导读:本文包含了快激活延迟整流钾电流论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:延迟整流钾电流,离子通道,心脏病,手术后
快激活延迟整流钾电流论文文献综述
王小艳,吴婷婷,庞斯斯,王森[1]（2018）在《温度对豚鼠心肌细胞快激活延迟整流钾电流的调节》一文中研究指出快激活延迟整流钾电流(Ikr)是心肌细胞复极化的主要电流,抑制Ikr可使动作电位时程延长,引起早后除极,致心律失常的发生。编码人类心肌细胞Ikrα亚单位的基因为h ERG(human ether-a-go-go-related gene,或KCNH2)[1]。该基因突变可导致遗传性长QT综合征-2 LQTS-2,而许多抗心律失常药物及非抗心律失常药物对h ERG通道的过度抑制(本文来源于《基础医学与临床》期刊2018年11期）
勾向博[2]（2017）在《蛋白激酶C亚型特异性调控慢激活延迟整流钾电流及其分子机制》一文中研究指出延迟整流钾电流(I_K)包括快激活I_Kr和慢激活I_Ks两种成分,其中KCNQ1和KCNE1分别编码I_Ks通道的孔区α亚单位和辅助β亚单位。I_Ks是大动物2、3相复极的重要电流。已有报道,KCNQ1及KCNE1基因突变引起I_Ks减小或者增大,致动作电位复极延迟或加速,心电图上分别表现为长QT综合征(long QT syndrome,LQT1或者LQT5)和短QT综合症(short QT syndrome,SQT2)。在高血压、冠心病和心肌缺血等引发的心肌肥厚和心衰以及糖尿病等病理状态下,均伴有I_Ks减小,而这是造成获得性LQT综合征的重要原因。LQT和SQT均以高发室性心律失常为特征。因此,研究KCNQ1/KCNE1通道的功能调节具有重要意义。据报道,磷酸化是通过调节通道功能从而影响心肌电生理功能的有效方式之一,其中PKC磷酸化对离子通道的调控备受关注。早期实验结果显示,PKC对克隆的小鼠、大鼠心脏的I_Ks表现明显的抑制作用,而对豚鼠心脏的I_Ks表现为增大作用,对此种属依赖性产生的原因解释为,PKC使KCNE1的Ser102位点磷酸化而抑制电流,而豚鼠缺乏此位点,故表现为增大电流。最新研究表明,PKC磷酸化KCNE1-S102后,通过加快膜蛋白内吞而下调通道功能。然而,激活PKC可增大表达人源的KCNQ1/KCNE1通道电流(KCNE1上存在S102),故KCNQ1上存在可上调通道功能的磷酸化位点。我实验研究结果发现,在豚鼠心室肌细胞(KCNE1上缺乏S102),通过激活PKC通路抑制I_Ks。综上,激活PKC对I_Ks的调控作用表现为增大电流和抑制电流两种结果。由于不同PKC亚型对通道功能可能具有相反的作用,因此我们推测PKC对I_Ks不一致的调控结果可能由不同的PKC亚型所致。有报道PKCβⅡ、ε亚型选择性增大I_Ks,而α、β1、δ亚型对电流没有明显影响;PKCε亚型中介PMA和肾上腺素α受体增大豚鼠心房I_Ks的作用。综上,PKC可显着地调控I_Ks功能,但迄今对于不同PKC亚型特异性调控I_Ks的认识非常有限。为此,本研究主要采用膜片钳电生理技术拟解决以下问题(1)激活不同PKC亚型对I_Ks的调节作用。(2)确定介导抑制、增大I_Ks两种相反作用的PKC亚型。(3)PKC亚型特异性调控I_Ks的分子机制。第一部分不同PKC亚型对I_Ks的调节作用目的:激活不同PKC亚型对I_Ks的影响。方法:构建稳定表达KCNQ1和KCNE1的HEK293细胞线,观察PMA、cPKC激动肽和PKCε激动肽对通道电流的影响。为避免电流的衰减,实验采用穿孔膜片全细胞模式记录I_Ks。结果:在稳定转染I_Ks的HEK293细胞,外液中加入PMA(100 nM)后,去极化外向电流及复极化的尾电流明显增加。在+50mV电压下,尾电流密度由37.20±6.98 pA/pF 增加到 45.39±7.01 pA/pF(P<0.05)。PMA对I_Ks的增大作用5min出现,10-15 min左右达到稳态,冲洗后不能完全恢复。