一、转基因技术在果蝇及脊椎动物心脏基因研究中的应用（论文文献综述）
陈晨[1]（2021）在《植物挥发性化合物DMNT毒杀小菜蛾的机制解析》文中进行了进一步梳理小菜蛾是危害农业生产的主要植食昆虫之一,依靠取食甘蓝、包菜和油菜等蔬菜和作物为生。由于其啃食能力强,繁殖周期短等特性容易造成虫害爆发。现有的防治方式不能满足对小菜蛾绿色防治的要求,开发新型天然抗虫方式显得尤为重要。植物在进化的过程中形成了多种抵御食草昆虫侵食的方式,分泌化合物毒杀食草昆虫是一种重要植物防御手段。先前研究表明植物通过合成萜类化合物DMNT间接抵御害虫的侵食,但DMNT的对昆虫有无直接影响尚未明确。本文以鳞翅目害虫小菜蛾为研究对象,探究植物萜类化合物DMNT对小菜蛾的毒杀作用及其机制。主要结果如下:（1）植物萜烯类化合物DMNT显着影响鳞翅目害虫小菜蛾的生长和繁殖。选择性取食试验发现,超表达PEN1基因的拟南芥植株对小菜蛾具有趋赶效果。根据已有文献报道,超表达PEN1基因的拟南芥植株能够产生大量萜烯类化合物DMNT。DMNT体外试验表明,DMNT对小菜蛾幼虫具有直接趋和毒杀作用。（2）DMNT处理能破坏小菜蛾幼虫肠道。对小菜蛾幼虫进行饥饿或饲喂DMNT发现,食用DMNT的幼虫比处于饥饿中的幼虫出现了较早的死亡,表明幼虫是被DMNT毒杀致死而非饥饿致死。幼虫肠道酶活试验发现,脂肪酶酶活显着下调,表明食用DMNT后幼虫肠道消化能力减弱。“Smurf”试验发现,食用DMNT后肠道发生渗漏的幼虫比例显着增加。体式镜下观察围食膜结构发现,食用DMNT后的幼虫肠道内围食膜结构薄而疏松。幼虫肠道HE染色切片发现,在食用DMNT后,幼虫肠道内围食膜糜烂。透射电镜观察肠道横切面得到类似结果。这些结果表明食用DMNT后幼虫肠道内围食膜遭到破坏。（3）DMNT通过下调小菜蛾肠道Mucin like基因表达破坏围食膜结构。RT-PCR分析发现,食用DMNT后幼虫肠道内围食膜合成基因Mucin的表达量显着下降,表明DMNT能够显着抑制Mucin基因的表达。RNAi试验发现,Mucin沉默后幼虫的存活率、体重和化蛹率显着下调,并且肠道内围食膜变薄。这些结果表明DMNT对围食膜的破坏作用是通过抑制Mucin的表达实现的。（4）DMNT毒杀小菜蛾幼虫需要肠道微生物的参与。抗生素的饲喂试验发现,抗生素对幼虫的生长发育无影响,HE染色切片显示幼虫食用抗生素后肠道内围食膜结构完整,因此小菜蛾幼虫肠道内围食膜的完整性的维持不需要肠道微生物存在。同时饲喂抗生素和DMNT试验发现,与喂食DMNT相比,小菜蛾幼虫的存活率和化蛹率显着上调,且HE染色切片显示同时饲喂DMNT和抗生素的幼虫肠道内围食膜结构仍然破损,这些结果表明DMNT对小菜蛾幼虫的毒杀作用不是围食膜破损本身导致的,而是需要肠道微生物的助攻。同时饲喂DMNT和粪肠球菌的革兰氏染色切片显示,在围食膜结构破坏后,粪肠球菌进入肠道细胞内,表明幼虫的死亡是由于细菌攻击肠壁细胞导致的。（5）DMNT对小菜蛾幼虫肠道菌群稳态有显着影响。16S r DNA测序显示,食用DMNT后幼虫肠道内菌群发生了紊乱:变形菌门和厚壁菌门变化较大,其中厚壁菌门中肠球菌属菌群丰度上调85倍。这些结果表明DMNT能够导致幼虫肠道内菌群紊乱。
周婷婷[2]（2021）在《BMP信号通路影响罗氏沼虾附肢再生的分子机制初步研究》文中提出罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）是具有强大断肢再生能力的水生甲壳动物,其整个生命过程均具有断肢再生能力,再生新肢断肢后仍具再生能力,且再生肢体的结构和功能也很完善。尽管如此,其再生的分子信号转导机制研究几乎空白。为探究罗氏沼虾附肢再生的分子机制,本论文以罗氏沼虾为研究对象,从形态学及组织学分析其附肢再生过程,明确再生重要阶段,并对其中关键再生阶段进行比较转录组研究,分析罗氏沼虾附肢不同再生阶段的基因表达谱,从中候选参与再生的关键信号通路BMP信号通路,再深入研究BMP信号通路关键基因在附肢再生过程中的功能,以期探讨BMP信号通路影响罗氏沼虾附肢再生的分子机制,为甲壳动物的再生研究提供理论依据。具体研究内容及结果如下:1.罗氏沼虾附肢再生过程的形态学观察及组织学分析通过压力法迫使罗氏沼虾步足自切,观察其附肢再生完整过程,了解到新肢体再生所需时间约10天,此外明确了罗氏沼虾附肢再生的重要阶段,分别划分为伤口愈合期（24h）、芽基形成期（48h）、肢芽形成期（4d）、肢芽生长期（7d）以及新肢形成期（10d）。同时通过组织切片观察,发现罗氏沼虾附肢再生早期阶段的细胞组织形态变化明显。2.基于不同再生阶段转录组解析罗氏沼虾附肢再生分子机制基于罗氏沼虾附肢再生过程的形态学及组织学分析结果,选择罗氏沼虾再生0h（对照组）、6h（伤口愈合早期）、24h（伤口愈合期）和10d（新肢生长期）等4个时期的断肢基部肌肉组织进行高通量转录组测序。测序一共得到了91,044个unigene,平均长度为1,655bp,N50值为3,345bp。unigene功能注释结果显示,NR、Swiss-portdatabase、KOG和KEGG数据库中分别注释了37,056（40.7%）、28,723（31.54%）、16,616（18.25%）和20,078（22.05%）个unigene。此外,大量差异基因在不同再生阶段显着富集,同时在再生早期阶段多个转录因子包括Mr ELK4-like、MrELF124、MrPRDM79、MrFOG1、MrHAND2、MrHES1、MrARNT、MrGATA2、MrSOX4和MrRUNXAB,及多个信号通路包括BMP、MAPK、NOTCH、HIPPO通路中关键基因差异表达,提示它们可能在罗氏沼虾附肢的再生中发挥重要作用。3.罗氏沼虾BMP信号通路关键基因dpp、BMPR1B、BMPR2、Smad1以及Smad4的克隆与表达分析基于转录组测序分析结果,候选BMP信号通路作为罗氏沼虾附肢再生的研究方向。通过转录组数据分析筛选出罗氏沼虾BMP2/4、BMPR1B、BMPR2、Smad1及Smad4基因序列,利用PCR扩增技术,克隆得到了这五个基因的cDNA全长,分别为1,612bp、982bp、2,940bp、1,785bp以及2,160bp,分别命名为Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1和MrSmad4,通过推导这五个基因的功能结构域,发现它们均与甲壳动物同源基因高度相似。然后进行各基因的表达特征分析,发现Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1和MrSmad4基因在雌雄罗氏沼虾各组织中的表达差异显着,但各基因均在步足基部肌肉、眼柄及神经组织中的表达相对较高。其次,Mrdpp、MrBMPR2以及Mr Smad1基因在蜕皮周期中的表达规律相似,均在蜕皮后期（A、B）期高表达。最后在罗氏沼虾附肢再生早期阶段检测各基因的表达,结果发现Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1及MrSmad4基因存在组织表达特异性,但总体均呈显着上调趋势,初步推断BMP通路中这5个关键基因参与了罗氏沼虾附肢再生过程。4.利用RNA干扰技术探究BMP信号通路关键基因对罗氏沼虾附肢再生的影响通过体外转录方法获得了Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、Mr Smad1和Smad4等关键基因的ds RNA,首先进行ds RNA-Mrdpp长期体内注射实验,再通过罗氏沼虾附肢再生过程的形态学观察及组织学分析,结果发现,长期注射ds RNA-Mrdpp组罗氏沼虾与对照组罗氏沼虾相比,其附肢伤口愈合时间明显延长,且再生芽基的生长及延长受到严重影响,组织切片结果也证实Mrdpp基因的敲降会影响罗氏沼虾附肢再生部位的伤口愈合。后续进行了罗氏沼虾体外组织孵育实验,结果表明在添加ds RNA-Mrdpp的实验组罗氏沼虾步足基部肌肉组织中,除Mr Smad4基因外,Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、Mr Smad1基因均极显着下调（p<0.01）。再通过BMP I型受体抑制剂（LDN-193189）的体内注射实验,检测罗氏沼虾断肢后BMP信号通路中各基因的表达特征,结果发现,注射抑制剂后,在断肢罗氏沼虾步足基部肌肉及胸节神经组织中MrBMPR1B及Mr Smad1基因均显着下调（p<0.05）,此外,在24h及48h,Mrdpp基因在各组织中均极显着下调（p<0.01）,MrBMPR2基因在眼柄及胸节神经组织中的表达量均显着降低（p<0.05）。最后进行Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1及MrSmad4等关键基因的ds RNA体内注射短期实验,在罗氏沼虾断肢后,分别检测这几个基因在不同组织中的表达特征,结果发现BMP信号通路中各关键基因敲降后,反而引起其他基因的高表达（p<0.05）,此外,下游各基因敲降后,Mrdpp基因均呈显着下调趋势,推测该通路可能存在多水平调控及反馈调节。通过以上的研究明确了BMP信号通路缺失会显着影响罗氏沼虾的附肢再生。5.过表达MrDpp和MrBMPR1B对断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因表达的影响通过构建原核表达载体,获得了重组蛋白pET-Dpp以及重组蛋白pET-BMPR1B,然后进行体外组织孵育实验,实验结果表明,在过表达重组蛋白pET-Dpp以及重组蛋白pET-BMPR1B,均会导致其他基因在不同组织中差异显着表达,但都存在孵育时间及蛋白浓度依赖性;此外发现胸节神经组织很可能是Dpp浓度调控的枢纽,在胸节神经组织中,只有当pET-Dpp重组蛋白浓度适中时,下游各基因显着表达,当浓度过低或过高,均会抑制其他基因的表达（p<0.05）。最后在罗氏沼虾体内进行了pET-Dpp重组蛋白,pET-Dpp重组蛋白与ds RNA-Mrdpp共注射实验,结果发现在注射pET-Dpp蛋白之后,在步足基部肌肉以及眼柄组织中,除MrBMPR1B基因之外所有基因的表达量显着上调（p<0.05）,当共注射pET-Dpp及dsRNA-Mrdpp后,与对照组相比Mrdpp表达量又显着下调（p<0.05）,而其他基因表达差异不显着（p>0.05）。然而,在胸节神经组织中Mrdpp、MrBMPR1B、MrBMPR2、MrSmad1以及MrSmad4基因均在注射pET-Dpp蛋白之后极显着下调（p<0.01）,再次表明在神经组织中过高的pET-Dpp重组蛋白浓度可能导致BMP信号通路基因的显着下调。总的来说,BMP信号通路在罗氏沼虾附肢再生过程发挥关键作用,此外,BMP通路的调控方式复杂,可能存在多水平调控及反馈调节。以上研究结果将有助于更深入的解析甲壳动物再生机制。
张文硕[3]（2021）在《转录因子Apontic抑制肿瘤转移的机理研究》文中研究表明恶性肿瘤是危及人类生命健康的一种严重的疾病,其最大的特点就在于恶性肿瘤细胞会出现扩散和转移现象,进而危及到全身的器官和组织,恶性肿瘤的转移往往是肿瘤治疗失败的主要原因,因此,解析肿瘤细胞转移的机制已经成为国内外研究的热点。近年来,黑腹果蝇由于其具有生活周期短,容易饲养,繁殖力强,染色体少,突变体多等优点,其已经成为研究肿瘤细胞迁移的一个非常重要的生物学模型,有研究表明肿瘤细胞的迁移是一个机制复杂且由多种基因及信号通路参与的过程。越来越多的以果蝇为细胞迁移模型的研究表明,JNK信号通路不仅与细胞凋亡有着极大关系,它还能在发育过程中调控细胞移动和粘附,JNK信号通路的激活往往会导致肿瘤细胞的迁移,所以JNK信号通路在肿瘤细胞的迁移过程中发挥重要作用。在果蝇中Apontic是一个bZIP类转录因子,由于它可以调控多个靶基因的表达,所以在果蝇气管、头、心脏、眼睛、边界细胞等器官发育过程中都扮演着重要角色。此外,Apt在进化上高度保守,其在人类中的同源蛋白FSBP在人体心脏、肝脏、肺、骨骼肌等组织器官中均有表达,但是目前为止,转录因子Apt在细胞迁移运动方面的机制和功能尚不清楚。本研究在果蝇中以转录因子Apt为研究对象,综合运用特异性组织表达系统、免疫荧光抗体染色、Western Blot、实时荧光定量PCR、原核蛋白表达、小鼠抗体制作、双荧光素酶报告实验等技术和方法,探究了Apt对肿瘤细胞迁移的影响并进一步解析了其中的调节机制。本研究获得的主要实验结果如下:（1）在果蝇翅原基中利用RNA干涉技术敲降apt后会发生细胞迁移的现象,我们然后在果蝇翅原基中敲降细胞极性因子scrib来构建了肿瘤细胞迁移模型,随后在此肿瘤模型基础上分别过表达和敲降apt后,发现肿瘤细胞的迁移能力分别被抑制和促进,由此表明转录因子Apt可以抑制肿瘤细胞的迁移。（2）通过免疫荧光抗体染色发现将apt敲降之后JNK信号通路的靶基因puc、mmp1的表达水平都显着升高并且磷酸化的JNK水平也有所上升,由此表明,敲降apt可以激活JNK信号通路。通过体内挽救实验发现转录因子Apt调控细胞迁移是通过JNK信号通路来实现的,并且通过遗传学上下游关系实验我们发现Apt是通过调控JNK信号通路中的元件基因msn来影响JNK信号通路的。（3）通过原核诱导表达、注射小鼠等实验我们获得了Msn的抗体,然后结合免疫荧光抗体染色、实时荧光定量PCR以及双荧光素酶报告实验发现Msn可以负调控JNK信号通路,并且Apt对msn的调控是直接的正调控关系。（4）敲降apt可以引发细胞凋亡,并且当凋亡被抑制后,由敲降apt引起的细胞迁移被抑制,然后进一步发现敲降jnk可以抑制由敲降apt导致的细胞迁移和细胞凋亡,由此表明,敲降apt可以通过JNK信号通路引发细胞凋亡并导致细胞迁移。（5）在果蝇翅原基中过表达人类同源基因fsbp不仅可以抑制由敲降apt引起的细胞迁移也可以抑制由敲降scrib引起的肿瘤细胞迁移,并且过表达fsbp可以抑制由敲降apt引起的JNK信号通路的激活。由此表明,Apt在调控细胞迁移及JNK信号通路方面具有进化上的保守性。综上所述,我们解析了转录因子Apt、JNK信号通路、细胞凋亡三者之间相互作用调节肿瘤细胞转移的可能机制,并初步表明了Apt在调控细胞转移及JNK信号通路方面具有进化保守性。本研究不但进一步拓展了转录因子Apt的生物学功能,而且对于预测和防治恶性肿瘤细胞转移具有重要意义,同时也为临床上对于恶性肿瘤的治疗提供了新的理论依据和研究思路。
