（苏州大学江苏苏州215000）
【摘要】目的：研究Beagle犬皮下注射重组人胰岛素28天的毒代动力学。方法：18只Beagle犬分成3组，分别以1.5、4.5、10IU/kg皮下注射，每天一次，连续28天。于第1、15、28天用ELISA法测定给药后不同时间重组人胰岛素的血药浓度。结果：在1.5～10IU/kg剂量范围内，单次或多次给药后的AUC和Cmax与剂量呈正比，同剂量下多次给药的Cmax和AUC与单次给药比较未见显著变化(P>0.05)。结论：重组人胰岛素多次给药不会引起药物明显蓄积。
【关键词】重组人胰岛素；Beagle犬；毒代动力学；ELISA
【中图分类号】R458+.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）09-0017-03
ToxicokineticsofRecombinanthumaninsulinfollowingsubcutaneousinjectiontoBeagledogs
ZHENGJia-xin,SUNXiao-ling,ZHAOXiao-fang,YOUZhi-qiang
SoochowUniversity,Suzhou215000,Jiangsu
【Abstract】AIMTostudythetoxicokineticsofrecombinanthumaninsulininBeagledogsbysubcutaneousinjecton,anddiscusstheaccumulativeeffectsofinsulininthebody.Methods18Beagledogs,pidedinto3groups,receivedsubcutaneousinjectionsof1.5、4.5、10IU/kgbodywtofrecombinanthumaninsulinoncedailyfor28days.Plasmaconcentrationofrecombinanthumaninsulinwasmeasuredatvarioustime-pointsafterdosingbyaELISAonDay1、Day15andDay28.ResultsInthedoserangeofpresentstudy,AUCandCmaxwereproportionaltodoseaftersingleandrepeatedadministrationfrom1.5-10IU/kg.TherewerenoobviouschangesofAUCandCmaxafterrepeatedadministrationcomparedwithsingleadministrationofthesamedose.ConclusionRecombinanthumanInsulinhasnosignificantlyaccumulativeeffectsaftersuccessivesubcutaneousinjectionstoBeagledogs.
【Keywords】Recombinanthumaninsulin;Beagledogs;ToxicokineticsELISA
糖尿病DM作为一种慢性病已广为人知，伴随着人们寿命的延长和生活水平进一步的提高，糖尿病将成为21世纪对人类健康造成主要危害的疾病之一[1-2]。重组人胰岛素为利用重组DNA技术生产的人胰岛素，与天然胰岛素有相同的结构和功能，临床上用来治疗糖尿病[3-5]。
本研究是在Beagle犬连续28天皮下注射1.5、4.5、10IU/kg重组人胰岛素的毒性研究中的Day1、Day15和Day28评价重组人胰岛素的全身暴露水平，从而确定暴露水平与剂量及多次给药的相互关系，为临床研究给药方案的设计和优化提供参考信息。
1.材料与方法
1.1药物与试剂
重组人胰岛素注射液，含量：102.2%，浓度：100单位/mL，由江苏万邦生化医药股份有限公司提供。重组人胰岛素标准品，效价：28.3IU/mg，由中国食品药品检定研究院提供。
MercodiaInsulinELISA药盒，瑞典Mercodia公司产品。CanineC-PeptideRIAKit-125T，美国Millipore公司产品。活性碳，sigma公司产品。
1.2仪器
ThermoMultiskanFC酶标仪，ThermoFisher公司；SHZ-28A型水浴恒温振荡器，太仓华美生化仪器有限公司；XP6电子天平，梅特勒-托利多公司。
1.3动物
健康成年Beagle犬22只，雌雄各半，体重6～8kg，6～8月龄，购自苏州西山中科实验动物有限公司，其中4只Beagle犬用于内源性胰岛素生成抑制的评价，另外18只用于毒代动力学研究。
1.4测定方法
