本文主要研究内容
作者杜立（2019）在《糖基转移酶在海藻糖制备中的应用性能表征、分子改造及其发酵优化》一文中研究指出：海藻糖是一种安全无毒的非还原性二糖,具有稳定和保护生物体或生物大分子等特殊性质,可应用于食品、化妆品、生物制剂、医药和农业等行业。海藻糖能够以淀粉为底物,在麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）的催化作用下制得,成本低廉,生产潜力大。然而,在反应体系中常常会残留麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等低分子量麦芽寡糖副产物,制约着海藻糖产量的提升。添加糖基转移酶,通过其糖基转移反应延长这些低分子量麦芽寡糖的链长,使之能够被MTSase和MTHase进一步催化利用,从而能够提高海藻糖产率。本研究选取了7种不同来源的糖基转移酶应用于海藻糖的制备,从中获得了应用效果最佳的源自Bacillus circulans的环糊精葡萄糖基转移酶（BcCGT）。考察了酶反应结束后的体系组分,发现仍剩余较多以麦芽糖为主的低分子量麦芽寡糖。为了继续提高底物利用率,进一步通过定向进化获得了对麦芽糖受体亲和性增强的突变体M234I,提升了海藻糖产率。在此基础上,将突变体M234I在枯草芽孢杆菌进行重组表达,并在3 L罐水平上实现了突变体M234I的高效制备。主要研究结果如下:（1）合成了源自Arabidopsis thaliana、Archaeoglobus fulgidus和Corynebacterium glutamicum的三种4-α-糖基转移酶（4αGTase）基因并以大肠杆菌为宿主进行异源表达。考察了其与本实验室前期重组表达的源自Paenibacillus macerans、Bacillus stearothermophilus和Bacillus circulans的三种环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）和源自Thermus aquaticus的4-α-糖基转移酶对海藻糖制备的影响,并进行了各酶添加量的优化。结果表明,以浓度为150 g·L-1,DE值16的麦芽糊精为底物时,加入1.8 U·mL-1的源自Bacillus circulans的环糊精葡萄糖基转移酶（BcCGT）时海藻糖产率最高,达到了74.1%,相比对照提高了24.0%。分析酶转化液组分发现,当在反应体系中加入糖基转移酶时,海藻糖含量越高,则葡萄糖含量越多,而麦芽糖和麦芽三糖等低分子量麦芽寡糖越少,同时发现麦芽糖在这些低分子麦芽寡糖中占比最高。（2）为进一步提高海藻糖产率,以大肠杆菌E.coli BL21（DE3）为表达宿主,设计和构建了以提高BcCGT对麦芽糖受体亲和力为目的的高通量筛选体系。经过多批筛选后,获得了一株对麦芽糖受体亲和力提高的突变体M234I,并对野生型酶和突变体进行了分离纯化和酶学定性,发现突变体M234I以麦芽糖为受体的Km降低至野生型的54.4%。将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖,海藻糖转化率进一步提高至77.2%,分析酶反应结束后的组分,发现体系内的葡萄糖和海藻糖含量增加,麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等低分子麦芽寡糖减少。（3）构建带有突变体M234I基因的质粒pHY300PLK-bccgtM234I的枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-bccgtM234I,并优化了重组菌的摇瓶发酵培养基,确认最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为比例为7:1的隆科特玉米浆与大豆蛋白胨。对重组菌在3 L发酵罐中进行发酵并优化了补料培养基的碳氮比,当碳氮比为3:1,最高酶活达到1423.2 U·mL-1。
Abstract
hai zao tang shi yi chong an quan mo du de fei hai yuan xing er tang ,ju you wen ding he bao hu sheng wu ti huo sheng wu da fen zi deng te shu xing zhi ,ke ying yong yu shi pin 、hua zhuang pin 、sheng wu zhi ji 、yi yao he nong ye deng hang ye 。hai zao tang neng gou yi dian fen wei de wu ,zai mai ya gua tang ji hai zao tang ge cheng mei （MTSase）he mai ya gua tang ji hai zao tang shui jie mei （MTHase）de cui hua zuo yong xia zhi de ,cheng ben di lian ,sheng chan qian li da 。ran er ,zai fan ying ti ji zhong chang chang hui can liu mai ya tang 、mai ya san tang he mai ya si tang deng di fen zi liang mai ya gua tang fu chan wu ,zhi yao zhao hai zao tang chan liang de di sheng 。tian jia tang ji zhuai yi mei ,tong guo ji tang ji zhuai yi fan ying yan chang zhe xie di fen zi liang mai ya gua tang de lian chang ,shi zhi neng gou bei MTSasehe MTHasejin yi bu cui hua li yong ,cong er neng gou di gao hai zao tang chan lv 。ben yan jiu shua qu le 7chong bu tong lai yuan de tang ji zhuai yi mei ying yong yu hai zao tang de zhi bei ,cong zhong huo de le ying yong xiao guo zui jia de yuan zi Bacillus circulansde huan hu jing pu tao tang ji zhuai yi mei （BcCGT）。kao cha le mei fan ying jie shu hou de ti ji zu fen ,fa xian reng sheng yu jiao duo yi mai ya tang wei zhu de di fen zi liang mai ya gua tang 。wei le ji xu di gao de wu li yong lv ,jin yi bu tong guo ding xiang jin hua huo de le dui mai ya tang shou ti qin he xing zeng jiang de tu bian ti M234I,di sheng le hai zao tang chan lv 。