王亚萍[4]（2021）在《家蚕细胞因子受体BmDOME基因的鉴定与功能研究》文中提出昆虫是动物界中最早产生翅的种群,同时也是唯一有翅的无脊椎动物类群。翅膀作为昆虫的重要器官,在觅食、寻偶、迁徙、扩大分布和避敌等方面都发挥着重要作用。家蚕是重要的经济昆虫,同时也是农林害虫主要类型鳞翅目昆虫的重要模式生物。对翅发育的研究不仅可以丰富家蚕乃至其他昆虫的翅发育调控理论,也为鳞翅目害虫的生物防治提供了理论支撑。模式生物果蝇的翅发育机制研究较深入,现已明确有EGFR信号通路、Notch信号通路、JAK/STAT信号通路等通路以及Hedgehog（Hh）、Decapentaplegic（Dpp）和Wingless（Wg）等形态发生基因参与调控果蝇翅的形成。JAK/STAT通路是细胞因子信号转导的重要途径,广泛参与果蝇的形态发生、血细胞的增殖分化、免疫等过程。JAK/STAT信号通路在进化中相对保守,在家蚕中发现有与果蝇同源的JAK/STAT通路的基本元件:STAT转录因子Bm STAT、JAK激酶Bm HOP以及负反馈调节作用的调节因子Bm SOCS等基因。果蝇中细胞因子受体DOME作为JAK/STAT信号通路的受体,在整个级联激酶反应中起着至关重要的作用,但是在家蚕中还尚未被报道。本研究以家蚕JAK/STAT信号通路的受体BmDOME基因为靶标,分析了其基因结构、时空表达特征及组织、亚细胞定位特征,并在细胞水平上和个体水平上初步探究了其生物学功能。主要研究结果如下:1.家蚕细胞因子受体BmDOME基因的克隆与生物信息学分析通过氨基酸比对检索分析,我们在家蚕中鉴定到一个与果蝇DOME同源的基因,命名为BmDOME,并克隆获得了该基因c DNA的ORF序列,序列长度为3765 bp,编码1254个氨基酸。通过染色体定位、基因组比较分析发现,该基因位于家蚕第17号染色体上,且仅含有1个外显子,没有内含子。保守结构域分析显示,BmDOME含有2个跨膜结构域,2个细胞因子结合域（CBM）和3个纤连蛋白III型结构域（Fn III）,与果蝇Dm DOME具有相同的保守结构域,推测可能具有相似的功能。随后我们构建了DOME的系统发生树,结果显示,家蚕的细胞因子受体与烟草天蛾的细胞因子受体聚为一支,而与哺乳动物的亲缘关系相对较远。2.家蚕BmDOME基因的表达特征分析与组织定位我们利用q RT-PCR和Western Blot检测BmDOME在家蚕5龄第三天的组织表达情况,结果显示,BmDOME在各组织均有表达,在脂肪体中的表达量最大,在翅原基和性腺中也有一定表达。同时我们利用q RT-PCR进一步分析BmDOME在翅原基的时期表达特征,结果表明,从家蚕幼虫5龄第1天到羽化期间,BmDOME在翅原基中持续表达,游走期表达量增加,而家蚕翅原基在游走期发育较快,推测家蚕BmDOME基因参与了翅原基的发育调控。为了检测BmDOME在个体组织中的具体表达位置,我们利用免疫荧光对表达量较高的脂肪体和翅原基进行组织定位分析,发现BmDOME定位在脂肪体细胞和整个翅原基的细胞膜上。这与在家蚕胚胎细胞系Bm E中的亚细胞定位结果一致。这也说明BmDOME能够作为细胞膜上的受体应答细胞外的信号,从而调控下游信号的传递。3.BmDOME基因影响家蚕细胞的增殖、凋亡为了研究BmDOME基因的生物学功能,我们首先在细胞水平展开实验。在家蚕胚胎细胞系Bm E中过表达BmDOME,检测JAK/STAT信号通路相关基因的情况,结果显示该通路相关基因均上调表达。利用Ed U染色试剂盒检测细胞增殖发现过表达BmDOME的细胞较对照组增殖显着提高,同时细胞周期蛋白相关基因表达量增加。接着我们又研究了过表达BmDOME对细胞凋亡的影响,利用Hoechst染色检测细胞凋亡情况,结果显示,过表达BmDOME的凋亡细胞比例显着低于对照组,同时q RT-PCR结果显示,凋亡相关基因Caspase1、Caspase3、Caspase8等均下调表达,表明过表达BmDOME,细胞凋亡受到抑制。我们通过RNAi干涉BmDOME基因进一步验证其功能。细胞水平干涉BmDOME后,BmDOME的RNA表达量和蛋白表达量显着下降,JAK/STAT信号通路相关基因均下调表达。Ed U染色试剂盒对细胞进行染色观察后发现,与对照组相比,干涉BmDOME的荧光细胞数显着下降,细胞增殖受到抑制,细胞周期相关基因也下调表达。利用Hoechst染色检测细胞凋亡情况,结果显示,干涉BmDOME的凋亡细胞比例显着高于对照组,细胞凋亡明显增加,同时q RT-PCR检测细胞凋亡相关基因Caspase1、Caspase3、Caspase8均上调表达,说明干涉BmDOME,促进了细胞凋亡。4.敲除BmDOME转基因品系的构建与表型分析为了进一步研究BmDOME基因的功能,我们利用CRISPR/Cas9系统,对家蚕BmDOME基因进行敲除。首先构建了BmDOME转基因g RNA载体,然后显微注射到胚胎期的卵中,在G1代个体中进行荧光筛选获得BmDOME转基因g RNA阳性个体,将其与全身性过表达Cas9蛋白的家蚕杂交,通过对杂交后代荧光筛选获得g RNA和Cas9双阳性家蚕。通过基因组检测,我们发现双阳性个体的基因组中BmDOME基因与野生型相比发生了不同片段的缺失。进一步对其蛋白的表达情况进行Western Blot检测,结果显示,与野生型相比,双阳性家蚕BmDOME蛋白的表达量显着下调。结果表明我们成功获得了敲除BmDOME的转基因家蚕,我们将其命名为KO-BmDOME。对转基因敲除家蚕进行观察,我们发现,敲除个体的蛹翅成囊泡状,等到化蛾时,存在部分无法蜕皮的现象,蚕蛾的翅呈现一定程度的缺失和皱缩。同时我们发现,敲除个体的蛾子生殖腺发育异常,无法正常交配。随后我们又统计了转基因敲除家蚕的经济性状,结果表明,与野生型相比,雌雄个体的茧层量没有发生变化,而蛹重有所下降。为了探究BmDOME转基因敲除家蚕翅发育异常的机制,我们利用q RT-PCR检测KO-BmDOME和野生型家蚕翅原基中细胞周期蛋白基因以及凋亡相关基因的表达,结果显示,与野生型相比,BmDOME转基因敲除家蚕细胞周期蛋白基因Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D等均下调表达,而凋亡基因Caspase1、Caspase3、Caspase8等均上调表达。根据以上结果我们推测BmDOME基因可以通过影响JAK/STAT信号通路来调控细胞增殖和凋亡过程,从而影响翅原基的发育。综上所述,我们鉴定了家蚕JAK/STAT信号通路的受体BmDOME,并对其基因序列、时空表达特征以及亚细胞定位情况进行了分析,并在细胞水平以及个体水平上验证了BmDOME基因可以通过调控JAK/STAT信号通路的活性从而调控细胞增殖和凋亡,进一步影响家蚕翅的发育。本研究初步阐明了家蚕BmDOME基因的生物学功能,这不仅为家蚕翅的发育调控提供新的思路,也为其它鳞翅目昆虫的DOME基因功能研究提供了参考,进一步验证了JAK/STAT信号通路在家蚕中在翅原基发育调控中的保守性。后续研究可能通过敲除鳞翅目害虫DOME基因,从而实现对农林业上引起极大危害的昆虫的生物防治。
侯微[5]（2021）在《基于iTRAQ蛋白分析技术初步探索红参粉对果蝇的抗衰老作用及其机制研究》文中提出衰老的发生是一种自然规律,也是生物界的普遍现象,不可避免。从古至今,人类一直在寻找着延缓衰老、延长寿命的方法,以期获得长寿。大多数人选择通过饮食控制或者锻炼身体的生活方式,维系健康的身体状态,以延缓衰老。近年来,人们也选择食用一些抗衰老相关的绿色植物及其提取物或者抗衰老药物来延缓衰老。因此,具有抗衰老活性相关的天然植物及药物的开发受到了广泛的关注,而中药作为天然植物产物,活性多样,副作用小,受到了国内外学者的青睐。根据加工工艺的不同,人参可分为红参、生晒参和鲜人参。红参是由新鲜的五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Mey.）经蒸制加工后获得的干燥根和根茎,可药食两用,具有大补元气、复脉固脱等功效。现代药理学研究表明红参具有抗氧化、抗衰老、抗抑郁、抗老年痴呆、抗肿瘤、降血糖及免疫调节等作用,在临床医学得到广泛的应用。我们前期利用模式生物果蝇（Drosophila melanogaster）对生晒参、红参及西洋参进行了初步的抗衰老研究,发现与生晒参及西洋参对比,红参显着延长果蝇寿命。本研究是在前期研究工作基础上,采用模式生物果蝇,利用iTRAQ生物学技术,对红参粉（红参晒干,粉碎,过200目筛粉末,RG）饲养果蝇后的寿命及其产生的相关蛋白变化进行了深入系统的研究,采用qRT-PCR和Western blotting技术对蛋白变化进行了验证,并在相关的信号通路上进行了作用机制的初步探索。通过对红参延缓果蝇自然衰老的研究,为红参作为抗衰老药物的研制与开发提供试验依据。本研究分为三部分:1.红参粉对果蝇的抗衰老作用及其蛋白变化分析首先进行了RG对果蝇寿命影响的实验。RG饲养雌、雄果蝇后,显着延长雌、雄果蝇寿命,但是在有效剂量上略有不同,浓度为12.5 mg/mL、15.0mg/mL和17.5 mg/mL的RG显着延长了雌性果蝇寿命（P<0.05）,在雄性果蝇寿命实验里,12.5 mg/mL和15.0 mg/mL浓度的RG显着延长了雄性果蝇的寿命（P<0.05）。雌、雄果蝇在摄入浓度为20.0 mg/mL的RG后,均缩短了果蝇的寿命周期。通过对雌、雄果蝇攀爬能力的测定来检验RG对老龄果蝇自主活动能力的影响。结果显示,12.5 mg/mL、15.0 mg/mL和17.5 mg/mL RG雌性果蝇组攀爬能力较强（P<0.05）;12.5 mg/mL和15.0 mg/mL RG雄性果蝇组攀爬能力较强（P<0.05）。采用iTRAQ生物学技术,对RG饲养果蝇后产生的蛋白变化进行了研究,共鉴定出雌、雄果蝇蛋白质4313个,其中雌性果蝇共57个差异蛋白有显着变化,过表达11个,抑制表达46个;雄性果蝇共94个差异蛋白有显着变化,过表达32个,抑制表达62个。2.果蝇衰老相关差异蛋白的验证及与人参皂苷结合作用研究采用qRT-PCR对差异表达蛋白基因的m RNA水平变化进行了验证。实验结果显示,雌性果蝇差异表达蛋白CG12895、Tim17b、DmelCG12990、DmelCG6733、SLIRP1、GIP、sPLA2、Pebp1、Cyp6t3、spartin、Smyd4-3和Cyp6a18的基因mRNA水平变化与iTRAQ蛋白分析变化结果一致,同为上调或下调。雄性果蝇差异表达蛋白CG9286、CG12374、CG10472、FK506-bp2、Akh、hgo、Su（P）、ATPsyn Cf6、peng、Svil、CG31674、bocks、Lpin、BcDNA:RH44935、Reps、hppy、Chchd2、DmelCG6733的基因m RNA水平变化与iTRAQ蛋白分析变化结果一致,同为上调或下调。采用Western blotting对差异表达蛋白进行了验证。雌性果蝇Western blotting结果显示,与对照组相比,RG组Pebp1,spartin,Ent2,Tim17b和TSG101蛋白表达量变化与iTRAQ蛋白分析变化结果一致,同为上调或下调。雄性果蝇Western blotting结果显示,与对照组相比,RG组hppy,Rheb,Ent2,Lpin和Fk506-bp2蛋白表达量变化与iTRAQ蛋白分析变化结果一致,同为上调或下调。利用Autodock分子对接软件分析雌、雄果蝇差异表达蛋白与人参皂苷的相互结合情况。结果显示,Pebp1与人参皂苷Re,Rf,Rb2,Rb1,Rc,Rb3,Rd分子间结合较好。spartin与人参皂苷Rb3和Rc分子间结合较好。hppy与人参皂苷Rg1,Rf,Rb1,Rc,Rb2,Rb3,Rd分子间结合较好。Rheb与人参皂苷Rg1,Rc,Rb2,Rb3分子间结合较好。Lpin与人参皂苷Rg1,Rb1,Rc,Rb2,Rb3,Rd分子间结合较好。3.红参粉对果蝇的抗衰老作用机制研究为了发现RG对果蝇的抗衰老作用机制,我们采用Western blotting技术,对差异表达蛋白在相关通路中的作用进行探索。结果发现,PI3K/AKT/FoxO通路可能参与了RG对雌、雄果蝇的抗衰老作用调节。此外,ERK通路可能参与了RG对雌性果蝇的抗衰老作用调节;4E-BP可能参与了RG对雄性果蝇的抗衰老作用调节。综上所述,RG延长了雌、雄果蝇寿命,产生的蛋白变化不完全一致,RG对雌、雄果蝇的抗衰老作用可能均通过PI3K/AKT/FoxO信号通路参与调节。此外,RG对雌性果蝇的抗衰老作用可能通过ERK通路参与调节;RG对雄性果蝇的抗衰老作用可能通过4E-BP参与调节。上述实验结果为红参作为抗衰老药物的研发提供了试验依据。
