本文主要研究内容
作者刘云露（2019）在《黄连土壤微生物多样性及其酚酸降解菌筛选与降解机制》一文中研究指出：土壤微生物多样性是影响中药材生长的重要因素,而药材连续种植过程中由根系分泌的酚酸类化感物质对土壤微生物多样性有重要的影响。黄连是一种应用广泛的传统中药材,连作障碍严重限制了黄连的产量和品质,黄连种植土壤中的阿魏酸、对香豆酸、原儿茶酸等酚酸浓度呈逐年增加趋势,这种酚酸的积累被认为是导致黄连连作障碍的主要原因,然而酚酸对黄连土壤微生物多样性的影响尚不明确。随着高通量测序技术在土壤微生物多样性研究中的应用,系统性分析土壤微生物随环境因素的变化变为可能。此外,自然环境中酚酸降解过程非常缓慢,从黄连种植土壤中筛选高效酚酸降解菌株,阐明其降解机理,将为酚酸的生物降解和微生物多样性的恢复奠定基础。目的:采用高通量测序技术分析重庆石柱县不同种植年份的正茬/连作黄连根际土壤微生物群落结构的变化,研究种植黄连对微生物多样性和土壤理化因子的影响。同时结合培养法,分离黄连种植土壤中的微生物,筛选出能够高效降解酚酸的菌株,解析降解途径并阐明相关基因的功能。方法:1.检测土壤理化指标并提取黄连根际土壤微生物总DNA,对16S/ITS扩增子进行高通量测序。对测序结果进行聚类分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、微生物与环境因子的关联性分析,研究不同种植模式和种植年限下土壤微生物的群落结构动态变化。2.采用培养法分离黄连根际土壤微生物,筛选能以酚酸为唯一碳源够生长的微生物,并通过16S/ITS测序进行种属鉴定。高效液相色谱法检测这些菌株的酚酸降解能力,研究底物种类、碳源浓度、培养时间、土壤环境对阿魏酸降的影响。3.利用二代测序技术测定降解菌S.olivochromogenes A035基因组框架图后,BLAST比对分析其中酚酸降解相关基因,使用实时荧光定量PCR检测该菌株中阿魏酸降解相关基因的表达量。4.构建S.olivochromogenes A035的fcs/ech敲除株,确定其在阿魏酸分解代谢中的作用。在大肠杆菌中异源表达fcs/ech所编码的阿魏酰辅酶A合成酶(FCS)和烯酰辅酶A缩醛酶(ECHA),体外酶活试验测定这两个酶对阿魏酸的降解活性。结果:1.扩增子测序结果显示,随着种植年限增加土壤微生物丰度发生明显变化,连作第五年的土壤中细菌的多样性最高,真菌多样性先降低后升高。其中酸杆菌门(Acidobacteria)、被孢霉属(Mortierella)、子囊菌门(Ascomycota)等丰度随种植年限增加而升高。β多样性分析显示随着黄连种植年限的增加土壤中微生物相异系数向0趋近。土壤理化指标显示黄连种植土壤pH偏低,种植年限较长的土壤中微生物与土壤有机质、碱解氮的含量呈正相关。筛选得到的阿魏酸高效降解菌的绝对丰度在正茬/连作土壤中均在第五年时最高。2.从黄连根际土壤微生物中共筛得酚酸降解菌14株,其中阿魏酸降解效率较高的1株真菌和4株放线菌分别鉴定为齿孢青霉(Penicillium daleae)、橄榄色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)、赤色链霉菌(Streptomyces aurantiacus)和诺卡氏菌(Nocardia)。进一步检测其中Penicillium daleae F-0056和Streptomyces olivochromogenesA035这两株菌对阿魏酸的降解特性,发现外源阿魏酸添加量为200μg/ml时,菌株P.daleae F-0056培养72 h时阿魏酸降解率达87.5%,土壤环境下P.daleae F-0056在第6天时对阿魏酸的降解效率达71.8%。S.olivochromogenes A035则具有降解阿魏酸、肉桂酸、苯甲酸、香草酸、对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、原儿茶酸等多种酚酸的能力,土壤中加入该菌后的阿魏酸降解效果明显优于原始土壤,第24天时土壤中阿魏酸被完全降解。3.与菌株具有广谱酚酸降解能力相一致,S.olivochromogenes A035基因组含有编码辅酶A连接酶、辅酶A缩醛酶、苯甲酸双加氧酶、原儿茶酸双加氧酶等酚酸降解过程中关键酶的基因。阿魏酸为唯一碳源培养12h时,阿魏酸降解相关基因的表达量相对于在葡萄糖中生长时均显著上调,分解代谢关键基因fcs和ech表达量分别上调1033倍和1250倍。4.在E.coli BL21中异源表达FCS,纯化获得的目的蛋白能将底物阿魏酸转化为阿魏酰辅酶A,表明fcs基因在阿魏酸转化中起到重要作用。将FCS和ECHA两个酶同时在E.coli BL21中异源表达,获得的FCS/ECHA粗酶能够将底物阿魏酸分解并生成产物香草酸,提示S.olivochromogenes A035中阿魏酸降解与FCS/ECHA这两个酶有关。结论:以上结果表明黄连种植土壤呈酸性且土壤微生物组成与pH呈正相关,种植黄连的时间越长对土壤中微生物的群落结构影响越大,酚酸降解菌在黄连种植年份较长的土壤中富集。分离筛选得到酚酸降解菌S.olivochromogenes A035具有广谱的酚酸降解能力,可在土壤环境下高效降解阿魏酸。阿魏酸显著诱导该菌株中相关分解代谢基因的转录,表明该菌株是通过经典的阿魏酰辅酶A合成酶和烯酰辅酶A缩醛酶途径降解阿魏酸。本研究筛选得到多株可高效降解酚酸的微生物,丰富了酚酸降解菌资源库,并为黄连土壤微生物组学研究和黄连连作障碍的修复奠定基础。
Abstract