1.4.1Beagle犬EDTA空白血浆制备健康Beagle犬空腹取血，EDTA抗凝，4℃、3000rpm离心10min，分离出血浆，将上述血浆按每1L血浆加约20g活性碳的比例加入活性碳，于2～8℃，100rpm条件下混旋过夜后，以2000×g离心20min，离心2次，吸取上清夜，0.22?m滤膜过滤，得到不含内源性胰岛素的Beagle犬空白EDTA血浆，用于配制标准曲线、质控及稀释未知样品。
1.4.2血浆中重组人胰岛素测定方法参考MercodiainsulinELISA试剂盒说明书，精密吸取待测血浆样本25μL加入微孔板中，双复孔，再每孔加100μL酶标抗体，200rpm、22℃保温1h后，甩去孔内液体，洗板5次，每孔加200μL的显色液，室温避光反应15min后每孔加50μL终止液终止反应，于30min内在450nm波长处读取各孔的吸光值。
1.5毒代动力学方案设计
1.5.1内源性胰岛素生成抑制的评价内源性胰岛素的生成主要受血浆中葡萄糖浓度的影响，当给予外源性胰岛素并喂食时，一方面，外源性胰岛素通过降低血糖从而抑制内源性胰岛素的分泌，另一方面，喂食会引起血糖的升高进而刺激内源性胰岛素的分泌。而C-肽和胰岛素是以相等分子分泌进入血液的，推测在外周血中，两者存在一定的比例关系，通过C-肽测定可以推断给药后内源性胰岛素的分泌情况。取4只Beagle犬，雌雄各半，于四种情况测定犬内源性胰岛素及犬C-肽：1）禁食16h后，2）饲喂300g全价营养固性饲料后，3）以1.5IU/kg皮下注射受试制剂，并于给药后饲喂300g全价营养固性饲料，4)以4.5IU/kg皮下注射受试制剂，并于给药后饲喂300g全价营养固性饲料，上述四种情况的取血时间均为给药/饲喂前（0h）和给药/喂食后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8h，EDTA抗凝，离心得到血浆，用MercodiaInsulinELISA试剂盒测定犬内源性胰岛素，用CanineC-PeptideRIAKit-125T测定犬C-肽，得到内源性胰岛素与C-肽二者的比例关系、禁食条件下C-肽基础值以及给药后的C-肽值。
1.5.2毒代动力学研究18只Beagle犬按体重随机分成3组，每组6只，雌雄各半。采用颈背部皮下注射给予重组人胰岛素注射液，剂量分别为1.5、4.5和10IU/kg，连续给药28天。分别于给药第1天、第15天和第28天取血，取血时间为药前及给药后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8h，EDTA抗凝，4℃、3000rpm离心10min，分离出血浆，-80℃保存待测。
1.6数据处理
采用DASver3.1.6按非房室模型处理计算出每只动物的毒代动力学参数；用SPSS13.0软件对组内首次、中期和末次的毒代动力学参数进行统计，P<0.05被认为具有统计学意义。
2.结果
2.1方法学验证
ELISA法测定Beagle犬血浆中重组人胰岛素的方法稳定可靠，在5～200mIU/L浓度范围内，药物浓度与吸光度值呈线性相关，回归方程为：A450=0.002+0.01C(W=1/CC)，相关系数r=0.999，定量下限为5mIU/L；批内和批间精密度符合要求，结果见表1；血浆样品（16IU/L）按1:100～1:1600稀释后的回收率在91.82～99.88%；血浆样品中重组人胰岛素浓度高至80IU/L时未观察到钩状效应；血浆样品（10～180mIU/L）在室温放置4h、-80℃条件下冻融2次、-80℃条件下保存60天后显示浓度稳定（测定值与标示值的偏差在20%以内）。
2.2内源性胰岛素生成抑制的评价
犬内源性胰岛素与C肽有较好的相关性（R2>0.82），见图1，说明通过C肽的测定能反映内源性胰岛素的分泌量变化。当Beagle犬以4.5IU/kg剂量皮下注射胰岛素后，测得的各时间点的C肽值与禁食C肽基础值比较，显著降低，说明给药后外源性胰岛素能显著抑制内源性胰岛素的分泌，当Beagle犬以1.5IU/kg剂量皮下注射胰岛素后，至药后4h，外源性胰岛素能抑制内源性胰岛素的分泌，见图2。因此可认为当给药剂量超过4.5IU/kg时至药后8h、给药为1.5IU/kg时至药后4h，测得的胰岛素浓度即为外源性的重组人胰岛素的浓度。
2.3Beagle犬皮下注射重组人胰岛素的毒代动力学
Beagle犬分别以1.5、4.5和10IU/kg皮下注射，每天1次，连续28天。第1、15、28天的平均血药浓度-时间曲线见图3，主要毒代参数见表2。Beagle犬皮下注射重组人胰岛素后，药物吸收较快，于给药后0.25h即可检测到药物浓度，0.5～2h达峰。