陈远志[6]（2021）在《褐飞虱铁蛋白基因的功能分析》文中认为褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal）是极具破坏性的水稻害虫。铁蛋白广泛存在于真核细胞生物中,对生物的生长发育具有重要作用。本研究对褐飞虱铁蛋白基因进行了功能研究,为褐飞虱防控提供了新思路。本论文鉴定了三个褐飞虱铁蛋白基因,即NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer。通过RNA干扰（RNAi）技术,探究了NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer对褐飞虱生长发育以及生殖的影响,取得的主要结果如下:（1）时空表达模式表明,这三个基因在褐飞虱整个生命周期中均有所表达,并且均在肠道的表达量最高;（2）RNA注射干扰实验表明,沉默Nlsoma-Fer仅导致褐飞虱若虫低于14%的死亡率且无任何异样表型,而沉默NlFer1或NlFer2均导致了二、三龄若虫100%的死亡率以及四、五龄若虫>60%的死亡率,所有处理组的若虫均表现为发育停滞,同时伴随部分黑化和蜕皮死的表型;（3）沉默初羽化雌成虫的NlFer1或NlFer2均使得其卵母细胞发育受阻,从而造成显着减少的产卵量和零孵化率;（4）RNAi浓度梯度实验表明,褐飞虱对dsNlFer1和dsNlFer2均表现为高敏感性,每头褐飞虱三龄若虫仅注射0.625 ng的dsRNA即可导致其>90%的死亡率;（5）双链RNA饲喂实验证实了褐飞虱口服dsNlFer1和dsNlFer2的可行性。本研究表明,NlFer1和NlFer2对褐飞虱的生长发育和繁殖至关重要。同时,根据饲喂dsNlFer1和dsNlFer2的可行性推测,这两种肠道高表达基因有望成为应用于转基因水稻的靶标基因。
王艺舟[7]（2020）在《中华鲟五种组织细胞系建立及青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定》文中认为鱼类细胞系作为理想的体外研究模型,已经成为鱼类生物学研究不可或缺的工具,各个物种不同组织特异性细胞系的分离将为该物种生理学、毒理学、病毒学、基因功能分析、种质资源保护及转基因等领域研究提供特异的、基础的、低成本的研究材料。中华鲟（Acipenser sinensis）是鲟属鱼类中个体最大,生活纬度最南的江海洄游性鱼类,由于过度捕捞、筑坝、航运和污染等人为活动导致中华鲟数量急剧减少,已濒临灭绝。此外,由于其体型巨大,生长缓慢,性成熟周期长等生物学特性导致其种群难以恢复。目前对中华鲟的研究主要集中在形态学、资源生态学和生殖生物学等方面,而在细胞生物学方面研究较少。建立中华鲟组织细胞系有两个重要原因:第一,在细胞水平上保护中华鲟种质资源,第二,中华鲟组织细胞系可作为体外研究模型,支持中华鲟细胞遗传学和生物学等方面的研究。本研究建立了青鱼（Mylopharyngodon piceus）鳍条及中华鲟精巢、肌肉、皮肤、肝脏、鳍条5种组织细胞系,分别命名为MPF、AST、ASM、ASSK、ASL和ASF。目前,MPF传至81代,5种中华鲟组织细胞系均传代到60代,6种细胞的适宜生长温度为28℃,均生长在含有10%FBS、10 ng/m Lβ-FGF、鱼血清和鱼类胚胎提取液的DMEM全培养基中,生长状态良好,MPF的细胞类型为上皮样细胞,中华鲟细胞类型主要为成纤维样细胞和上皮样细胞。染色体分析结果显示青鱼MPF染色体众数为48,属于正常的二倍体细胞;中华鲟细胞染色体众数为264,为多倍体细胞。MPF细胞系的线粒体16s r RNA序列分析结果与NCBI中青鱼的16s r RNA序列相似度高于99%。中华鲟细胞系的18s r RNA序列分析结果与NCBI中中华鲟的18s r RNA序列相似度也均高于99%,这些结果证明了细胞系的来源;通过脂质体转染法、杆状病毒转导法和电穿孔法测试了MPF、AST和ASM 3种细胞的转染效率:MPF的脂质体转染法和电穿孔法的瞬时转染效率分别为8%和24%;脂质体转染法和杆状病毒转导法对中华鲟细胞无效而电穿孔法有效,击穿电压200 V并且击穿时间10 ms时,对中华鲟细胞损伤最小且瞬时转染效率为15%。另外,利用睡美人转座子系统成功构建了转基因AST和ASM细胞系。对青鱼细胞系MPF,进行了基因表达检测和病毒敏感性分析,结果显示,在MPF细胞中存在干细胞标记因子nanog和oct4的表达,说明MPF可能为青鱼鳍条成体干细胞系;MPF细胞对鲤春病毒血症病毒（SVCV）病毒敏感,能产生病变效应,且SVCV可在MPF细胞中大量增殖。青鱼鳍条细胞系的建立不仅可作为研究青鱼基因功能和病毒致病机制的体外工具,为大型淡水鱼类的研究提供理想的体外模型,或许还可以为鱼类干细胞相关基因的功能研究提供材料。通过建立中华鲟细胞系,在细胞水平上保护了珍稀物种中华鲟的种质资源,通过筛选出中华鲟细胞最优的外源基因导入方法,使中华鲟细胞成为研究中华鲟基因功能的理想体外模型。生殖细胞的发育是生物生长发育、繁殖延续的一个重要且复杂的过程,对生殖细胞增殖分化的分子学机理的研究一直是生命科学的重要课题。Dazl是DAZ家族的重要成员,是生殖细胞的重要标记基因,其在大部分脊椎动物的两性生殖细胞中特异表达,其编码的RNA结合蛋白在生殖细胞的发育和分化过程中发挥着重要作用。青鱼是我国传统的“四大家鱼”之一,其体型大、生长快、口感好且营养价值高,是我国重要的人工养殖品种,但青鱼性成熟周期长,且人工繁殖难度较高。因此对青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定,为研究青鱼生殖细胞的发育和性腺分化提供重要的工具和参考。本研究通过RACE技术在青鱼中克隆了dazl c DNA,序列全长2013 bp,编码216个氨基酸。蛋白序列比对结果显示,其含有RRM（RNA recognition motif）保守区域和一个DAZ重复序列,青鱼Dazl与斑马鱼（Danio rerio）的Dazl序列相似度最高,为85%。通过构建青鱼Dazl重组表达载体诱导Dazl蛋白并制备了兔抗Dazl多克隆抗体,经过验证Dazl抗体可以特异性的识别青鱼Dazl原核表达蛋白、卵巢组织内源蛋白和真核表达蛋白。在组织中,dazl只在青鱼的性腺中表达,组织原位杂交和免疫荧光结果均表明dazl在青鱼的早期卵母细胞中表达,主要分布在I、II和III期卵母细胞的细胞质中。在胚胎发育过程中,dazl在早期胚胎中表达量较高,随着胚胎的发育表达量逐渐降低,到原肠期几乎检测不到表达。整胚原位杂交结果显示dazl在早期胚胎的各个细胞中均表达。通过Tail-PCR技术扩增出1612 bp的青鱼dazl基因5’侧翼区启动子序列,并构建启动子不同区段的荧光素酶报告系统psi-CHECK-1612、psi-CHECK-938和psi-CHECK-303。将它们分别转染到SG3、CIK和SKOV3细胞,利用双荧光素酶报告系统鉴定了青鱼dazl基因核心启动子区域,结果表明-850～+88区域存在青鱼dazl基因的重要调控元件。由于青鱼生殖周期较长,且胚胎卵膜薄,不适合进行基因功能研究,因此我们选取模式生物青鳉（Oryzias latipes）作为替代对象,利用CRISPR/Cas9系统对青鳉dazl基因进行敲除,结果表明青鳉dazl的缺失可能会导致青鳉胚胎中原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）的缺失,在F0代成鱼中发现3尾雌性性腺缺失,结果表明dazl可能参与性腺的形成和发育。本研究中通过分析青鱼dazl基因的表达模式,表明青鱼dazl是与生殖细胞形成和发育相关的重要因子,结合dazl在其他鱼类中的表达及青鳉dazl的敲除结果,为后期青鱼dazl基因功能及其生殖细胞的研究提供参考。综上所述,第一,本研究建立了珍稀濒危物种中华鲟不同组织的细胞系,并对其基本生物学特性进行分析,发现最适于中华鲟细胞的转染方法,建立转基因中华鲟细胞系,在细胞水平上保护了中华鲟的种质资源,并为中华鲟基因功能的研究提供了理想的体外工具。第二,本研究建立青鱼鳍条组织细胞系,对其生物学特性进行了分析,为将来在青鱼细胞系上开展基因功能和病毒致病机制研究奠定了基础。第三,本研究克隆和鉴定了青鱼生殖细胞标记基因dazl,其在胚胎发育的早期和性腺的生殖细胞中表达,另外,青鳉dazl基因的缺失会导致PGCs的缺失,表明其可能在生殖细胞的形成和发育过程中起到关键作用。
朱雄[8]（2020）在《EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究》文中研究表明神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases）是一类以中枢神经系统（神经元）和（或）外周神经系统（髓鞘）的变性、凋亡所导致的结构和功能的进行性退化为特征的异质性疾病。随着人口老龄化问题日益突出,神经退行性疾病已成为世界范围内危害人类健康最严重的疾病之一。神经退行性疾病的发病机理极其复杂,至今尚不能被完全解释清楚,到目前为止缺少有效的诊断和治疗方法。目的:在神经退行性疾病中,脑和视网膜神经退行性病变是目前研究的热点。此类疾病引起损害的病理是神经元细胞的不可逆性损伤,目前临床上对此缺乏行之有效的治疗手段。视网膜营养不良（Retinal dystrophy）是一类因光感受器功能丧失而引起的异质性遗传性疾病。在全球尤其是工业化国家中,视网膜变性疾病是致盲的重要原因之一。这些疾病的临床表型复杂性和等位基因的异质性给疾病的正确诊断带来困难。内质网膜蛋白复合物（endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC）首先在酿酒酵母中被鉴定为内质网中蛋白质折叠所需的6亚单位跨膜蛋白复合物。EMC亚基的丢失会导致错误折叠的膜蛋白的积累和未折叠蛋白反应（UPR）的诱导。有研究报道,EMC1基因突变与视网膜营养不良及小脑发育退化综合征相关。在真核生物中,d Pob/EMC3定位于内质网,并与EMC1和钙连蛋白（calnexin）结合并相互作用。此外,内质网膜蛋白复合物（EMC）是其他多通道跨膜蛋白的稳定表达所必需的,如视紫红质和Na+K+-ATP酶等。另外,d Pob/EMC3缺失会导致果蝇单眼细胞的变性。这些结果共同表明,EMC是包括视紫红质1在内的多通道跨膜蛋白生物发生过程中的一个关键因素,其缺失会导致视网膜变性。EMC1和EMC3组成复合物参与内质网相关降解（ERAD）途径,表明EMC与ERAD途径之间存在密切联系。内质网结构和功能的紊乱在神经退行性疾病中已被广泛观察到,但内质网功能障碍是神经退行性疾病病变的原因,还是仅仅是神经元死亡的表现,目前尚不清楚。本论文重点研究EMC3在小脑和视网膜中的功能。方法:构建EMC3、EMC1等表达质粒载体（包括野生型和突变型）,分别进行细胞转染,结合免疫组化等方法,通过高分辨激光共聚焦显微镜、荧光共定位等分析其在细胞中的表达及定位情况,分析EMC1突变是否引起细胞中定位发生变化。研究EMC3与EMC其他亚基的表达及定位分析。在前期工作中,本研究发现小鼠Emc3基因胚胎敲除导致早期胚胎死亡。因此使用Pcp2-cre转基因小鼠和Emc3条件性敲除小鼠建立了一个在小脑浦肯野神经细胞和视网膜双极细胞中特异敲除Emc3基因的动物模型。本论文综合运用分子生物学,细胞生物学和免疫组化等方法,详细研究Emc3在双极细胞和小脑浦肯野细胞中的功能。利用双极细胞和小脑浦肯野细胞中特异蛋白标志物,对Emc3缺失的小鼠视网膜和小脑冰冻切片进行免疫染色,使用高分辨率激光共聚焦显微镜,详细分析这些关键蛋白的运输和定位。结果:EMC3由小鼠Tmem111基因编码,是高度保守的内质网膜蛋白复合物（EMC）的一个亚基。本研究发现Emc3的靶向缺失导致了小鼠严重的神经病变表型。同时Emc3lox P/lox P;Pcp2-Cre小鼠是可以长期存活并是可育的,但行为学上表现出类似于小脑共济失调的表型。与野生型小鼠相比较,三月龄的成年Emc3突变小鼠小脑中浦肯野细胞的树突发育有明显减少。本研究进一步发现,浦肯野细胞中Emc3的选择性缺失导致内质网错误折叠的膜蛋白的积累,阻碍了浦肯野细胞的分泌运输,并导致了树突萎缩。这些表型表现为小脑体积变小和浦肯野细胞数量减少,导致共济失调。浦肯野细胞丢失和共济失调最初出现在出生后两个星期左右,但随着年龄的增长逐渐恶化。Emc3的缺失导致浦肯野细胞缺失区域神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加和星形胶质细胞增生。C/EBP同源蛋白（CHOP）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78/BIP）表达水平升高表明浦肯野细胞在可见细胞丢失之前存在内质网应激（ER Stress）。TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）分析表明,小脑浦肯野细胞出现细胞凋亡。本文的数据表明,浦肯野细胞中Emc3的缺失导致蛋白质折叠和运输缺陷,树突密度显着降低,星形胶质细胞增生和浦肯野细胞死亡。此外,本研究发现Emc3突变小鼠视网膜中视杆双极细胞与野生型小鼠相比有进行性病变,这表明Emc3在小鼠的视网膜结构和功能维持发挥重要作用。结论:研究结果表明了Emc3在小鼠浦肯野细胞和视网膜双极细胞的发育和功能维持发挥重要作用。本文的研究揭示了EMC3蛋白在小脑浦肯野细胞和视网膜中的重要作用,为研究小脑共济失调和视网膜神经退行性疾病提供了新方向与思路。