tu rang wei sheng wu duo yang xing shi ying xiang zhong yao cai sheng chang de chong yao yin su ,er yao cai lian xu chong zhi guo cheng zhong you gen ji fen bi de fen suan lei hua gan wu zhi dui tu rang wei sheng wu duo yang xing you chong yao de ying xiang 。huang lian shi yi chong ying yong an fan de chuan tong zhong yao cai ,lian zuo zhang ai yan chong xian zhi le huang lian de chan liang he pin zhi ,huang lian chong zhi tu rang zhong de a wei suan 、dui xiang dou suan 、yuan er cha suan deng fen suan nong du cheng zhu nian zeng jia qu shi ,zhe chong fen suan de ji lei bei ren wei shi dao zhi huang lian lian zuo zhang ai de zhu yao yuan yin ,ran er fen suan dui huang lian tu rang wei sheng wu duo yang xing de ying xiang shang bu ming que 。sui zhao gao tong liang ce xu ji shu zai tu rang wei sheng wu duo yang xing yan jiu zhong de ying yong ,ji tong xing fen xi tu rang wei sheng wu sui huan jing yin su de bian hua bian wei ke neng 。ci wai ,zi ran huan jing zhong fen suan jiang jie guo cheng fei chang huan man ,cong huang lian chong zhi tu rang zhong shai shua gao xiao fen suan jiang jie jun zhu ,chan ming ji jiang jie ji li ,jiang wei fen suan de sheng wu jiang jie he wei sheng wu duo yang xing de hui fu dian ding ji chu 。mu de :cai yong gao tong liang ce xu ji shu fen xi chong qing dan zhu xian bu tong chong zhi nian fen de zheng cha /lian zuo huang lian gen ji tu rang wei sheng wu qun la jie gou de bian hua ,yan jiu chong zhi huang lian dui wei sheng wu duo yang xing he tu rang li hua yin zi de ying xiang 。tong shi jie ge pei yang fa ,fen li huang lian chong zhi tu rang zhong de wei sheng wu ,shai shua chu neng gou gao xiao jiang jie fen suan de jun zhu ,jie xi jiang jie tu jing bing chan ming xiang guan ji yin de gong neng 。fang fa :1.jian ce tu rang li hua zhi biao bing di qu huang lian gen ji tu rang wei sheng wu zong DNA,dui 16S/ITSkuo zeng zi jin hang gao tong liang ce xu 。dui ce xu jie guo jin hang ju lei fen xi 、Alphaduo yang xing fen xi 、Betaduo yang xing fen xi 、wei sheng wu yu huan jing yin zi de guan lian xing fen xi ,yan jiu bu tong chong zhi mo shi he chong zhi nian xian xia tu rang wei sheng wu de qun la jie gou dong tai bian hua 。2.cai yong pei yang fa fen li huang lian gen ji tu rang wei sheng wu ,shai shua neng yi fen suan wei wei yi tan yuan gou sheng chang de wei sheng wu ,bing tong guo 16S/ITSce xu jin hang chong shu jian ding 。gao xiao ye xiang se pu fa jian ce zhe xie jun zhu de fen suan jiang jie neng li ,yan jiu de wu chong lei 、tan yuan nong du 、pei yang shi jian 、tu rang huan jing dui a wei suan jiang de ying xiang 。