王志坚1张志扬2郑关毅3
(1福建福州神经精神病防治院福建福州350000；2福建泉州安溪县铭选医院福建泉州352400）
（3福建协和医院福建福州350000)
【关键词】毛冬青甲素脑缺血再灌注血管新生Ang-1
【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）24-0166-02
血管生成素（Ang-1)及其受体（Tie-2）与血管内皮生长因子（VEGF）协同参与生理和病理性血管形成[1]。毛冬青甲素（IlexoninA）是由中药毛冬青提纯的18-去氢乌索酸经琥珀酰化所得的五环三萜类化合物，近些年的研究表明其具有抗炎、抗血栓形成、改善血液循环等广泛的药理作用[2]。本研究的目的是通过毛冬青甲素，对其能否促进大鼠脑缺血再灌注后血管生成素的表达进行观察，从而对毛冬青甲素促进血管新生作用进行进一步探讨。
1一般资料
1.1实验动物和主要药物试剂
选成年雄性SD大鼠72只，体重250～260g，清洁级，分假手术组、模型组、毛冬青甲素治疗组（简称治疗组），3组中每一组按缺血2h再灌注观察3、7、14、28d再分4组，每组各6只。毛冬青甲素购自广东省博罗先锋药业；水合氯醛，北京鼎国生物公司产品，用双蒸水配成10%浓度；Ang-1多克隆抗体（美国SantaCruz公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗山羊IgG（二抗）（美国VECTOR公司）；WesternblotKit（美国KPL公司）。
1.2动物模型制作
模型组和治疗组用10％的水合氯醛（300mg／kg）腹腔注射麻醉后，采用Longa等[3]的线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线栓建立大脑中动脉阻塞（MCAO）模型。线栓插入深度距颈总动脉（CCA）分叉处约（19±0.5）mm，固定线栓结扎缝合，2h后回抽线栓使其头端回到颈外动脉（ECA）内，恢复灌注。大鼠苏醒后出现同侧Horner’s综合征，出现对侧偏瘫，以右上肢为明显，提尾悬拉后出现右转圈，跌倒。假手术组除不插入线栓阻塞外，其余步骤同前。
1.3药物治疗治疗组在脑缺血2h后开始毛冬青注射液腹腔给药（40mg／kg）[4]，每天1次，至处死动物前1d。假手术组和模型组注射等量生理盐水。
1.4标本采集制备及WesternBlotting法检测Ang-1表达的方法
上述大鼠同上述方法麻醉后，用4℃生理盐水200mL行左室快速灌注、取脑，切取缺血灶周边组织，迅速置于液氮中保存后，转入-80℃冰箱备用。将脑组织加裂解液匀浆后，离心取上清，应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配12%分离胶行蛋白SDSPAGE变性电泳，电泳结束后，将蛋白电转印至NC膜;1%脱脂奶粉封闭1h；加Ang-1多克隆抗体（1∶200）4℃过夜；TBST洗膜3×10′；HRP标记兔抗山羊IgG（1∶5000）室温孵育2h；TBST洗膜3×10′，ECL化学发光法显影。采用ImageMaster（r）VDS凝胶成像及分析系统，于可见光下采集底片上的蛋白条带图像，通过与相应β-actin条带密度比较，计算各条带密度相对值。
1.5统计学处理所获数据采用x-±s表示，SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析和t检验。
2.结果
表IA各组大鼠各时相点Ang-1蛋白的表达（x-±s）
治疗组1.76±0.0252）2.93±0.0352）1.69±0.0372）1.50±0.1122）
注：与假手术组比较，1﹚P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。
毛冬青甲素具有抗炎，改善血液循环，抗血栓形成等广泛的药理作用。陈根成等[4]通过毛冬青甲素对肾性高血压脑出血大鼠研究，其表明毛冬青甲素能够降低大鼠红细胞聚集性，降低血液黏度，促进毛细血管增生，改善微循环，加速血肿吸收和脑组织修复，进而改善脑出血的相关临床症状。郑关毅等[5]通过毛冬青甲素对大鼠脑缺血再灌注的实验研究结果表明其能够增加大鼠脑缺血再灌注后GAP-43表达以促进神经元修复再生，从而改善脑缺血的临床症状。Ang-1是继VEGF后发现的一内皮细胞特异性促血管新生因子(endothelium-Specificproangiogenic
factor)家族成员之一[6]。Ang-1主要是在血管形成后期对其基础血管网进行重塑，最终形成具备正常功能又完整，而且有EC和外膜细胞(adventitialcell)的成熟血管网[7]，且维持成熟血管稳定性。
通过上述实验研究结果表明，Ang-1蛋白表达在术后第3天开始升高，第7天达高峰，第14天仍维持较高水平，之后才降低较快。Ang-1表达增加，表明Ang-1参与了脑缺血后血管的修复与再生。在此实验过程中我们毛经冬青甲素治疗后，观察到治疗组的各时相点的蛋白表达与模型组相比都有增加，以7d组增加达高蜂，14d保持在较高水平，28d仍可以见到。这也许是毛冬青甲素通过抗血栓形成，改善微循环，促进毛细血管增生，促使Ang-1于短时间内上调，有利于血管修复再生及功能恢复。但是脑缺血再灌注后血管修复与再生的影响因素及作用机制都是多方面的，本实验仅为毛冬青甲素治疗缺血性脑病提供前期实验，其治疗的具体机制仍有待于进一步深入研究，为毛冬青甲素以后的研究做铺垫。
参考文献
[1]Yancopoulos，DavisS，GaleNW，etal.Vascular-specificgrowthfactorsandbloodvesselformation.Nature，2000.407(6801):242-248.
[2]华海婴，李艳瑛.毛冬青甲素药理作用的研究[J].中国现代医药杂志，2006，8（11）：137-138.
[3]LONGAEZ，WEINSTEINPR，CARLSONS，etal.Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcranicetomyinrats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91.
[4]陈根成，杨志敏，黄培新，等.毛冬青甲素对实验性高血压性脑出血大鼠血压的影响[J].广州中医药大学学报，1996，13(3，4):61.
[5]石旺清，郑关毅.毛冬青甲素对大鼠脑缺血再灌注后GAP-43表达的影响[J].福建中医药，2010，41（2）：46-47.
[6]杜彬，周序珑.血管生成素的特点及其对血管新生的调节作用.中国病理生理杂志，2003，19(2):275-278.
[7]ThurstonG，SuriC，SmithK，etal.Leakage-resistantbloodvesselsinmicetransgenicallyOverexpressingangiopoietin-1.Science，1999，286
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