由激活曲线得出给药前V_1/2和斜率因子分别为20.04±1.31 mV和15.69±0.76,应用PMA后的V_1/2和斜率因子分别为14.48±2.21 mV和16.99±1.94,PMA使I_Ks激活曲线发生左移。在电压+10 mV～+50 mV范围内,PMA可明显降低通道的激活时间常数,在+50 mV电压下,激活时间常数由926.14±128.01 ms减小到756.57±115.23 ms(P<0.05)。在电极内液中加入cPKC激动肽和PKCε激动肽及其各自乱码对照肽(所有肽都连接穿孔肽),结果如下:与cPKC对照肽相比,cPKC激动肽使I_Ks电流密度增加,当电压去极至+50 mV时,尾电流密度由26.26±4.46 pA/pF(cPKC 对照肽)增加到 37.13±4.72 pA/pF(cPKC激动肽)(P<0.05)。应用cPKC对照肽激活曲线的V_1/2和斜率因子分别为18.03±2.2 mV和17.8±1.5,而应用cPKC激动肽激活曲线的V1/2和斜率因子分别为8.9±2.7mV和15.6±0.9,曲线明显发生左移。在电压+10 mV～+50 mV范围内,cPKC激动肽可明显减小通道的激活时间常数,在+50 mV,激活时间常数由1142.09±168.85 ms降低到608.71±99.38 ms(P<0.05)。与PKCε对照肽相比,PKCε激动肽使I_Ks电流密度下降,当电压去极至+50 mV时,尾电流密度由40.81±6.78 pA/pF(PKCε 对照肽)下降到 16.68±2.26 pA/pF(PKCε 激动肽)(P<0.01),而激活曲线V1/2和斜率因子没有发生改变,激活时间常数也没有发生改变。小结:PMA和cPKC激动肽增大I_Ks,使通道激活曲线发生左移,降低激活时间常数;PKCε激动肽抑制I_Ks,但不影响激活曲线和激活时间常数。第二部分确定中介I_Ks不同调节的PKC亚型目的:前期报道血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)通过PKC信号通路抑制豚鼠心室肌I_Ks,第一部分实验发现PMA增大I_Ks,为此本部分实验确定中介抑制、增大I_Ks两种相反作用的PKC亚型。方法:在稳定转染I_KsHEK293细胞上,瞬时转染人的Ang Ⅱ受体AT1cDNA,观察AngⅡ对I_Ks的影响。进一步采用siRNA技术分别敲低PKCα PKCβ和PKCε亚型,观察AngⅡ和PMA对以上细胞的调节作用,从而确定中介抑制、增大I_Ks两种相反作用的PKC亚型。结果:首先在表达系统进一步确定Ang Ⅱ对I_Ks的影响。在稳定转染I_Ks的HEK293细胞上,共转染人AT1 cDNA,外液中加入Ang Ⅱ(100 nM)后2-3 min去极化外向电流及复极化的尾电流均明显减小,10-15 min左右达到稳态,在+50 mV,尾电流密度由55.40±11.03 pA/pF减小到42.29±8.89pA/pF(P<0.05),抑制作用冲洗后不能完全恢复。其中约400%细胞在给药后1 min出现一过性微弱增大(约7%)。在0.1-1000 nM范围内,Ang Ⅱ以浓度依赖性方式抑制I_Ks,以I_Ks尾电流抑制率为纵坐标做Ang Ⅱ抑制I_Ks的量效曲线,经Hill方程拟合后得到IC50=7.5 nM。Ang Ⅱ对I_Ks的半数激活电压及激活时间常数都没有影响。转染siRNA特异性敲低PKC亚型的表达,观察Ang Ⅱ(K100 nM)和PMA(100 nM)对抑制、增大I_Ks的影响。结果发现,转染PKCα+PKCβ siRNA后,Ang Ⅱ对I_Ks的抑制作用与转染对照siRNA无明显差别;而转染PKCε siRNA特异性敲低PKCε表达后,Ang Ⅱ对尾电流的抑制(+50 mV下)显着弱于对照(10.95%vs 26.06%,P<0.05),表明Ang Ⅱ对电流的抑制由PKCε中介。