3.li yong er dai ce xu ji shu ce ding jiang jie jun S.olivochromogenes A035ji yin zu kuang jia tu hou ,BLASTbi dui fen xi ji zhong fen suan jiang jie xiang guan ji yin ,shi yong shi shi ying guang ding liang PCRjian ce gai jun zhu zhong a wei suan jiang jie xiang guan ji yin de biao da liang 。4.gou jian S.olivochromogenes A035de fcs/echqiao chu zhu ,que ding ji zai a wei suan fen jie dai xie zhong de zuo yong 。zai da chang gan jun zhong yi yuan biao da fcs/echsuo bian ma de a wei xian fu mei Age cheng mei (FCS)he xi xian fu mei Asu quan mei (ECHA),ti wai mei huo shi yan ce ding zhe liang ge mei dui a wei suan de jiang jie huo xing 。jie guo :1.kuo zeng zi ce xu jie guo xian shi ,sui zhao chong zhi nian xian zeng jia tu rang wei sheng wu feng du fa sheng ming xian bian hua ,lian zuo di wu nian de tu rang zhong xi jun de duo yang xing zui gao ,zhen jun duo yang xing xian jiang di hou sheng gao 。ji zhong suan gan jun men (Acidobacteria)、bei bao mei shu (Mortierella)、zi nang jun men (Ascomycota)deng feng du sui chong zhi nian xian zeng jia er sheng gao 。βduo yang xing fen xi xian shi sui zhao huang lian chong zhi nian xian de zeng jia tu rang zhong wei sheng wu xiang yi ji shu xiang 0qu jin 。tu rang li hua zhi biao xian shi huang lian chong zhi tu rang pHpian di ,chong zhi nian xian jiao chang de tu rang zhong wei sheng wu yu tu rang you ji zhi 、jian jie dan de han liang cheng zheng xiang guan 。shai shua de dao de a wei suan gao xiao jiang jie jun de jue dui feng du zai zheng cha /lian zuo tu rang zhong jun zai di wu nian shi zui gao 。2.cong huang lian gen ji tu rang wei sheng wu zhong gong shai de fen suan jiang jie jun 14zhu ,ji zhong a wei suan jiang jie xiao lv jiao gao de 1zhu zhen jun he 4zhu fang xian jun fen bie jian ding wei chi bao qing mei (Penicillium daleae)、gan lan se lian mei jun (Streptomyces olivochromogenes)、chi se lian mei jun (Streptomyces aurantiacus)he nuo ka shi jun (Nocardia)。jin yi bu jian ce ji zhong Penicillium daleae F-0056he Streptomyces olivochromogenesA035zhe liang zhu jun dui a wei suan de jiang jie te xing ,fa xian wai yuan a wei suan tian jia liang wei 200μg/mlshi ,jun zhu P.daleae F-0056pei yang 72 hshi a wei suan jiang jie lv da 87.5%,tu rang huan jing xia P.daleae F-0056zai di 6tian shi dui a wei suan de jiang jie xiao lv da 71.8%。S.olivochromogenes A035ze ju you jiang jie a wei suan 、rou gui suan 、ben jia suan 、xiang cao suan 、dui qiang ji ben jia suan 、dui qiang ji rou gui suan 、yuan er cha suan deng duo chong fen suan de neng li ,tu rang zhong jia ru gai jun hou de a wei suan jiang jie xiao guo ming xian you yu yuan shi tu rang ,di 24tian shi tu rang zhong a wei suan bei wan quan jiang jie 。