顾秋香[9]（2020）在《果蝇Gαq基因的多种剪接体介导光信号转导的机制研究》文中进行了进一步梳理G蛋白偶联受体（G-Protein Coupled Receptor,GPCRs）是目前已知数目最多的一类膜受体,它们调控了如视觉、嗅觉、味觉等感觉信号传递以及激素和神经递质等介导的信号传递。GPCRs与配体的结合使其构象发生改变,进而激活异源三聚体G蛋白并开启下游信号传导通路。果蝇的视觉信号传递系统是研究GPCR信号传导通路的良好模型。果蝇中Gαq基因编码G蛋白α亚基,产生七种剪接体并编码三种Gαq蛋白,分别为Gαq1、Gαq3和Gαq4蛋白。其中Gαq1蛋白在果蝇光信号传导通路中起主导作用,但是Gαq1完全缺失突变品系(Gαq961)仍然有残留的光反应,暗示Gαq的其他剪接体或编码Gqα亚基的其他基因可能参与光信号转导。此外,Gαq1完全缺失突变品系只表现出轻微的视网膜退化现象,它作为光信号转导通路中的关键分子在果蝇视网膜退化中的作用尚不清楚。本研究以果蝇的视觉信号传递系统为模型,综合利用遗传学、分子生物学、生物化学以及电生理技术等生物手段解析了Gαq基因的不同剪接体介导光信号转导的机制。首先,我们通过视网膜电位记录（electroretinogram,ERG）筛选到一株对光刺激没有反应的突变体果蝇（no-light-response,nlr）。利用细胞内记录和免疫印迹实验,我们揭示nlr突变体果蝇对光刺激没有反应是由于Gαq蛋白缺失所导致的。我们通过对nlr突变位点定位和开展表型挽救实验证实Gαq1和Gαq3蛋白共同介导光信号转导,并阐明Gαq3蛋白而非Gαq蛋白的同源物CG30054或CG17760介导Gαq1完全缺失突变品系中残留的光反应。电镜超微结构检测显示完全缺失Gαq蛋白导致果蝇出现快速的光依赖性视网膜退化。进一步研究阐明Rh1与Arrestin2形成稳定复合物导致了视网膜退化。最后,我们还揭示了Gαq3蛋白而非Gαq1蛋白介导了Rh1的合成过程。上述研究阐明了Gαq基因编码的两种不同剪接体Gαq1和Gαq3均介导了果蝇视觉信号传递过程,揭示了Gαq蛋白的缺失同样会导致视网膜退化,并发现Gαq3蛋白而非Gαq1蛋白调控了Rh1合成。该论文的研究工作完善了果蝇光信号转导通路模型和视网膜退变机制,为研究GPCR信号传导通路提供了新线索。
张鑫泽[10]（2020）在《萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因克隆及功能探究》文中认为萝卜蚜Lipaphis erysimi（Kaltenbach）是危害十字花科蔬菜的农业昆虫之一,且繁殖速度快、全球各地均有分布。而端粒逆转录酶TERT是端粒酶中具有催化活性的亚单位,该基因不仅可以诱导端粒酶活性影响细胞衰老、凋亡,还具有除依赖端粒酶以外的其他生物学功能。本研究以萝卜蚜为研究对象,利用基因扩增、RNAi技术、转录组测序及q RT-PCR等方法克隆得到了萝卜蚜端粒酶TERT基因的CDS序列,在m RNA水平上检测了不同处理下TERT基因表达量的动态变化规律,并通过RNAi技术初步探究了TERT基因在萝卜蚜生长发育中的功能,为萝卜蚜的综合防治提供了新的理论依据,主要结论如下:1.根据本地转录组库筛选得到萝卜蚜TERT基因的相关序列,利用基因扩增手段克隆得到了TERT基因的CDS序列。该基因的CDS区全长序列长度为2658 bp,能够编码885个氨基酸残基,其二级结构含41个α-螺旋,60个卷曲螺旋并得到了5种预测的三级结构模型。将其上传至NCBI后比对发现,该基因与麦双尾蚜Diuraphis noxia同源性最高,与其他物种同源性较低。2.利用实时荧光定量PCR技术分析了TERT基因在萝卜蚜不同龄期及不同组织内的相对表达量变化情况。结果显示,萝卜蚜成虫期TERT基因的相对表达量最高,与各龄期均有显着性差异;1龄若虫的表达量显着低于成虫的表达量,但显着高于2龄、3龄、4龄若虫的表达量;4龄若虫表达量最低,但与2龄、3龄若虫的表达量无显着性差异。随后选取发育基本成熟且TERT基因表达量最低的4龄萝卜蚜若虫进行解剖,能够同时在4龄萝卜蚜的头部、胸部、腹部检测到TERT基因的表达,且腹部表达量最高。3.选取2段不同长度的TERT基因不同序列利用RNAi技术对萝卜蚜进行功能探究。研究发现,RNA干扰24 h后,处理组TERT基因的相对表达量分别下调了40.6%和41.3%,均与对照组有显着性差异,且两个不同干扰长度的处理组之间的下调水平并无差异。RNA干扰48 h后,处理组TERT基因相对表达量分别显着下调了73.9%和57.0%,干扰TERT基因片段2的处理组与对照组有显着性差异。RNA干扰72 h后,处理组TERT基因的相对表达量分别下调了69.0%和48.2%,均与对照组有显着性差异,且两个不同干扰长度的处理组之间的下调水平并无差异。生物测试实验结果表明,干扰萝卜蚜TERT基因能够显着提高死亡率,延长发育历期,降低体长、产仔率以及成虫寿命。4.将干扰TERT及EGFP基因72 h后的萝卜蚜,通过Illumina平台进行转录组测序。共得到平均数目为51,190,754及461,296,156条的Cleaning Reads,通过组装得到92371条Unigene序列,平均长度为766 bp。GO注释显示,分子功能类条目注释所占比例最高,其中与ATP结合有关基因注释最多,含4320条序列占8.8%。KEGG注释显示,人类疾病相关条目最多,其中与癌症通路有关的基因注释比例最高,含644条序列占4.9%。KOG注释显示,除了功能未知一类,占比例最大的为信号转导机制条目占全部基因注释的13%。随后选取校正后的P值（FDR）作为筛选差异基因的关键指标,通过筛选一共得到545个差异基因,其中165个基因表达上调,380个基因表达下调。GO分析表明,TERT基因经RNA干扰后抑制了与细胞、有机物、高级分子等相关通路的合成及代谢过程。KEGG分析表明,TERT基因经RNA干扰后诱导了核糖体合成、氧化磷酸化、肌动蛋白细胞骨架调节等相关通路基因的下调。
二、转基因技术在果蝇及脊椎动物心脏基因研究中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转基因技术在果蝇及脊椎动物心脏基因研究中的应用（论文提纲范文）
（1）植物挥发性化合物DMNT毒杀小菜蛾的机制解析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植食型昆虫的分类 |
| 1.2 现代化技术对植食昆虫的防治现状 |
| 1.2.1 化学杀虫剂 |
| 1.2.2 植物源杀虫剂 |
| 1.2.3 RNAi技术在农业生产中的应用 |
| 1.2.4 微生物防治 |
| 1.2.5 转基因抗虫技术的应用 |
| 1.3 植物对草食型昆虫的天然防御方式 |
| 1.3.1 间接防御 |
| 1.3.2 直接防御 |
| 1.4 植物天然化合物对微生物的影响 |
| 1.5 脊椎动物与无脊椎动物的先天免疫 |
| 1.6 昆虫的先天免疫 |
| 1.7 昆虫肠道防御系统 |
| 1.7.1 天然物理防御-围食膜 |
| 1.7.2 Duox-ROS防御系统 |
| 1.7.3 Imd免疫通路 |
| 1.8 小菜蛾对农业生产的危害和防治研究 |
| 1.9 研究背景 |
| 1.10 技术路线图 |
| 第二章 DMNT能够驱逐和直接毒杀小菜蛾幼虫 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料和昆虫的饲养 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试验试剂及试剂配方 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 35Spro:PEN1 转基因拟南芥植株的获得 |
| 2.2.2 35Spro:PEN1 转基因拟南芥纯合植株中PEN1 基因表达量检测 |
| 2.2.3 35Spro:PEN1 转基因拟南芥的生长条件 |
| 2.2.4 35Spro:PEN1 转基因拟南芥对小菜蛾幼虫的气味偏好性选择试验 |
| 2.2.5 小菜蛾幼虫对35Spro:PEN1 转基因拟南芥的强制性取食 |
| 2.2.6 GC-MS(Gas Chromatography and Mass Spectrometry)检测 35Spro:PEN1转基因拟南芥中 DMNT 的含量 |
| 2.2.7 体外化学合成DMNT对小菜蛾幼虫的气味偏好性选择试验 |
| 2.2.8 小菜蛾幼虫强制性取食DMNT试验 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 35Spro:PEN1 转基因拟南芥植株阳性苗鉴定 |
| 2.3.2 35Spro:PEN1 转基因拟南芥中PEN1 基因表达量显着上调 |
| 2.3.3 35Spro:PEN1 转基因拟南芥能够驱逐和毒杀小菜蛾幼虫 |
| 2.3.4 挥发性化合物DMNT在35Spro:PEN1 转基因拟南芥中累积 |
| 2.3.5 DMNT能够显着驱赶和抑制小菜蛾幼虫的生长发育 |
| 2.3.6 DMNT对小菜蛾不同龄期幼虫的影响 |
| 2.3.7 DMNT降低小菜蛾幼虫的取食量和排便量 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 DMNT破坏小菜蛾肠道内围食膜屏障 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 试验试剂与配方 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 饥饿试验 |
| 3.2.2 脂肪酶酶活检测 |
| 3.2.3 “Smurf”染料检测幼虫肠道的渗透性 |
| 3.2.4 幼虫食用DMNT后围食膜结构的观察 |
| 3.2.5 幼虫肠道横切片 |
| 3.2.6 qRT-PCR分析 |
| 3.2.7 dsRNA-PxMucin的合成 |
| 3.2.8 dsRNA的饲喂 |
| 3.2.9 RNAseq分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 DMNT破坏幼虫肠道完整性 |
| 3.3.2 DMNT破坏幼虫肠道内围食膜结构 |
| 3.3.3 幼虫的转录组分析 |
| 3.3.4 DMNT抑制小菜蛾幼虫肠道内围食膜合成基因PxMucin的表达 |
| 3.3.5 dsRNA-PxMucin的合成 |
| 3.3.6 PxMucin基因沉默后抑制了幼虫的生长发育 |
| 3.3.7 dsRNA-PxMucin脱靶风险较低 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 小菜蛾幼虫肠道微生物在DMNT毒杀中的作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验试剂及配方 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 抗生素处理 |
| 4.2.2 检测抗生素对肠道菌的杀灭效果 |
| 4.2.3 小菜蛾幼虫肠道横切片HE染色 |
| 4.2.4 小菜蛾幼虫肠道横切片革兰氏染色 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 抗生素对小菜蛾幼虫生长发育无显着影响 |
| 4.3.2 小菜蛾幼虫肠道内围食膜结构完整性不依赖于肠道微生物 |
| 4.3.3 肠道微生物在DMNT对小菜蛾的致死作用中至关重要 |
| 4.3.4 DMNT对小菜蛾幼虫的致死作用需要肠道微生物的助攻 |
| 4.3.5 围食膜屏障破损后微生物攻击肠道细胞 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 DMNT致使小菜蛾幼虫肠道菌群紊乱 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验试剂及配方 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 16S rDNA测序 |
| 5.2.2 清洁型2 龄幼虫的培养 |
| 5.2.3 小菜蛾幼虫肠道菌的分离与培养 |
| 5.2.4 肠道菌的喂食试验 |
| 5.2.5 DMNT处理后幼虫肠道组织中溶菌酶基因表达量 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 PCA(Principal Component Analysis)主成成分分析 |
| 5.3.2 DMNT破坏小菜蛾幼虫肠道内菌群稳态 |
| 5.3.3 DMNT导致幼虫肠道内菌属丰度显着改变 |
| 5.3.4 清洁型2 龄幼虫肠道内大部分微生物被抗生素清除 |
| 5.3.5 肠道微生物帮助DMNT加速小菜蛾幼虫死亡 |
| 5.3.6 DMNT处理后肠道溶菌酶基因表达量降低 |
| 5.4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A DMNT 碳普 |