转染(乱码)对照PKC siRNA后,PMA使I_Ks(+50 mV下)增加31.84%,分别敲低PKCα、PKCβ的表达,PMA对尾电流的增加幅度较对照显着减弱,分别为16.82%(P<0.05)、10.58%(P<0.01);共同敲低 PKCα 和 PKCβ后,电流增强作用几乎消失;敲低PKCε的表达不影响PMA的作用(28.87%vs 31.84%,P>0.05)。表明PMA对电流的增强作用由cPKC的PKCα和PKCβ中介。小结:以上的实验表明,AngⅡ对克隆人的I_Ks呈现抑制作用,此抑制作用由PKCε中介,而PMA对I_Ks的增强作用由PKCα和PKCβ中介。第三部分PKC亚型特异性调控I_Ks的分子机制目的:分析不同PKC亚型对I_Ks调节的分子机制。方法:分别突变KCNQ1、KCNE1上PKC的潜在磷酸化位点,观察Ang Ⅱ和PMA抑制、增强电流作用的改变,分析不同PKC亚型对通道调控的分子机制。结果:KCNQ1上N端有2个、C端有4个评分较高的PKC潜在磷酸化位点,分别是S95、T96和S409、S464、T513、S577,而KCNE1上只有一个潜在PKC磷酸化位点,即S102。将上述KCNQ1上6个和KCNE1上的1个潜在磷酸化位点分别突变为丙氨酸,另外同时将KCNQ1 上N端2个或C端4个潜在磷酸化位点突变,分别为 KCNQ1-2M(含 N 端 S95A 和 T96A)和 KCNQ1-4M(含 C 端 S409A、S464A、T513A、S577A)。经检测,上述所有突变通道的动力学特征与野生型一致。我们发现,Ang Ⅱ(100 nM)对 KCNQ1/KCNE1-S102A突变通道尾电流的抑制程度明显小于对野生型通道的抑制(10.84%,vs 30.59%,P<0.05),以上结果提示KCNE1上的S102是PKC抑制通道功能的磷酸化位点。同时我们注意到,KCNE1上S102突变后AngⅡ对通道的抑制作用并没有完全消失,推测除S102外,KCNQ1上也存在抑制通道功能的磷酸化位点。进一步的实验表明,Ang Ⅱ对KCNQ1N端突变通道(KCNQ1-2M)尾电流的抑制程度为11.71%,显着弱于对野生型通道的作用(30.59%,P<0.01),而KCNQ1的C端突变(KCNQ1-4M)和并不影响Ang Ⅱ的抑制作用(30.62%,P>0.05)。以上结果说明,KCNQ1的N端参与PKC对通道功能的抑制。分别突变N端的S95和T96均可减弱Ang Ⅱ对通道的抑制作用,对S95A和T96A通道的抑制分别为15%(P<0.01)和16.33%(P<0.01),说明S95和T96都参与PKC抑制通道功能。联合突变KCNQ1的N端与 KCNE1 的 S102 后,Ang Ⅱ 对通道(KCNQ1-2M/KCNE1-S102A)的抑制作用几乎消失(2.76%,P<0.01)。以上结果说明PKC在I_Ks上有叁个抑制位点,分别是KCNQ1上的S95、T96和KCNE1上的S102。KCNE1上S102突变并不影响PMA增大I_Ks的作用,我们推断KCNQ1亚基有增强通道功能的位点。PMA对KCNQ1-2M/KCNE1和KCNQ1-4M/KCNE1通道的电流增加分别为31.74%和3.18%,N端突变与野生型通道作用无明显区别(P>0.05),而C端突变几乎取消了其增强作用。结果说明KCNQ1亚基C端参与PKC对通道作用的增强性调控。进一步分别突变C端四个位点,结果显示,PMA对S409A、S464A、T513A、S577A突变通道电流分别增加12.98%、8.56%、6.37%以及11.71%,均较野生型显着降低。结果说明KCNQ1亚基C端的S409、S464、T513以及S577是PKC增强通道功能的磷酸化位点。我们进一步在HEK293细胞上表达克隆的豚鼠KCNQ1/KCNE1通道,将KCNQ1上N端唯一的潜在磷酸化位点S96突变为丙氨酸后,Ang Ⅱ对突变通道的抑制作用几乎消失,进一步表明KCNQ1上N端磷酸化抑制通道功能。小结:KCNQ1亚基存在PKC抑制、增强通道功能的位点,N端磷酸化抑制通道功能,而C端磷酸化增强通道功能;KCNE1上的S102磷酸化则抑制通道功能。(本文来源于《河北医科大学》期刊2017-04-01）