低、中、高三个剂量皮下注射重组人胰岛素后，首次给药1.5、4.5和10IU/kg三个剂量，原型药物的Cmax分别为641.13±153.35，2539.00±662.65，4975.32±3146.66mIU/L，比值为1:3.96:7.76（低：中：高），AUC分别为1110.05±175.26，6620.32±1461.09，17672.06±6717.58mIU/L·h，比值为1：5.96：15.92（低：中：高）（图4）；提示经首次给药后，重组人胰岛素血浆药物暴露量与剂量呈正比。
中次皮下注射三个剂量后，原型药物的Cmax分别为788.45±193.57，2753.28±1203.82，7257.99±1146.15mIU/L，比值为1:3.49:9.21（低：中：高），AUC分别为1439.66±486.50，6639.57±1598.67，19428.20±1841.93mIU/L·h，比值为1:4.61:13.49（低：中：高）（图4）；提示中次给药后，重组人胰岛素血浆药物暴露量与剂量呈正比；Cmax和AUC的数值和比值均与首次给药一致(未出现统计学差异)，提示中次给药后未出现蓄积现象。
末次皮下注射三个剂量后，原型药物的Cmax分别为641.13±153.35，2566.20±1035.08，6755.25±2144.69mIU/L，比值为1：4.00：10.53（低：中：高），AUC分别为1108.61±224.54，6579.12±2028.55，19697.36±3634.70mIU/L·h，比值为1：5.93：17.77（低：中：高）（图4）；提示中次给药后，重组人胰岛素血浆药物暴露量与剂量呈正比；Cmax和AUC的数值和比值均与首次、中次给药一致(未出现统计学差异)，提示末次给药后也未出现明显蓄积。以上结果提示多次皮下注射重组人胰岛素在体内无蓄积。
3.讨论
文献报道，活性碳可去除血浆中激素类物质（包括胰岛素），得到的空白介质可制备标准曲线[6]，因此，本研究中，通过在Beagle犬混和血浆中加入活性炭（Charcoal,DextranCoated）得到空白血浆，在去除內源性胰岛素的同时，又保证了血浆内各成分没有较大的改变[7]，可认为是“零胰岛素”血浆。
重组人胰岛素和内源性的犬胰岛素在结构上只相差一个氨基酸，本研究中的测定方法无法区分这两种物质，为减少内源性犬胰岛素对测定的影响，本试验通过给药后C肽的测定去除了由于喂食而引起的内源性胰岛素的干扰（即低剂量组6h、8h时间点血药浓度），认为测得的胰岛素浓度即为重组人胰岛素浓度。
在重组人胰岛素高剂量组，MRT和Tmax的首次、中次和末次间存在统计学差异，是否具有生物学意义需要进一步结合一般毒性反应、生化指标和病理发现等毒性实验进行判断。
本研究初步探讨了重组人胰岛素注射液在Beagle犬体内的毒代动力学行为，结果显示多次给药不会引起药物在Beagle犬体内明显蓄积。
【参考文献】
[1]ShawJE,SicreeRA,ZimmetPZ.Globalestimatesoftheprevalenceofdiabetesfor2010and2030[J].DiabetesResearch&ClinicalPractice,2010,87(1):4-14.
[2]FreemanJS.Theincreasingepidemiologyofdiabetesandreviewofcurrenttreatmentalgorithms[J].TheJournaloftheAmericanOsteopathicAssociation,2010,110(7Suppl7):eS2-6.
[3]张斌,赖小文,张辉虎.重组人胰岛素和人胰岛素类似物治疗2型糖尿病疗效对照[J].西部医学,2010,22(2):247-248.
[4]祝方,纪立农,韩学尧,等.短期胰岛素强化治疗诱导初诊2型糖尿病患者血糖长期良好控制的临床试验[J].中华糖尿病杂志,2003,11(1):5-9.
[5]金星,连小兰,张军,等.人胰岛素在老年非胰岛素依赖型糖尿病患者中的临床应用[J].中华糖尿病杂志,1993.
[6]BowsherRR,NowatzkeWL.Insightsinregulatedbioanalysisofhumaninsulinandinsulinanalogsbyimmunoanalyticalmethods[J].Bioanalysis,2011,3(8):883.
[7]CarterP.Preparationofligand-freehumanserumforradioimmunoassaybyadsorptiononactivatedcharcoal[J].ClinicalChemistry,1978,24(2):362-4.