本文主要研究内容
作者梅永超（2019）在《大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌群体感应基因halI/R的克隆、表达及功能初析》一文中研究指出：蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei）是一种杆状革兰氏阴性细菌,为肠杆菌科哈夫尼亚菌属的代表性细菌。因其具有嗜冷、喜好厌氧潮湿环境等特点,常常成为低温贮藏食品中的特定腐败菌（Specific Spoilage Organisms,SSO）。研究表明,其致腐行为受由N-酰基-高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）介导的lux型群体感应系统的调控。因此,本文以腐败大菱鲆中分离纯化得到的一株蜂房哈夫尼亚菌Ha-01为研究对象,通过基因工程和生物信息学等技术研究其菌株内的lux型群体感应调控基因halI/R,初步探究二者编码的HalI/R蛋白的功能性质,并讨论二者能否对蜂房哈夫尼亚菌生物膜的形成起到调控作用。研究旨在探讨由群体感应系统调节的鱼类腐败机制,为建立以靶向控制群体感应系统为基础的水产品保鲜新技术提供理论依据。1.根据GenBank中登录halI/R基因序列设计特异性扩增全长引物,利用TA克隆技术构建克隆载体pMD-halI和pMD-halR,并导入宿主E.coli JM109中大量扩增;后经测序及BLAST比对分析,结果显示由蜂房哈夫尼亚菌Ha-01中克隆、测序获取的基因片段序列与已登录的halI/R基因序列相似度分别达100%和99%,这表明大菱鲆源蜂房哈夫尼亚菌Ha-01中确实存在群体感应基因halI及halR。2.从halI/R基因编码的氨基酸序列出发,预测了HalI/R蛋白的基本性质,其中HalI大小为25.06 KDa、理论等电点为5.46,HalR大小为27.97KDa、理论等电点为6.98;疏水性分析表明二者均为亲水性蛋白;不含有信号肽和跨膜区表明二者均为非分泌蛋白,可能在胞内有可溶性表达;功能区预测显示二者分别具有自诱导物合成酶特征结构、LuxR型蛋白的HTH特征结构;二级结构和立体结构预测结果表明它们具有明显的构象差异,且预测的三维模型质量良好可用于后续分子对接研究;蛋白交互作用结果表明二者可构成一套群体感应系统,并对细菌生物膜的产生具有调控作用。另一方面,从halI/R基因的核酸序列出发对它们的密码子使用偏向性进行了分析,结果表明二者宜用大肠杆菌表达系统进行表达。3.将目的基因进行密码子优化以提高理论表达效率;利用In-fusion克隆技术成功构建出重组表达质粒pET22-halI和pET28-halR,转化至宿主菌E.coli BL21（DE3）进行诱导表达,诱导条件为37℃,1mM IPTG诱导4 h;SDS-PAGE和Western Blotting结果表明,二者均能在大肠杆菌宿主BL21（DE3）内实现高效表达,且部分为胞内可溶性表达。4.生物感应器菌株CV026产色实验和GC-MS分析结果表明HalI蛋白能够合成AHLs类信号分子C6-HSL,其在蜂房哈夫尼亚菌QS系统中起自诱导物合成酶的功能;体外结合实验和分子对接结果表明HalR蛋白主要以氢键作用结合C6-HSL,其在蜂房哈夫尼亚菌QS系统中起受体蛋白的功能;此外,生物膜的相关结果表明,二者构成的HalI/R群体感应系统对蜂房哈夫尼亚菌Ha-01生物膜的形成具有明显的调控作用。
Abstract
feng fang ha fu ni ya jun （Hafnia alvei）shi yi chong gan zhuang ge lan shi yin xing xi jun ,wei chang gan jun ke ha fu ni ya jun shu de dai biao xing xi jun 。yin ji ju you shi leng 、xi hao ya yang chao shi huan jing deng te dian ,chang chang cheng wei di wen zhu cang shi pin zhong de te ding fu bai jun （Specific Spoilage Organisms,SSO）。yan jiu biao ming ,ji zhi fu hang wei shou you N-xian ji -gao si an suan nei zhi （N-acyl-homoserine lactones,AHLs）jie dao de luxxing qun ti gan ying ji tong de diao kong 。yin ci ,ben wen yi fu bai da ling ping zhong fen li chun hua de dao de yi zhu feng fang ha fu ni ya jun Ha-01wei yan jiu dui xiang ,tong guo ji yin gong cheng he sheng wu xin xi xue deng ji shu yan jiu ji jun zhu nei de luxxing qun ti gan ying diao kong ji yin halI/R,chu bu tan jiu er zhe bian ma de HalI/Rdan bai de gong neng xing zhi ,bing tao lun er zhe neng fou dui feng fang ha fu ni ya jun sheng wu mo de xing cheng qi dao diao kong zuo yong 。yan jiu zhi zai tan tao you qun ti gan ying ji tong diao jie de yu lei fu bai ji zhi ,wei jian li yi ba xiang kong zhi qun ti gan ying ji tong wei ji chu de shui chan pin bao xian xin ji shu di gong li lun yi ju 。