刘雪莉[3]（2016）在《PKCα亚型中介α_(1A)肾上腺素受体下调快激活延迟整流钾电流及其机制》一文中研究指出哺乳类动物心室肌细胞延迟整流钾电流包括快、慢激活两种成分,其中负责快激活成分IKr的通道孔区亚单位由hERG(human ether-a-go-go-related gene)基因编码,hERG通道的激活引发动作电位3期复极的开始,对心肌的复极化有重要作用。h ERG基因突变是引发离子通道病的遗传分子基础。此外,疾病状态下,如高血压、冠心病、心肌缺血等引发的心肌肥厚和心衰以及糖尿病等,均伴有IKr下调,是造成获得性LQT综合征的重要原因。越来越多的证据表明,同其它细胞功能一样,磷酸化是调节hERG通道功能进而影响心肌电生理特性的有效方式,其中催化磷酸化反应的蛋白磷酸激酶C(protein kinase C,PKC)家族对hERG通道的调控备受关注。PKC依据它们的结构和激活的机制分为3类:即传统型PKC(cPKC,包括α、βI、βII和γ),为Ca2+依赖性的,被二脂酰甘油(DAG)、磷脂酰丝氨酸(PS)激活;新型PKC(nPKC,包括δ、ε、π和θ),为非Ca2+依赖性,被DAG和PS激活;非典型PKC(aPKC,包括ζ、?/λ),为非Ca2+依赖性,被PS激活。已知心肌细胞存在多种PKC亚型,可催化膜离子通道蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸化,是神经体液因素调控通道功能的关键中介物。实验显示,缺血缺氧、血管紧张素II、氧化应激(H2O2)等不同病理刺激可激活心肌不同的PKC亚型,而不同PKC亚型可能对离子通道发挥不同的调节作用,如Makary等发现不同的PKC亚型对乙酰胆碱激活的K+通道存在激活与抑制两种不同的调控作用。有研究表明,?1A肾上腺素受体激活对hERG钾通道呈现急性下调作用,我们的前期研究发现Ang II激动AT1受体同样对hERG通道发挥急性抑制作用。AT1受体与?1A肾上腺素受体同属于Gq蛋白偶联受体,而PKC是受体激活后调控通道的主要中介分子。然而,二者对通道抑制的方式表现不同,激动?1A肾上腺素受体使通道激活曲线右移,而AT1受体激动并不影响通道的电压依赖性激活。由此我们推测,两种不同的Gq蛋白偶联受体可能通过不同的PKC亚型对通道发挥抑制作用。为验证以上假设,本研究主要采用全细胞膜片钳技术和westernblot技术,探索?1a肾上腺素受体激动剂a61603对豚鼠心室肌细胞以及异源表达系统hek293细胞上ikr/herg电流的影响。利用pkc亚型选择性抑制剂(抑制肽)以及激活肽,分析其中介的pkc亚型,并同angii对herg通道的调控作用相对比。同时利用磷酸化位点突变通道分析不同pkc亚型对通道调控的分子机制。第一部分?1a肾上腺素受体通过pkc?亚型抑制心室肌细胞ikr目的:观察选择性?1a肾上腺素受体激动剂a61603对成年豚鼠心室肌细胞快激活延迟整钾电流ikr的影响,分析中介其作用的pkc亚型。方法:在急性分离的豚鼠心室肌细胞上,全细胞膜片钳技术记录ikr,观察a61603对电流影响。结果:(1)a61603以浓度依赖的方式抑制ikr,ic50是300nm。在激活电压为+40mv时,a61603(1μm)作用10分钟ikr电流密度由对照组的0.93±0.04pa/pf下降至0.62±0.07pa/pf(p<0.01)。(2)选择性?1a肾上腺素受体抑制剂wb4101,以及pkc非选择性抑制剂bis-1明显减弱a61603对ikr的抑制作用,而pka非选择性抑制剂h89对其作用无显着影响。表明a61603激动?1a肾上腺素受体主要通过pkc途径抑制ikr。(3)pkc选择性抑制剂g?6976(抑制pkc?,?,?)与g?6983(抑制pkc?,?,?,δ,ζ)以及pkc?选择性抑制肽?c2-4明显减弱a61603对ikr的抑制作用,特异性pkcε抑制肽εv1-2无此作用。表明a61603激动?1a肾上腺素受体通过pkc?