| 附录 B DMNT 氢普 |
| 附录 C pLGNL-35S 载体图谱 |
| 个人简介 |
| 发表论文 |
| 授权专利 |
（2）BMP信号通路影响罗氏沼虾附肢再生的分子机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 动物自切行为及再生研究 |
| 1.1.1 动物自切 |
| 1.1.2 动物附肢再生过程研究 |
| 1.2 动物再生的分子机制研究 |
| 1.2.1 参与再生过程中的关键因子 |
| 1.2.2 参与再生过程中的信号通路 |
| 1.3 BMP-Smad信号通路研究进展 |
| 1.3.1 BMP-Smad信号通路分子生物学基础 |
| 1.3.2 BMP-Smad信号通路的功能 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 主要内容及技术路线 |
| 2 罗氏沼虾断肢再生的形态学观察和组织学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象与饲养管理 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 罗氏沼虾附肢再生的周期及再生情况 |
| 2.2.2 取样及组织固定 |
| 2.2.3 石蜡包埋组织切片和H.E染色 |
| 2.2.4 镜检 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 罗氏沼虾断肢再生过程的形态学观察 |
| 2.3.2 罗氏沼虾断肢再生初期阶段组织学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 罗氏沼虾断肢不同再生阶段的比较转录组分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验耗材及仪器 |
| 3.1.3 动物及样品采集 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA提取、文库构建和测序 |
| 3.2.2 转录组组装和基因注释 |
| 3.2.3 差异表达基因(DEGs)分析 |
| 3.2.4 qPCR验证差异表达基因 |
| 3.2.5 数据处理 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 转录组测序和组装 |
| 3.3.2 功能注释与分类 |
| 3.3.3 差异表达基因聚类分析 |
| 3.3.4 筛选可能参与再生初始信号转导的转录调节因子 |
| 3.3.5 断肢再生相关通路注释 |
| 3.3.6 qPCR验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 候选参与再生初始信号转导的转录调节因子 |
| 3.4.2 候选参与罗氏沼虾附肢再生的相关信号通路 |
| 4 罗氏沼虾BMP信号通路关键基因的克隆与表达分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 罗氏沼虾步足基部肌肉组织总RNA提取 |
| 4.2.2 罗氏沼虾cDNA模板的合成 |
| 4.2.3 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因编码区(ORF)序列扩增 |
| 4.2.4 BMP信号通路各关键基因生物信息学分析 |
| 4.2.5 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因时空表达特征分析 |
| 4.2.6 数据处理 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.2 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因空间表达特征分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因的结构特征 |
| 4.4.2 罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因的表达模式 |
| 5 去表达BMP信号通路各关键基因对罗氏沼虾附肢再生的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 引物设计 |
| 5.2.2 RNA双链合成 |
| 5.2.3 Mrdpp敲降后罗氏沼虾断肢再生过程的形态学观察 |
| 5.2.4 Mrdpp敲降后罗氏沼虾断肢再生初期阶段组织学分析 |
| 5.2.5 dsRNA-Mrdpp体外组织孵育实验 |
| 5.2.6 BMPⅠ型受体抑制剂LDN-193189体内注射实验 |
| 5.2.7 BMP信号通路各关键基因dsRNA体内注射实验 |
| 5.2.8 数据处理 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 长期敲降Mrdpp基因表达对罗氏沼虾附肢再生的影响 |
| 5.3.2 体外组织中敲降Mrdpp,对BMP信号通路关键基因表达的影响 |
| 5.3.3 BMPⅠ型受体抑制剂对断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因表达的影响 |
| 5.3.4 断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因敲降后的相互影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 长期敲降Mrdpp基因表达对罗氏沼虾附肢再生的影响 |
| 5.4.2 探究BMPⅠ型受体抑制剂对断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因表达的影响 |
| 5.4.3 断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因的敲降后的相互影响 |
| 6 过表达MrDpp及其受体MrBMPR1B对断肢罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因表达的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 质粒与菌株 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 实验仪器 |
| 6.1.5 溶液配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 罗氏沼虾Mrdpp及MrBMPR1B原核表达载体的构建 |
| 6.2.2 重组蛋白pET-Dpp及pET-BMPR1B的诱导表达与复性 |
| 6.2.3 重组蛋白pET-Dpp及pET-BMPR1B体外孵育实验 |
| 6.2.4 重组蛋白pET-Dpp体内注射实验 |
| 6.2.5 数据处理 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 罗氏沼虾Mrdpp和MrBMPR1B原核表达载体构建 |
| 6.3.2 体外过表达pET-Dpp及pET-BMPR1B对BMP信号通路各关键基因表达水平的影响 |
| 6.3.3 体内过表达pET-Dpp对BMP信号通路各关键基因表达水平的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 7 全文总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.1.1 了解了罗氏沼虾附肢再生所需时间及再生重要阶段 |
| 7.1.2 获得了罗氏沼虾不同再生阶段转录组基础数据 |
| 7.1.3 鉴定了罗氏沼虾BMP信号通路各关键基因及其组织表达特征 |
| 7.1.4 明确了Mrdpp的敲降能够显着抑制罗氏沼虾附肢再生 |
| 7.1.5 探究了过表达重组蛋白pET-Dpp及其受体pET-BMPR1B调控BMP信号通路各关键基因表达 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（3）转录因子Apontic抑制肿瘤转移的机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 模式生物果蝇概述 |
| 1.1.1 果蝇发育过程简介 |
| 1.1.2 果蝇在肿瘤学研究中的优势 |
| 1.1.2.1 果蝇和人类在信号传导通路上具有保守性 |
| 1.1.2.2 果蝇相对缺乏基因冗余 |
| 1.1.2.3 果蝇在肿瘤学研究中的应用前景 |
| 1.2 果蝇中常用的研究方法 |
| 1.2.1 特异性组织表达系统 |
| 1.2.2 RNA干涉技术 |
| 1.2.3 嵌合体克隆技术 |
| 1.3 转录因子Apt研究进展 |
| 1.3.1 Apt概述 |
| 1.3.2 Apt在果蝇翅发育中的功能 |
| 1.3.3 Apt在卵室发育中的功能 |
| 1.3.4 Apt在眼睛发育中的功能 |
| 1.3.5 Apt在心脏发育中的功能 |
| 1.3.6 Apt的其它功能 |
| 1.4 JNK信号通路的研究进展 |
| 1.4.1 JNK信号通路简介 |
| 1.4.2 应激反应中JNK信号通路的相关功能 |
| 1.4.2.1 对细胞自我保护的影响 |
| 1.4.2.2 对细胞凋亡的影响 |
| 1.4.2.3 对个体寿命的影响 |
| 1.4.3 JNK信号通路的负调控 |
| 1.4.4 JNK信号通路与恶性肿瘤的侵袭转移 |
| 1.5 恶性肿瘤转移研究进展 |
| 1.6 果蝇中的肿瘤转移研究模型 |
| 1.6.1 果蝇成虫中的肿瘤转移模型 |
| 1.6.2 果蝇幼虫中的肿瘤转移模型 |
| 1.6.3 果蝇翅原基中的肿瘤转移模型 |
| 1.7 本课题研究的目的和意义 |
| 1.8 本课题的研究思路 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 所用果蝇品系及培养条件 |
| 2.1.2 抗体及荧光染料 |
| 2.1.3 试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 信息检索分析网站及数据处理软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验过程中所用引物 |
| 2.2.2 相关试剂的配置 |
| 2.2.3 DNA片段扩增及载体的构建 |
| 2.2.3.1 DNA片段的扩增 |
| 2.2.3.2 DNA片段的酶切 |
| 2.2.3.3 琼脂糖凝胶电泳实验 |
| 2.2.3.4 胶回收 |
| 2.2.3.5 DNA片段的酶连 |
| 2.2.3.6 载体转化及扩增 |
| 2.2.3.7 小量提取质粒 |
| 2.2.3.8 大量提取质粒 |
| 2.2.3.9 同源重组及定点突变 |
| 2.2.4 果蝇翅原基解剖及抗体染色 |
| 2.2.5 果蝇S2 细胞实验相关操作 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告基因分析实验 |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 2.2.7.1 果蝇翅原基总RNA的提取 |
| 2.2.7.2 RNA质量的测定及逆转录合成cDNA |
| 2.2.7.3 实时荧光定量PCR体系及反应条件 |
| 2.2.8 Western blot实验 |
| 2.2.8.1 果蝇组织蛋白的提取 |
| 2.2.8.2 SDS凝胶电泳 |
| 2.2.8.3 转膜 |
| 2.2.9 鼠抗Msn多克隆抗体的制备 |
| 2.2.9.1 蛋白的原核表达 |
| 2.2.9.2 SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色 |
| 2.2.9.3 小鼠免疫 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 敲降apt诱导细胞发生迁移 |
| 3.2 Apt抑制肿瘤细胞迁移 |
| 3.3 Apt抑制JNK信号通路的表达 |
| 3.3.1 Apt与 JNK信号通路协同调控背板发育 |
| 3.3.2 敲降apt激活puc-Lac Z的表达 |
| 3.3.3 敲降apt激活mmp1 的表达 |
| 3.3.4 敲降apt使磷酸化的JNK水平升高 |
| 3.4 Apt通过JNK信号通路调控细胞迁移 |
| 3.5 Apt在 JNK信号通路中的作用位置 |
| 3.6 Msn负调控JNK信号通路 |
| 3.7 Msn抗体检验 |
| 3.8 Apt直接正调控msn的表达 |
| 3.9 Apt介导的细胞迁移与细胞凋亡的关系 |
| 3.10 Apt影响细胞迁移具有进化保守性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）家蚕细胞因子受体BmDOME基因的鉴定与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 昆虫翅发育研究进展 |
