质体或脂质囊泡膜融合。首先研究了挤出法能否诱导荧光标记脂质体和空白脂质体膜融合,继而研究了挤出法能否诱导荧光标记脂质体和外泌体发生膜融合。此外,基于物理性细胞内递送技术的原理和研究进展,推测较大孔径附核孔膜(7-11 μm)可用于细胞内递送。分别利用挤出法将荧光标记的右旋糖酐大分子递送至小鼠结肠癌细胞株CT26和人髓性白血病细胞株K562，并对影响递送效率的主要因素进行了初步考察,此外还对不同分子量右旋糖酐是否进入细胞核、入核途径及时机进行了研究。具体研究内容及结果如下:1)挤出法诱导脂质体膜融合制备了空白脂质体和含FRET荧光分子对的标记脂质体,通过挤出法诱导脂质体发生膜融合,动态光散射法(DLS)检测脂质体粒径,激光共聚焦(CLSM)观察脂质体膜融合现象,荧光分光光度计定量检测荧光强度变化并计算膜融合率,以冻融法作为对照;并考察了挤出次数、压力和温度等对膜融合效率的影响。结果显示,挤出法能诱导两种脂质体发生高效膜融合,这可从处理后的脂质体共聚焦照片中荧光强度的变化证实,此外对荧光强度变化的定量分析显示挤出75次时膜融合效率达27%。与冻融法相比,挤出法的膜融合效率相当,但是所制得的膜融合脂质体粒径分布更均一。此外,低挤出压力、生理温度和高挤出次数有利于促进膜融合和脂质混合。2)挤出法构建杂化外泌体从K562上清利用超速离心法提取外泌体,然后与荧光标记脂质体混合后挤出处理诱导膜融合,构建杂化外泌体,并与冻融法进行对照。利用透射电镜对外泌体和杂化外泌体进行观察和鉴定,CLSM观察荧光标记脂质体和外泌体的膜融合现象,DLS检测各种脂质囊泡粒径,利用荧光分光光度法检测荧光强度变化并计算膜融合效率。结果显示,挤出法能诱导脂质体和外泌体膜融合,从而构建杂化外泌体。透射电镜下,杂化外泌体仍然保持了外泌体典型的茶托样结构。CLSM观察证实二者发生了膜融合。与冻融法相比,挤出法(100次)的膜融合效率也即脂质稀释率稍低,但是挤出法制备的杂化外泌体具有均一的粒径,且挤出过程耗时短。3)利用挤出法将右旋糖酐递送入CT26细胞利用挤出法诱导CT26细胞变形及短暂膜穿孔而将不同分子量右旋糖酐递送入细胞内,观察了挤出对细胞贴壁生长和增殖的影响,采用流式细胞术(FACS)分析递送效率和细胞死亡率,并考察了核孔膜孔径和右旋糖酐分子量对递送效率的影响。CLSM观察了细胞内右旋糖酐的亚细胞分布,也即质核比。结果表明,挤出法处理的细胞保持了 CT26的贴壁生长和增殖能力。核孔膜孔径和右旋糖酐分子量影响了细胞内递送效率,孔径和分子量与递送效率负相关。3种不同分子量右旋糖酐在挤出处理后都能进入细胞核,进入细胞核的量与分子量呈负相关。4)利用挤出法将右旋糖酐递送入悬浮细胞K562利用挤出法诱导K562细胞变形及短暂膜穿孔而将不同分子量右旋糖酐递送入细胞内,观察了挤出对细胞生长和增殖的影响,FACS分析递送效率,并考察了核孔膜孔径和右旋糖酐分子量对递送效率的影响。CLSM观察了细胞内右旋糖酐的分布,也即质核比,以确定2 MDa右旋糖酐细胞核的途径和时机。结果表明,挤出法不影响K562细胞的生长和增殖。核孔膜孔径和递送材料分子量是影响递送效率的重要因素,孔径越小,则递送效率越高,同时孔径越小,则细胞的死亡率也越高。2 MDa右旋糖酐通过挤出诱导的核膜破裂进入细胞核,并在核膜修复后保持了质核比的稳定。总之,基于核孔膜的挤出法可用于诱导脂质囊泡的膜融合并用于构建杂化外泌体,有望成为新的外泌体修饰方法;此外,基于核孔膜的挤出法可用于递送各种大分子至贴壁细胞CT26和悬浮细胞K562,有望成为新的物理性细胞内递送方法。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
囊泡融合论文参考文献
[1].王璨.锰干扰SNARE复合物介导的突触囊泡融合导致谷氨酸和γ-氨基丁酸释放障碍的实验研究[D].中国医科大学.2019
[2].秦文娟.核孔膜在诱导脂质囊泡膜融合和细胞内递送的应用研究[D].北京协和医学院.2019
[3].王璨,马卓,闫冬莹,刘畅,邓宇.锰干扰SNARE复合物介导的囊泡融合的分子机制[C].2018环境与健康学术会议--精准环境健康：跨学科合作的挑战论文汇编.2018
[4].黄春明.低氧及微囊泡对细胞融合的作用机制研究[D].武汉大学.2018
[5].孙盼盼,郑利强.基于弱相互作用构筑的囊泡及囊泡融合体系的研究[C].中国化学会第十六届胶体与界面化学会议论文摘要集——第一分会：两亲分子有序组合体.2017
[6].陈立强,王洋洋,司艳辉,梁洁玲,李海珠.SNAREs蛋白复合物与囊泡融合分子调节机制的研究进展[J].检验医学与临床.2015
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[8].何立鹏,屈芳,卜伟锋.超分子囊泡融合现象的研究[C].中国化学会第29届学术年会摘要集——第18分会：超分子组装与软物质材料.2014
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[10].姜爽,王晓波,袭荣刚,张英鸽.AFM观察囊泡融合法形成支撑磷脂膜的微观形成过程[C].2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集.2012
标签：锰; 可溶性N-甲基马来酰胺敏感因子附属蛋白受体; 突触囊泡融合; 神经递质释放;