zai ci ji chu shang ,jiang tu bian ti M234Izai ku cao ya bao gan jun jin hang chong zu biao da ,bing zai 3 Lguan shui ping shang shi xian le tu bian ti M234Ide gao xiao zhi bei 。zhu yao yan jiu jie guo ru xia :（1）ge cheng le yuan zi Arabidopsis thaliana、Archaeoglobus fulgidushe Corynebacterium glutamicumde san chong 4-α-tang ji zhuai yi mei （4αGTase）ji yin bing yi da chang gan jun wei su zhu jin hang yi yuan biao da 。kao cha le ji yu ben shi yan shi qian ji chong zu biao da de yuan zi Paenibacillus macerans、Bacillus stearothermophilushe Bacillus circulansde san chong huan hu jing pu tao tang ji zhuai yi mei （CGTase）he yuan zi Thermus aquaticusde 4-α-tang ji zhuai yi mei dui hai zao tang zhi bei de ying xiang ,bing jin hang le ge mei tian jia liang de you hua 。jie guo biao ming ,yi nong du wei 150 g·L-1,DEzhi 16de mai ya hu jing wei de wu shi ,jia ru 1.8 U·mL-1de yuan zi Bacillus circulansde huan hu jing pu tao tang ji zhuai yi mei （BcCGT）shi hai zao tang chan lv zui gao ,da dao le 74.1%,xiang bi dui zhao di gao le 24.0%。fen xi mei zhuai hua ye zu fen fa xian ,dang zai fan ying ti ji zhong jia ru tang ji zhuai yi mei shi ,hai zao tang han liang yue gao ,ze pu tao tang han liang yue duo ,er mai ya tang he mai ya san tang deng di fen zi liang mai ya gua tang yue shao ,tong shi fa xian mai ya tang zai zhe xie di fen zi mai ya gua tang zhong zhan bi zui gao 。（2）wei jin yi bu di gao hai zao tang chan lv ,yi da chang gan jun E.coli BL21（DE3）wei biao da su zhu ,she ji he gou jian le yi di gao BcCGTdui mai ya tang shou ti qin he li wei mu de de gao tong liang shai shua ti ji 。jing guo duo pi shai shua hou ,huo de le yi zhu dui mai ya tang shou ti qin he li di gao de tu bian ti M234I,bing dui ye sheng xing mei he tu bian ti jin hang le fen li chun hua he mei xue ding xing ,fa xian tu bian ti M234Iyi mai ya tang wei shou ti de Kmjiang di zhi ye sheng xing de 54.4%。jiang tu bian ti M234Iyong yu duo mei fu pei ti ji sheng chan hai zao tang ,hai zao tang zhuai hua lv jin yi bu di gao zhi 77.2%,fen xi mei fan ying jie shu hou de zu fen ,fa xian ti ji nei de pu tao tang he hai zao tang han liang zeng jia ,mai ya tang 、mai ya san tang he mai ya si tang deng di fen zi mai ya gua tang jian shao 。（3）gou jian dai you tu bian ti M234Iji yin de zhi li pHY300PLK-bccgtM234Ide ku cao ya bao gan jun chong zu jun B.subtilis WS11/pHY300PLK-bccgtM234I,bing you hua le chong zu jun de yao ping fa jiao pei yang ji ,que ren zui jia tan yuan wei pu tao tang ,zui jia dan yuan wei bi li wei 7:1de long ke te yu mi jiang yu da dou dan bai dong 。dui chong zu jun zai 3 Lfa jiao guan zhong jin hang fa jiao bing you hua le bu liao pei yang ji de tan dan bi ,dang tan dan bi wei 3:1,zui gao mei huo da dao 1423.2 U·mL-1。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自江南大学的杜立，发表于刊物江南大学2019-10-21论文，是一篇关于海藻糖论文,环糊精葡萄糖基转移酶论文,葡萄糖基转移酶论文,定向进化论文,发酵优化论文,江南大学2019-10-21论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自江南大学2019-10-21论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：海藻糖论文; 环糊精葡萄糖基转移酶论文; 葡萄糖基转移酶论文; 定向进化论文; 发酵优化论文; 江南大学2019-10-21论文;