| 1.1.1 果蝇翅发育研究 |
| 1.1.2 家蚕翅发育研究 |
| 1.2 JAK/STAT信号通路的研究进展 |
| 1.2.1 哺乳动物JAK/STAT信号通路研究 |
| 1.2.2 果蝇JAK/STAT信号通路研究 |
| 1.2.3 家蚕JAK/STAT信号通路研究 |
| 1.3 JAK/STAT信号通路受体的研究进展 |
| 1.3.1 哺乳动物JAK/STAT信号通路受体研究进展 |
| 1.3.2 果蝇JAK/STAT信号通路受体DOME研究进展 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景及目的意义 |
| 2.2 科学问题及研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 BmDOME基因生物信息学分析及表达特征分析 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.1.5 引物设计 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 BmDOME的 CDS区的克隆 |
| 3.2.2 生物信息学分析所用软件及在线数据库 |
| 3.2.3 家蚕各组织RNA提取 |
| 3.2.4 c DNA的制备 |
| 3.2.5 实时q RT-PCR |
| 3.2.6 组织蛋白提取 |
| 3.2.7 Western Blot |
| 3.2.8 组织及细胞免疫荧光定位 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 家蚕BmDOME基因的克隆及序列分析 |
| 3.3.2 家蚕与其他物种DOME比对 |
| 3.3.3 家蚕BmDOME基因的时空表达特征分析 |
| 3.3.4 家蚕BmDOME的组织定位和亚细胞定位分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 BmDOME参与细胞增殖、凋亡的功能研究 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.1.5 引物设计 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 过表达载体构建 |
| 4.2.2 BmDOME基因双链合成 |
| 4.2.3 Bm E细胞复苏、培养与传代 |
| 4.2.4 细胞转染 |
| 4.2.5 家蚕细胞RNA提取 |
| 4.2.6 c DNA的制备 |
| 4.2.7 实时q RT-PCR |
| 4.2.8 细胞总蛋白提取 |
| 4.2.9 Western Blot |
| 4.2.10 细胞增殖Ed U染色 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 BmDOME过表达载体构建以及细胞水平过表达检测 |
| 4.3.2 细胞水平过表达BmDOME对细胞增殖、凋亡的影响 |
| 4.3.3 BmDOME基因双链合成以及效率检测 |
| 4.3.4 细胞水平干涉BmDOME对细胞增殖、凋亡的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 BmDOME参与家蚕翅原基发育的功能研究 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要溶液配制 |
| 5.1.5 引物设计 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 敲除靶位点选择 |
| 5.2.2 敲除引物设计及g RNA载体构建 |
| 5.2.3 家蚕BmDOME敲除品系的建立 |
| 5.2.4 家蚕组织的基因组提取 |
| 5.2.5 家蚕BmDOME敲除个体检测 |
| 5.2.6 家蚕组织RNA提取 |
| 5.2.7 c DNA的制备 |
| 5.2.8 实时q RT-PCR |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 BmDOME转基因敲除载体构建以及敲除个体获得 |
| 5.3.2 BmDOME转基因敲除个体检测 |
| 5.3.3 BmDOME转基因敲除个体表型观察 |
| 5.3.4 BmDOME影响家蚕翅发育异常的机制初探 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 综合与结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参研课题 |
| 致谢 |
| 附录 |
（5）基于iTRAQ蛋白分析技术初步探索红参粉对果蝇的抗衰老作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 抗衰老研究进展 |
| 1.1.1 衰老机制研究 |
| 1.1.2 抗衰老研究的实验模型 |
| 1.1.3 抗衰老药物研究 |
| 1.2 人参(红参)抗衰老研究进展 |
| 1.2.1 人参(红参)活性成分 |
| 1.2.2 人参(红参)药理活性 |
| 1.2.3 人参(红参)抗衰老作用研究 |
| 1.3 蛋白组学实验方法研究进展 |
| 第2章 红参粉对果蝇的抗衰老作用及其蛋白变化分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 野生型品系(Oregon K)黑腹果蝇 |
| 2.1.2 红参 |
| 2.1.3 实验试剂和耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 果蝇的培养 |
| 2.2.2 培养基的制备 |
| 2.2.3 黑腹果蝇雌、雄的分辨 |
| 2.2.4 红参粉对雌、雄果蝇寿命的影响 |
| 2.2.5 红参粉对雌、雄果蝇攀爬能力的影响 |
| 2.2.6 果蝇蛋白的制备 |
| 2.2.7 iTRAQ标记 |
| 2.2.8 LC-MS/MS蛋白分析 |
| 2.2.9 蛋白数据分析 |
| 2.2.10 生物信息学分析 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 红参粉对雌性果蝇寿命的影响 |
| 2.3.2 红参粉对雄性果蝇寿命的影响 |
| 2.3.3 红参粉对雌性果蝇攀爬能力的影响 |
| 2.3.4 红参粉对雄性果蝇攀爬能力的影响 |
| 2.3.5 蛋白质鉴定结果 |
| 2.3.6 雌性果蝇差异表达蛋白的鉴定 |
| 2.3.7 雄性果蝇差异表达蛋白的鉴定 |
| 2.3.8 雌性果蝇差异表达蛋白生物信息学分析 |
| 2.3.9 雄性果蝇差异表达蛋白生物信息学分析 |
| 2.4 实验小结 |
| 第3章 果蝇衰老相关差异蛋白的验证及与人参皂苷结合作用研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 野生型品系(Oregon K)黑腹果蝇 |
| 3.1.2 红参 |
| 3.1.3 实验试剂和耗材 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.1.5 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 果蝇的培养 |
| 3.2.2 培养基的制备 |
| 3.2.3 雌性果蝇差异表达蛋白基因的mRNA测定 |
| 3.2.4 雄性果蝇差异表达蛋白基因的mRNA测定 |
| 3.2.5 雌性果蝇差异表达蛋白Western blotting验证 |
| 3.2.6 雄性果蝇差异表达蛋白Western blotting验证 |
| 3.2.7 Autodock分子对接软件验证人参皂苷与差异蛋白的相互作用 |
| 3.2.8 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 雌性果蝇差异表达蛋白基因的mRNA测定 |
| 3.3.2 雄性果蝇差异表达蛋白基因的mRNA测定 |
| 3.3.3 雌性果蝇差异表达蛋白Western blotting验证 |
| 3.3.4 雄性果蝇差异表达蛋白Western blotting验证 |
| 3.3.5 Autodock分子对接软件验证人参皂苷与差异蛋白的相互作用 |
| 3.4 实验小结 |
| 第4章 红参粉对果蝇的抗衰老作用机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 野生型品系(Oregon K)黑腹果蝇 |
| 4.1.2 红参 |
| 4.1.3 实验试剂和耗材 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.1.5 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 雌性果蝇差异表达蛋白对衰老相关信号通路的影响 |
| 4.2.2 雄性果蝇差异表达蛋白对衰老相关信号通路的影响 |
| 4.2.3 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Pebp1 对雌性果蝇ERK信号通路和PI3K/AKT/FoxO信号通路的影响 |
| 4.3.2 spartin对雌性果蝇体内EGFR的影响 |
| 4.3.3 hppy、Rheb、Lpin对雄性果蝇PI3K/AKT/FoxO信号通路的影响 |
| 4.4 实验小结 |
| 4.4.1 红参粉对雌性果蝇的抗衰老作用机制 |
| 4.4.2 红参粉对雄性果蝇的抗衰老作用机制 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 红参粉对雌性果蝇的抗衰老作用及机制研究 |
| 5.2 红参粉对雄性果蝇的抗衰老作用及机制研究 |
| 5.3 红参粉对雌性、雄性果蝇的抗衰老作用及机制比较 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 今后工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）褐飞虱铁蛋白基因的功能分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 褐飞虱概况 |
| 1.1.1 褐飞虱危害方式 |
| 1.1.2 褐飞虱的防治现状 |
| 1.2 铁蛋白的研究概况 |
| 1.2.1 铁蛋白的结构 |
| 1.2.2 铁蛋白与体铁蛋白的发现与分布 |
| 1.2.3 昆虫铁蛋白的功能 |
| 1.2.3.1 维持铁稳态与抗氧化功能 |
| 1.2.3.2 参与免疫反应 |
| 1.2.3.3 铁蛋白的其它生理功能 |
| 1.3 RNAi技术的应用 |
| 1.3.1 RNAi技术概述 |
| 1.3.2 RNAi技术在害虫防治中的应用 |
| 1.4 本研究主要内容和意义 |
| 第二章 褐飞虱NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer克隆与序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据来源 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.2.1 供试褐飞虱与饲养条件 |
| 2.1.2.2 主要实验试剂与仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.3.1 褐飞虱总RNA的提取 |
| 2.1.3.2 cDNA合成 |
| 2.1.3.3 PCR |
| 2.1.3.4 胶回收 |
| 2.1.3.5 T载体连接 |
| 2.1.3.6 感受态制备 |
| 2.1.3.7 热激转化 |
| 2.1.4 序列分析与同源性分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 褐飞虱NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer的序列特征 |
| 2.2.2 分子进化分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 褐飞虱NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer的时空表达模式 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 供试褐飞虱与饲养条件 |
| 3.1.1.2 主要实验试剂与仪器 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 褐飞虱样品收集 |
| 3.1.2.2 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 褐飞虱NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer在不同龄期的表达特征 |