亚型抑制ikr。小结:在急性分离的豚鼠心室肌细胞上,a61603激动?1a肾上腺素受体对ikr产生急性抑制作用,这种抑制作用主要由pkc?介导。第二部分不同pkc亚型对herg电流的调节作用目的:在异源表达系统hek293细胞上研究pkc亚型激活肽对herg电流的作用,同时验证?1a肾上腺素受体激动对herg电流的调控作用,进一步验证?1a肾上腺素受体激动通过pkc?亚型抑制herg电流。方法:在共表达herg和人?1a肾上腺素受体基因的hek293细胞上,全细胞膜片钳技术记录herg电流,观察a61603及pkc亚型激活肽对电流影响,其中a61603为细胞外灌流给药方式,而pkc亚型激活肽采用细胞内电极内液给药方式。结果:(1)cpkc激活肽(cpkc-ap)与pkcε激活肽(ε-ap)均急性抑制herg电流。cpkc-ap对herg通道的半数激活电压v1/2由对照组的-18.6mv右移至-9.5mv(p<0.01),而ε-ap并未影响通道v1/2(p>0.05)。cpkc-ap与ε-ap降低通道电导率gmax分别降至对照组的56.8%与80.6%。(2)a61603急性抑制herg电流,半数激活电压v1/2由对照组的-16.9mv右移至-11.8mv(p<0.01),通道电导率gmax降低为对照组的70.8%,a61603对herg电流的影响与cpkc-ap的作用相近。(3)cpkc-ap减慢各去极化电压下herg通道的激活,ε-ap减慢去极化至0mv与20mv电压下herg通道的激活,对去极化至40mv与60mv电压下herg通道的激活无影响;cpkc-ap减慢herg通道的去活,ε-ap使herg通道的缓慢去活时间常数降低,快速去活时间常数无变化;cpkc-ap与ε-ap对herg电流的稳态失活与恢复均无影响。小结:在异源表达系统hek293细胞上,cpkc激活肽与pkcε激活肽对herg通道呈现不同的抑制方式。a61603急性抑制herg电流并使得v1/2右移且gmax下降,此作用与cpkc激活肽相似,进一步提示a61603激动?1a肾上腺素受体通过cpkc亚型抑制ikr。第叁部分?1a肾上腺素受体通过pkc?亚型抑制ikr/herg电流的机制目的:观察?1a肾上腺素受体激动对pkc亚型激活的影响,以及不同pkc亚型调节herg通道的分子机制。方法:在急性分离豚鼠心室肌细胞上,?1a肾上腺素受体激动剂a61603急性作用10分钟后,提取全细胞蛋白,采用pkcα与pkcε的磷酸化抗体做westernblot,以磷酸化pkc亚型蛋白含量的变化反映激动?1a受体对pkc亚型的选择性激活作用。在共表达herg-?pkc(将herg通道中18个潜在pkc磷酸化位点中除t74外的17个丝氨酸/苏氨酸突变)和人?1a肾上腺素受体基因的hek293细胞上,全细胞膜片钳技术记录herg电流,观察a61603及pkc亚型激活肽对电流影响,探究?1a肾上腺素受体激动抑制ikr/herg电流的分子机制。其中a61603采用细胞外灌流给药方式,而pkc亚型激活肽采用细胞内电极内液给药方式。结果:(1)a61603作用10分钟后使得豚鼠心室肌细胞p-pkcα亚型表达量增加至对照的2.72±0.25倍(p<0.01),而p-pkc?亚型无显着变化(p>0.05),表明?1a肾上腺素受体激动选择性激活pkcα亚型。(2)在瞬转突变通道的hek293细胞上,cpkc激活肽急性抑制herg-?pkc电流,pkcε激活肽对herg-?pkc电流无影响,两种亚型激活肽均未影响herg-?pkc电流的半数激活电压v1/2。(3)激活电压为0mv时,cpkc激活肽对herg-?pkc和herg-wt的尾电流与对照组相比分别降低39.3%与37.4%,电流抑制率无显着差异,gmax亦无统计学差异,表明cpkc激活对通道的下调作用与17个磷酸化位点关系不大,可能通过直接磷酸化t74位点或者其它非直接磷酸化途径实现;pkcε激活肽对herg-wt通道电流抑制率为29.3%,但对herg-?pkc尾电流几乎无影响,即通道磷酸化突变几乎取消了pkcε激活肽的作用,提示pkcε激活肽通过通道磷酸化调控通道功能。