3.yu jun zhu ju you an pu fen suan jiang jie neng li xiang yi zhi ,S.olivochromogenes A035ji yin zu han you bian ma fu mei Alian jie mei 、fu mei Asu quan mei 、ben jia suan shuang jia yang mei 、yuan er cha suan shuang jia yang mei deng fen suan jiang jie guo cheng zhong guan jian mei de ji yin 。a wei suan wei wei yi tan yuan pei yang 12hshi ,a wei suan jiang jie xiang guan ji yin de biao da liang xiang dui yu zai pu tao tang zhong sheng chang shi jun xian zhe shang diao ,fen jie dai xie guan jian ji yin fcshe echbiao da liang fen bie shang diao 1033bei he 1250bei 。4.zai E.coli BL21zhong yi yuan biao da FCS,chun hua huo de de mu de dan bai neng jiang de wu a wei suan zhuai hua wei a wei xian fu mei A,biao ming fcsji yin zai a wei suan zhuai hua zhong qi dao chong yao zuo yong 。jiang FCShe ECHAliang ge mei tong shi zai E.coli BL21zhong yi yuan biao da ,huo de de FCS/ECHAcu mei neng gou jiang de wu a wei suan fen jie bing sheng cheng chan wu xiang cao suan ,di shi S.olivochromogenes A035zhong a wei suan jiang jie yu FCS/ECHAzhe liang ge mei you guan 。jie lun :yi shang jie guo biao ming huang lian chong zhi tu rang cheng suan xing ju tu rang wei sheng wu zu cheng yu pHcheng zheng xiang guan ,chong zhi huang lian de shi jian yue chang dui tu rang zhong wei sheng wu de qun la jie gou ying xiang yue da ,fen suan jiang jie jun zai huang lian chong zhi nian fen jiao chang de tu rang zhong fu ji 。fen li shai shua de dao fen suan jiang jie jun S.olivochromogenes A035ju you an pu de fen suan jiang jie neng li ,ke zai tu rang huan jing xia gao xiao jiang jie a wei suan 。a wei suan xian zhe you dao gai jun zhu zhong xiang guan fen jie dai xie ji yin de zhuai lu ,biao ming gai jun zhu shi tong guo jing dian de a wei xian fu mei Age cheng mei he xi xian fu mei Asu quan mei tu jing jiang jie a wei suan 。ben yan jiu shai shua de dao duo zhu ke gao xiao jiang jie fen suan de wei sheng wu ,feng fu le fen suan jiang jie jun zi yuan ku ,bing wei huang lian tu rang wei sheng wu zu xue yan jiu he huang lian lian zuo zhang ai de xiu fu dian ding ji chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西南大学的刘云露，发表于刊物西南大学2019-09-24论文，是一篇关于黄连论文,扩增子测序论文,土壤微生物论文,酚酸论文,阿魏酸降解菌论文,西南大学2019-09-24论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西南大学2019-09-24论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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