| 3.2.2 褐飞虱NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer在不同组织的表达特征 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer对褐飞虱生长发育和生殖力的调控分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.1 供试褐飞虱与饲养条件 |
| 4.1.1.2 主要实验试剂与仪器 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 双链RNA(dsRNA)合成 |
| 4.1.2.2 褐飞虱显微注射前期准备 |
| 4.1.2.3 褐飞虱显微注射 |
| 4.1.2.4 基因干扰效率检测 |
| 4.1.2.5 产卵实验 |
| 4.1.2.6 卵巢解剖 |
| 4.1.2.7 褐飞虱甘油三酯含量检测 |
| 4.1.2.8 BCA蛋白浓度测定 |
| 4.1.2.9 褐飞虱蜜露和体重检测 |
| 4.1.2.10 尼罗红染色 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 褐飞虱若虫的 NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer的 RNA干扰结果 |
| 4.2.1.1 沉默NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer的若虫的存活率与表型分析 |
| 4.2.1.2 沉默NlFer1和NlFer2 的若虫表现为发育停滞 |
| 4.2.1.3 沉默NlFer1和NlFer2 对养分储存的影响 |
| 4.2.1.4 褐飞虱对dsNlFer1和dsNlFer2 的敏感性分析 |
| 4.2.2 褐飞虱雌性成虫的 NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer的 RNA干扰结果 |
| 4.2.2.1 NlFer1、NlFer2和Nlsoma-Fer的 RNA干扰效率检测 |
| 4.2.2.2 沉默NlFer1和NlFer2 的雌成虫的卵巢形态特征 |
| 4.2.2.3 沉默NlFer1和NlFer2 对卵孵化率的影响 |
| 4.2.2.4 沉默Nlsoma-Fer的 RNA干扰结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 NlFer1和NlFer2 对褐飞虱若虫生长发育的影响 |
| 4.3.2 NlFer1和NlFer2 对褐飞虱成虫繁殖力的影响 |
| 4.3.3 Nlsoma-Fer对褐飞虱的影响 |
| 第五章 褐飞虱NlFer1和NlFer2的dsRNA饲喂实验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.1.1 供试褐飞虱与饲养条件 |
| 5.1.1.2 主要实验试剂与仪器 |
| 5.1.2 dsRNA饲喂实验 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结与讨论 |
| 6.2 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（7）中华鲟五种组织细胞系建立及青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 细胞培养的研究进展 |
| 1.1.1 鱼类细胞培养的进程 |
| 1.1.2 鱼类细胞培养的方法 |
| 1.1.3 鱼类细胞所需要的培养条件 |
| 1.1.4 鱼类细胞的鉴定 |
| 1.1.5 鱼类细胞系的应用 |
| 1.2 生殖细胞的发育 |
| 1.2.1 鱼类生殖细胞发育的相关因子 |
| 1.2.2 鱼类生殖细胞特异表达基因 |
| 1.3 dazl基因研究进展 |
| 1.3.1 DAZ基因家族的结构和特征 |
| 1.3.2 DAZ家族成员的进化关系 |
| 1.3.3 DAZ家族的相关研究 |
| 1.3.4 鱼类中dazl的表达与功能研究 |
| 1.4 真核启动子 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 系统简介 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 中华鲟五种组织细胞系的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 中华鲟细胞的原代培养 |
| 2.2.4 中华鲟细胞的传代培养 |
| 2.2.5 中华鲟细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.6 中华鲟细胞生长曲线的测定 |
| 2.2.7 中华鲟细胞的染色体分析 |
| 2.2.8 中华鲟细胞18srRNA基因分析 |
| 2.2.9 中华鲟细胞系转染 |
| 2.2.10 中华鲟转基因细胞的构建 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 中华鲟细胞的原代培养 |
| 2.3.2 中华鲟细胞的传代培养 |
| 2.3.3 中华鲟细胞的冻存和复苏 |
| 2.3.4 中华鲟细胞生长曲线测定 |
| 2.3.5 中华鲟细胞染色体数和核型分析 |
| 2.3.6 中华鲟细胞18SrRNA分析 |
| 2.3.7 中华鲟细胞转染和转基因细胞系的建立 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 青鱼鳍条细胞的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 青鱼鳍条细胞的原代培养 |
| 3.2.4 青鱼鳍条细胞的传代培养 |
| 3.2.5 青鱼鳍条细胞的冻存与复苏 |
| 3.2.6 青鱼鳍条细胞最适生长条件选择 |
| 3.2.7 青鱼鳍条细胞的染色体分析 |
| 3.2.8 青鱼鳍条细胞分子鉴定 |
| 3.2.9 青鱼鳍条细胞免疫荧光分析 |
| 3.2.10 青鱼鳍条细胞脂质体转染和电转效率分析 |
| 3.2.11 SVCV病毒感染实验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 青鱼鳍条细胞的原代培养和传代培养 |
| 3.3.2 青鱼鳍条细胞的冻存和复苏 |
| 3.3.3 青鱼鳍条细胞最适的生长条件 |
| 3.3.4 青鱼鳍条细胞的染色体分析 |
| 3.3.5 青鱼鳍条细胞的分子鉴定 |
| 3.3.6 青鱼鳍条细胞的脂质体转染和电转效率分析 |
| 3.3.7 青鱼鳍条细胞的病毒测试 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 青鱼dazl基因克隆及表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 青鱼dazl基因克隆 |
| 4.2.4 序列比对分析 |
| 4.2.5 青鱼Dazl抗体的制备与验证 |
| 4.2.6 通过sqPCR分析dazlmRNA在不同组织及胚胎发育时期的表达 |
| 4.2.7 通过qRT-PCR定量分析dazlmRNA在不同发育时期胚胎中的表达 |
| 4.2.8 利用原位杂交技术分析dazlmRNA在组织和胚胎发育过程中的分布 |
| 4.2.9 Western blot分析Dazl蛋白在不同组织及胚胎发育不同时期的表达 |
| 4.2.10 免疫组化研究Dazl蛋白在卵巢组织中的空间分布 |
| 4.2.11 青鱼Dazl的亚细胞定位 |
| 4.2.12 青鱼dazl的启动子的扩增 |
| 4.2.13 青鳉dazl基因的的敲除 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 青鱼dazl基因克隆及序列分析 |
| 4.3.2 青鱼Dazl多克隆抗体的制备与验证 |
| 4.3.3 青鱼dazl基因在成体组织中的表达分析 |
| 4.3.4 青鱼dazl在胚胎发育过程中的表达分析 |
| 4.3.5 青鱼Dazl的亚细胞定位 |
| 4.3.6 青鱼dazl启动子克隆 |
| 4.3.7 青鱼dazl启动子活性分析 |
| 4.3.8 青鳉dazl基因的敲除及对青鳉PGCs形成的分析结果 |
| 4.4 讨论 |
| 本论文主要研究结果及创新点 |
| 本论文主要的研究结果 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 引物表 |
| 附录一 引物表(续表) |
| 附录二 质粒图谱 |
| 附录三 发表论文 |
| 致谢 |
（8）EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究工作的背景与意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 神经退行性疾病国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 Emc3基因研究历史与现状 |
| 1.2.2 神经退行性疾病发病种类和机制研究进展 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.3.1 主要贡献 |
| 1.3.2 创新 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 EMC3基因在神经退行性疾病发病机制的功能研究 |
| 2.1 课题背景 |
| 2.1.1 脑神经元病变 |
| 2.1.2 视网膜神经元病变 |
| 2.2 选题依据 |
| 2.2.1 EMC1基因突变导致脑和视网膜退行性疾病 |
| 2.2.2 EMC3是果蝇感光细胞合成视紫红质和多通道膜蛋白所必需 |
| 2.2.3 EMC3和EMC1 是以复合物形式存在 |
| 2.3 研究背景 |
| 2.3.1 内质网相关蛋白的合成和降解途径 |
| 2.3.2 内质网应激介导的非折叠蛋白应答途径 |
| 2.4 研究流程和关键技术 |
| 2.5 前期研究 |
| 2.5.1 已经报道的EMC1突变进行WB分析 |
| 2.5.2 EMC3在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.3 EMC5在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.4 内质网膜蛋白复合物亚基免疫共沉淀及WB检测 |
| 2.6 展望未来 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 Emc3缺失导致小脑共济失调和浦肯野细胞变性 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验技术原理 |
| 3.2.2 实验所用材料 |
| 3.2.3 实验所用方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9-lox P系统构建Emc3 基因敲除小鼠模型 |
| 3.3.2 利用PCR技术对Emc3 CKO小鼠DNA进行基因分型 |
| 3.3.3 Emc3 CKO条件性敲除小鼠生长发育异常 |
| 3.3.4 Emc3 CKO条件敲除型小鼠小脑发育异常 |
| 3.3.5 Emc3 CKO条件敲除型小鼠行为学异常 |
| 3.3.6 Emc3 CKO条件型敲除小鼠的磁共振成像 |
| 3.3.7 Emc3 CKO条件型敲除小鼠进行性小脑萎缩和浦肯野细胞丢失 |
| 3.3.8 Emc3 CKO条件敲除型小鼠浦肯野细胞变性和星形胶质细胞增生 |
| 3.3.9 Emc3 CKO小鼠浦肯野细胞中Emc3 的缺失导致内质网应激 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 浦肯野细胞Emc3缺失影响小鼠的运动协调能力 |
| 3.4.2 星形胶质细胞激活与浦肯野细胞死亡的关系 |
| 3.4.3 浦肯野细胞Emc3缺失怎样激发内质网应激 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Emc3的丢失导致视网膜杆状双极细胞变性 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 研究目的 |
| 4.3 实验材料和方法 |
| 4.3.1 实验技术原理 |
| 4.3.2 实验所用材料 |
| 4.3.3 实验所用方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Emc3在视网膜上的表达定位 |
| 4.4.2 Emc3 CKO小鼠Emc3 表达水平降低 |
| 4.4.3 Emc3 CKO小鼠视网膜的生理功能分析 |
| 4.4.4 PKCα抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.5 感光细胞抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.6 免疫组化和H&E染色结果 |