(4)a61603急性抑制herg-?pkc电流,激活电压为0mv时,电流密度抑制率为31.8%,与其对herg-wt尾电流的抑制率28.4%无统计学差异。表明当herg钾通道的17个pkc磷酸化位点突变后,a61603对通道尾电流的抑制作用依然存在,此作用与cpkc激活肽对通道作用相似。尽管理论上cpkc激活肽可激活包括α、βi、βii以及γ等在内的传统pkc亚型,由于pkcα介导a61603的作用,cpkc激活肽与a61603对通道呈现相似的调控方式提示cpkc激活肽主要激活pkcα。小结:?1a肾上腺素受体激动选择性激活pkcα亚型。pkcα和pkcε亚型通过不同的分子途径调控herg通道:pkcα可能通过直接磷酸化t74位点或者其它非直接磷酸化途径下调herg通道功能,而pkcε通过对herg通道的直接磷酸化抑制电流。结论:1在急性分离的豚鼠心室肌细胞和异源表达系统上,?1a肾上腺素受体激动剂a61603对ikr/herg电流呈现浓度依赖性抑制,此作用由pkcα亚型中介。2激动?1a肾上腺素受体可选择性激活pkcα亚型。3pkcα和pkcε亚型通过不同的分子途径调控herg通道:前者可能通过磷酸化t74位点或非通道磷酸化途径而急性抑制herg电流,而pkcε通过对hERG通道的直接磷酸化使Gmax降低而急性抑制电流。(本文来源于《河北医科大学》期刊2016-04-01）
宾晓红,曾晓荣[4]（2014）在《超速激活延迟整流钾电流与心房颤动》一文中研究指出超速激活延迟整流钾电流(IKur)是一种在人心房肌细胞特异性表达,而心室肌不表达(或低表达)的离子通道。IKur参与心房复极的Ⅰ相和Ⅱ相,通过影响心房肌细胞动作电位时程(action potential duration,APD)和有效不应期(effective refractory period,ERP)而影响心房的正常节律和频率,它的电活动异常与心房颤动(简称房颤,atrial fibrillation,AF)的发生和维持有着密切关系。近年来,对IKur的分子结构、功能研究(本文来源于《泸州医学院学报》期刊2014年03期）
曾芳[5]（2014）在《β_3肾上腺素能受体对慢性心力衰竭大鼠左心房肌细胞超速激活延迟整流钾电流的影响》一文中研究指出目的：建立慢性心力衰竭（CHF）及在此基础上β3肾上腺素能受体（β3-AR）进一步上调的大鼠模型，探讨β3-AR对CHF大鼠左心房肌细胞超速激活延迟整流钾电流（IKur）的影响。方法：1.将24只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组和心衰模型组。心衰模型组利用腹主动脉缩窄法建立CHF大鼠模型，然后进一步被随机分为CHF对照组和BRL组。BRL组大鼠经尾静脉注射β3-AR特异性激动剂BRL-37344（4.0nmol/kg/min,10min,2次/周）共4周。2.利用超声心动图检测3组大鼠的左心房内径（LAD）、左心房射血分数（LAEF）。3.利用酶解法分离获得大鼠单个左心房肌细胞。4.利用全细胞膜片钳技术测定3组大鼠单个左心房肌细胞的IKur。结果：1.超声心动图指标：BRL组大鼠的LAD明显大于CHF对照组（P<0.05）和Sham组（P<0.01），CHF对照组大鼠的LAD明显大于Sham组（P<0.01）；BRL组大鼠的LAEF显着低于CHF对照组（P<0.05）和Sham组（P<0.01），CHF对照组的LAEF显着低于Sham组（P<0.01）。2.左心房肌细胞IKur变化：指令电压为+60mV时，叁组左心房肌细胞IKur电流密度最大。指令电压在0mV～+60mV时，CHF对照组大鼠左心房肌细胞IKur较Sham组明显减弱（P<0.05或<0.01）；指令电压在-30mV～+60mV，BRL组大鼠左心房肌细胞IKur显着低于CHF对照组（P<0.05或<0.01）。结论：β3-AR上调参与了CHF大鼠左心房结构重构和收缩功能下降，并加重了CHF大鼠左心房IKur重构。(本文来源于《暨南大学》期刊2014-05-27）