1.gen ju GenBankzhong deng lu halI/Rji yin xu lie she ji te yi xing kuo zeng quan chang yin wu ,li yong TAke long ji shu gou jian ke long zai ti pMD-halIhe pMD-halR,bing dao ru su zhu E.coli JM109zhong da liang kuo zeng ;hou jing ce xu ji BLASTbi dui fen xi ,jie guo xian shi you feng fang ha fu ni ya jun Ha-01zhong ke long 、ce xu huo qu de ji yin pian duan xu lie yu yi deng lu de halI/Rji yin xu lie xiang shi du fen bie da 100%he 99%,zhe biao ming da ling ping yuan feng fang ha fu ni ya jun Ha-01zhong que shi cun zai qun ti gan ying ji yin halIji halR。2.cong halI/Rji yin bian ma de an ji suan xu lie chu fa ,yu ce le HalI/Rdan bai de ji ben xing zhi ,ji zhong HalIda xiao wei 25.06 KDa、li lun deng dian dian wei 5.46,HalRda xiao wei 27.97KDa、li lun deng dian dian wei 6.98;shu shui xing fen xi biao ming er zhe jun wei qin shui xing dan bai ;bu han you xin hao tai he kua mo ou biao ming er zhe jun wei fei fen bi dan bai ,ke neng zai bao nei you ke rong xing biao da ;gong neng ou yu ce xian shi er zhe fen bie ju you zi you dao wu ge cheng mei te zheng jie gou 、LuxRxing dan bai de HTHte zheng jie gou ;er ji jie gou he li ti jie gou yu ce jie guo biao ming ta men ju you ming xian de gou xiang cha yi ,ju yu ce de san wei mo xing zhi liang liang hao ke yong yu hou xu fen zi dui jie yan jiu ;dan bai jiao hu zuo yong jie guo biao ming er zhe ke gou cheng yi tao qun ti gan ying ji tong ,bing dui xi jun sheng wu mo de chan sheng ju you diao kong zuo yong 。ling yi fang mian ,cong halI/Rji yin de he suan xu lie chu fa dui ta men de mi ma zi shi yong pian xiang xing jin hang le fen xi ,jie guo biao ming er zhe yi yong da chang gan jun biao da ji tong jin hang biao da 。3.jiang mu de ji yin jin hang mi ma zi you hua yi di gao li lun biao da xiao lv ;li yong In-fusionke long ji shu cheng gong gou jian chu chong zu biao da zhi li pET22-halIhe pET28-halR,zhuai hua zhi su zhu jun E.coli BL21（DE3）jin hang you dao biao da ,you dao tiao jian wei 37℃,1mM IPTGyou dao 4 h;SDS-PAGEhe Western Blottingjie guo biao ming ,er zhe jun neng zai da chang gan jun su zhu BL21（DE3）nei shi xian gao xiao biao da ,ju bu fen wei bao nei ke rong xing biao da 。4.sheng wu gan ying qi jun zhu CV026chan se shi yan he GC-MSfen xi jie guo biao ming HalIdan bai neng gou ge cheng AHLslei xin hao fen zi C6-HSL,ji zai feng fang ha fu ni ya jun QSji tong zhong qi zi you dao wu ge cheng mei de gong neng ;ti wai jie ge shi yan he fen zi dui jie jie guo biao ming HalRdan bai zhu yao yi qing jian zuo yong jie ge C6-HSL,ji zai feng fang ha fu ni ya jun QSji tong zhong qi shou ti dan bai de gong neng ;ci wai ,sheng wu mo de xiang guan jie guo biao ming ,er zhe gou cheng de HalI/Rqun ti gan ying ji tong dui feng fang ha fu ni ya jun Ha-01sheng wu mo de xing cheng ju you ming xian de diao kong zuo yong 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自渤海大学的梅永超，发表于刊物渤海大学2019-10-16论文，是一篇关于大菱鲆论文,蜂房哈夫尼亚菌论文,群体感应论文,基因克隆论文,功能分析论文,渤海大学2019-10-16论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自渤海大学2019-10-16论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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