| 4.4.7 Emc3缺失损害视杆细胞和视杆双极细胞之间的突触传递 |
| 4.4.8 Emc3 CKO视网膜中的反应性神经胶质增生 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 玻璃体视网膜病变FZD4和NDP基因突变研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 伦理声明 |
| 5.2.2 全外显子组测序和变异确认 |
| 5.2.3 表达质粒的构建 |
| 5.2.4 荧光素酶报告分析 |
| 5.2.5 FZD4在细胞中的表达研究 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 测序结果分析 |
| 5.3.2 突变FZD4 蛋白介导的Norrin信号缺陷 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩写表 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（9）果蝇Gαq基因的多种剪接体介导光信号转导的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 G蛋白偶联受体信号通路的研究概述 |
| 1.1.1 GPCRs家族 |
| 1.1.2 G蛋白家族 |
| 1.1.3 经典的G蛋白信号传导通路 |
| 1.1.4 G蛋白信号传导通路的生理功能 |
| 1.2 果蝇视觉信号转导途径 |
| 1.2.1 参与视觉信号转导途径的重要分子 |
| 1.2.2 果蝇的视网膜退化 |
| 1.2.3 果蝇光信号转导的研究展望 |
| 1.3 本课题拟解决的问题 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 果蝇品系、突变体筛选、果蝇的饲养、果蝇的同源重组整合、纯合突变细胞果蝇的构建 |
| 2.1.1 果蝇品系 |
| 2.1.2 突变体果蝇的制备与筛选 |
| 2.1.3 果蝇的饲养 |
| 2.1.4 果蝇的同源重组整合 |
| 2.1.5 纯合突变细胞果蝇的构建 |
| 2.2 inverse PCR |
| 2.2.1 果蝇基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 限制性酶HpaⅡ消化DNA |
| 2.2.3 DNA连接 |
| 2.2.4 乙醇沉淀 |
| 2.2.5 PCR |
| 2.3 转基因果蝇载体的构建 |
| 2.3.1 pUAST-attB-Gαq3 重组质粒的构建 |
| 2.3.2 pUAST-attB-CG30054-E重组质粒的构建 |
| 2.3.3 pUAST-attB-CG17760 重组质粒的构建 |
| 2.4 突变体果蝇中sgRNA以及donor质粒的制备 |
| 2.4.1 pU6-Bbs I-chi RNA-sgRNA重组质粒的构建 |
| 2.4.2 pHD-Ds Red-CG17760 同源臂重组质粒(donor质粒)的构建 |
| 2.5 融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.5.1 GST融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.5.2 麦芽糖融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.5.3 His融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.6 抗体的制备 |
| 2.7 抗体的纯化 |
| 2.8 分离果蝇的眼睛和大脑 |
| 2.9 Western blot蛋白印迹 |
| 2.10 RNA的提取、体外转录、实时荧光定量PCR |
| 2.10.1 RNA的提取 |
| 2.10.2 体外转录(Invitrogen,Cat#18080051) |
| 2.10.3 实时荧光定量PCR(TaKaRa,Cat#RR066A) |
| 2.11 Arr2 结合实验 |
| 2.12 电镜(染结构) |
| 2.13 果蝇头部切片免疫染色 |
| 2.14 果蝇脑部免疫染色 |
| 2.15 ERG记录和细胞内记录 |
| 2.15.1 ERG记录 |
| 2.15.2 细胞内记录(Intracellular Recording) |
| 2.16 实验设计和数据统计分析 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 G蛋白缺失导致果蝇没有光反应 |
| 3.1.1 光信号转导途径缺陷突变体的筛选 |
| 3.1.2 遗传背景的基因突变引起nlr突变体对光刺激没有反应 |
| 3.1.3 nlr突变体果蝇的缺陷表型是由G蛋白缺失导致 |
| 3.2 Gαq1和Gαq3 共同介导果蝇的光信号转导 |
| 3.2.1 nlr突变体中Gαq1 剪接体的点突变导致其光反应显着降低 |
| 3.2.2 Gαq3 蛋白介导Gαq1 完全缺失突变品系中残留的光反应 |
| 3.2.3 Gαq的同源物CG30054和CG17760 不参与果蝇的视觉信号传导途径 |
| 3.3 完全缺失Gαq蛋白导致视网膜退化 |
| 3.3.1 缺失所有Gαq剪接体引起严重的光依赖性视网膜退化缺陷 |
| 3.3.2 缺失Gαq蛋白导致稳定的Rh1/Arr2 复合物的积聚 |
| 3.4 Gαq3 介导Rh1 合成 |
| 3.4.1 Gαq3 在Rh1 合成过程中发挥关键作用 |
| 3.4.2 Rh1 正确转运至rhabdomere需要Gαq3 蛋白的作用 |
| 3.5 总结与讨论 |
| 3.5.1 G蛋白的GTPase结构域中关键位点的突变影响下游信号通路 |
| 3.5.2 近端启动子中的P3 基序影响光反应的活化 |
| 3.5.3 Gαq基因的多种剪接体共同介导GPCR信号传导通路 |
| 3.5.4 完全缺失Gαq蛋白导致严重的视网膜退化疾病 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 科研成果 |
| 获得奖项 |
| 参加会议 |
（10）萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因克隆及功能探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 萝卜蚜概述 |
| 1.1.1 萝卜蚜形态特征 |
| 1.1.2 萝卜蚜生活习性 |
| 1.1.3 萝卜蚜危害 |
| 1.1.4 萝卜蚜综合防治 |
| 1.2 端粒和端粒逆转录酶 |
| 1.2.1 端粒结构与概念 |
| 1.2.2 端粒功能 |
| 1.2.3 端粒酶结构与概念 |
| 1.2.4 端粒酶功能 |
| 1.2.5 端粒逆转录酶TERT基因功能研究 |
| 1.2.6 端粒及端粒酶在昆虫中的研究 |
| 1.3 RNA干扰(RNA inference)简介 |
| 1.3.1 RNAi发现历史 |
| 1.3.2 RNAi的作用机制 |
| 1.4 RNA干扰的常用方法 |
| 1.4.1 显微注射法 |
| 1.4.2 浸泡法 |
| 1.4.3 饲喂法 |
| 1.5 RNAi技术在昆虫学研究中的研究进展 |
| 1.5.1 昆虫中基因功能的研究 |
| 1.5.2 害虫防治 |
| 1.6 本研究的目的意义及创新点 |
| 1.6.1 本研究的目的意义 |
| 1.6.2 本研究创新点 |
| 1.7 研究内容与技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试仪器 |
| 2.1.3 供试试剂及缓冲液配制 |
| 2.1.4 供试引物序列 |
| 2.2 萝卜蚜TERT基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.2.1 基因检测样品收集 |
| 2.2.2 萝卜蚜总RNA提取(Trizol法) |
| 2.2.3 cDNA合成 |
| 2.2.4 端粒逆转录酶TERT基因CDS序列克隆 |
| 2.2.5 端粒逆转录酶TERT基因生物信息学分析 |
| 2.3 萝卜蚜TERT基因时间及时空表达 |
| 2.3.1 基因检测样品收集 |
| 2.3.2 萝卜蚜总RNA提取(Trizol法) |
| 2.3.3 cDNA合成 |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR分析TERT表达量 |
| 2.4 萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因RNAi研究 |
| 2.4.1 dsRNA表达载体的构建 |
| 2.4.2 dsRNA表达检测 |
| 2.4.3 dsRNA表达纯化 |
| 2.4.4 dsRNA降解情况检测 |
| 2.4.5 萝卜蚜dsRNA饲喂和生物测定 |
| 2.4.6 利用q RT-PCR检测RNA干扰效率 |
| 2.5 转端粒逆转录酶TERT基因拟南芥构建 |
| 2.5.1 转基因表达载体构建 |
| 2.5.2 转基因表达载体检测 |
| 2.5.3 转基因拟南芥的构建 |
| 2.5.4 阳性植株筛选及PCR检测 |
| 2.6 RNA干扰后萝卜蚜转录组分析 |
| 2.6.1 转录组样品收集 |
| 2.6.2 Illumina测序和序列组装 |
| 2.6.3 Unigene功能注释 |
| 2.6.4 基因表达差异分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因生物信息学分析 |
| 3.1.1 萝卜蚜端粒酶TERT基因PCR扩增检测 |
| 3.1.2 萝卜蚜TERT基因编码氨基酸残基序列 |
| 3.1.3 萝卜蚜TERT二级结构预测 |
| 3.1.4 萝卜蚜TERT三级结构预测 |
| 3.1.5 萝卜蚜TERT基因同源性比对 |
| 3.1.6 萝卜蚜TERT基因系统发育树构建 |
| 3.2 萝卜蚜TERT基因时间及时空表达检测 |
| 3.2.1 端粒逆转录酶TERT基因在萝卜蚜不同龄期的表达分析 |
| 3.2.2 端粒逆转录酶TERT基因在萝卜蚜不同组织的表达分析 |
| 3.3 沉默TERT基因对萝卜蚜生长发育的影响 |
| 3.3.1 TERT基因的ds RNA表达载体的构建 |
| 3.3.2 Pet-2p-TERT的 ds RNA的表达检测及纯化 |
| 3.3.3 dsRNA降解情况检测 |
| 3.3.4 TERT基因沉默24-72 h后的m RNA表达水平 |
| 3.3.5 TERT基因沉默对萝卜蚜生长发育的影响 |
| 3.4 转TERT基因拟南芥的构建 |
| 3.4.1 转基因拟南芥载体检测 |
| 3.4.2 转基因拟南芥阳性植株筛选 |
| 3.5 RNA干扰后萝卜蚜转录组分析 |
| 3.5.1 RNA完整性检测 |
| 3.5.2 RNA文库检测和定量 |
| 3.5.3 萝卜蚜转录组序列分析和组装 |
| 3.5.4 基因功能注释 |
| 3.5.5 GO分类 |
| 3.5.6 KEGG注释 |
| 3.5.7 KOG注释 |
| 3.5.8 差异表达基因的筛选 |
| 3.5.9 差异表达基因GO和 KEGG富集分析 |
| 3.5.10 分析探究TERT基因调控差异基因表达 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
四、转基因技术在果蝇及脊椎动物心脏基因研究中的应用（论文参考文献）
- [1]植物挥发性化合物DMNT毒杀小菜蛾的机制解析[D]. 陈晨. 安徽农业大学, 2021(01)
- [2]BMP信号通路影响罗氏沼虾附肢再生的分子机制初步研究[D]. 周婷婷. 广东海洋大学, 2021(02)
- [3]转录因子Apontic抑制肿瘤转移的机理研究[D]. 张文硕. 山东农业大学, 2021(01)
- [4]家蚕细胞因子受体BmDOME基因的鉴定与功能研究[D]. 王亚萍. 西南大学, 2021(01)
- [5]基于iTRAQ蛋白分析技术初步探索红参粉对果蝇的抗衰老作用及其机制研究[D]. 侯微. 吉林大学, 2021(01)
- [6]褐飞虱铁蛋白基因的功能分析[D]. 陈远志. 浙江大学, 2021(01)
- [7]中华鲟五种组织细胞系建立及青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定[D]. 王艺舟. 华中农业大学, 2020
- [8]EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究[D]. 朱雄. 电子科技大学, 2020(03)
- [9]果蝇Gαq基因的多种剪接体介导光信号转导的机制研究[D]. 顾秋香. 东南大学, 2020
- [10]萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因克隆及功能探究[D]. 张鑫泽. 华中农业大学, 2020(02)