汪和贵,王森,陈艳红,邹建刚,柯永胜[6]（2014）在《β_1-AR对心衰心室肌细胞快激活延迟整流钾电流的调控机制》一文中研究指出目的探讨β1-肾上腺受体(β1-AR)激活对慢性心衰(CHF)豚鼠心室肌细胞快激活延迟整流钾电流(IKr)的影响及机制。方法制备豚鼠CHF模型,采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞IKr,观察选择性β1-AR激动剂对CHF心室肌细胞IKr的影响,并采用蛋白激酶A(PKA)及钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)抑制剂干预研究其机制。结果β1-AR激动剂扎莫特罗使CHF心室肌细胞IKr减少了(52±8)%,延长动作电位时程。β1-AR阻滞剂CGP20712A完全抑制扎莫特罗对CHF心室肌细胞IKr的减弱作用。应用PKA抑制剂KT5720预处理,扎莫特罗仅使CHF心室肌细胞IKr减少了(28±3)%。应用CaMKⅡ抑制剂KN93预处理,KN93不能减弱扎莫特罗对CHF心室肌细胞IKr的抑制作用。结论β1-AR激活抑制CHF心室肌细胞IKr;心衰时β1-AR通过PKA通路抑制心室肌细胞IKr,与CaMKⅡ通路无关。(本文来源于《中国药理学通报》期刊2014年06期）
司曼[7]（2014）在《去甲肾上腺素和血管紧张素Ⅱ对心肌慢激活延迟整流钾电流的调节作用及机制》一文中研究指出心脏疾病如心肌肥厚、心力衰竭发生时，可引发严重心律失常如心房纤颤和心室颤动，也可诱发扭转型室性心动过速（Tdp），其中一个显着特点是动作电位时程（APD）延长，这可能与心肌细胞离子通道发生病理性重构有关。去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）和血管紧张素II（angiotensin II，AngII）作为重要的体内心脏电生理和功能调节物质，在正常心肌电生理及病理状态下心肌电重构中都发挥重要作用。生理情况下，去甲肾上腺素介导交感神经兴奋时对心脏的兴奋作用，通过激动心肌细胞β1-肾上腺素能受体——腺苷酸环化酶（AC）——环磷酸腺苷（cAMP）途径，通过第二信使PKA使L型钙离子通道开放，钙离子内流增加，通过兴奋——收缩偶联增强心肌细胞收缩力。病理状态下交感神经过度兴奋，心脏中去甲肾上腺素水平显着增加，通过使多种离子通道发生重构，使其功能异常，最终导致心脏电活动和收缩功能异常。已见报道的包括房颤和心衰发生时，交感神经过度兴奋导致NE异常增多引起心肌细胞内cAMP骤增可以增大If，加快舒张期除极，细胞的自律性增高； NE激动α-肾上腺素能受体，使Ito密度减小，心肌动作电位时程延长；心肌细胞NE释放增多，可显着激活PKC，PKC会减小IK1，可能引起动作电位时程延长，自发除极发生概率增加，产生延迟后除极，以上离子通道发生重构都可能诱发心律失常。正常生理情况，交感神经兴奋释放NE，通过β1-肾上腺素能受体——PKA途径可以增大慢激活延迟整流钾电流（IKs），但在NE长期过度刺激心肌致使心衰时IKs反而减小，心脏复极储备功能大大减弱，在心电图上表现为QT间期延长，动作电位时程明显延长。总之，NE对多种离子通道都有调节作用，在生理和病理情况下对心脏的功能都有重要的影响。AngII是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的重要生物活性肽。它可以维持心血管系统动态平衡，当血压突然降低时，可以迅速增高血压。此外它与心肌梗死、心力衰竭和心肌肥厚等心脏疾病紧密联系，是这些病理生理改变的中心环节。它可以使心肌组织纤维积聚，损害心肌电传导。已有研究表明，AngII通过AT1受体延长L型钙通道的激活和失活时间；在大鼠急性分离的心肌细胞，AngII可以减小Ito电流密度，这与过表达人类基因AT1受体的转基因小鼠上所得结果相同，这些都会使心肌复极化变缓，动作电位时程延长，最终导致心律失常。可见AngII对心肌细胞多种离子通道都有调节作用，在心肌纤维化及心律失常方面具有重要作用。慢激活延迟整流钾电流（IKs）是心肌细胞复极化过程中重要的钾电流，由KCNQ1（KvLQT1）编码的构成孔区的α亚单位和KCNE1（Mink）编码的β亚单位构成。它是构成心脏复极储备功能的重要钾离子通道。先天性缺陷、药物作用和后天获得性IKs缺失都会导致QT间期延长，复极过程减慢，动作电位时程延长。在NE和AngII所致的心肌肥厚和心衰的动物模型中观察到IKs发生显着变化，但NE和AngII对IKs的调节和信号通路的比较和差异尚不清楚。本实验利用全细胞膜片钳技术，在急性分离的豚鼠心室肌细胞和心房肌细胞分别观察NE和AngII对IKs的作用，并分析、比较两者作用的细胞内信号通路的异同。第一部分NE对豚鼠心肌细胞的慢激活延迟整流钾电流（IKs）的作用目的：观察NE对豚鼠心室肌细胞和心房肌细胞IKs的作用。方法：在急性分离的豚鼠心室肌细胞和心房肌细胞，采用吸破式全细胞膜片钳技术记录IKs电流，观察NE对IKs的作用。记录IKs的细胞外液包括（in mM）：NaCl132，KCl4，MgCl21.2，CaCl21.8，glucose5，Hepes10（pH7.4with NaOH）。外液中加入Nimodipine（1M）用于阻断L-type Ca2+current。IKr用5M E-4031阻断。电极内液包括（in mM）：potassium aspartate125，KCl20，MgCl21，Mg-ATP5EGTA10，Hepes5（pH7.2with KOH）。将细胞钳制在-30mV,从-30mV以阶跃电压10mV的方式去极化至+70mV,维持2s,然后电压复极至-30mV，诱发IKs外向尾电流。以上实验在室温（20℃～25℃）条件下进行。结果：外液中加入NE（10M）后，豚鼠心室肌细胞去极化外向电流和复极时的尾电流显着增大，当去极化电压为+70mV时，尾电流由给药前的1.8±0.1pA/pF增大到2.6±0.2pA/pF（n=6）。增大作用在2-3min达到稳态，且电流可被IKs特异性抑制剂Chromanol293B（293B，30M）完全抑制。NE浓度依赖性增大IKs，以IKs尾电流增大百分比为纵坐标做出NE增大IKs的量效曲线，经Hill方程拟合得到EC50=0.66±0.09M。由尾电流制作使用NE前后IKs电流-电压关系曲线并得到给药前后V1/2分别为36.9±1.8mV和35.7±2.4mV （n=6，P>0.05），NE不影响豚鼠心室肌细胞IKs通道电压依赖性激活。NE（10M）对豚鼠心房肌细胞IKs同样有增大作用。NE增大IKs尾电流，当电压去极至+50mV时，电流密度由0.65±0.10pA/pF增大到0.95±0.10pA/pF（n=5），且电流可被IKs特异性抑制剂Chromanol293B（293B，30M）完全抑制。由尾电流制作使用NE前后IKs电流-电压关系曲线并得到给药前后V1/2分别为34.45±4.24mV和33.05±5.86mV（n=5，P>0.05），NE不影响豚鼠心房肌细胞IKs通道电压依赖性激活。结论：NE增大豚鼠心室肌细胞和心房肌细胞的IKs电流，这种增大作用不影响通道的电压门控特征。第二部分Ang II对豚鼠心肌细胞的慢激活延迟整流钾电流（IKs）的作用目的：观察AngII对豚鼠心室肌细胞和心房肌细胞IKs的作用。方法：在急性分离的豚鼠心室肌细胞和心房肌细胞，采用吸破式全细胞膜片钳技术记录IKs电流，观察AngII对IKs的作用。结果：外液中加入AngII（100nM）后，去极化外向电流和复极时的尾电流显着减小，当去极化电压为+70mV时，尾电流由给药前的1.9±0.1pA/pF减小到1.4±0.01pA/pF （n=6）。抑制作用2-3min出现，5-10min左右达到稳态，冲洗后AngII对电流的抑制作用不能完全恢复。AngII浓度依赖性抑制IKs，以IKs尾电流抑制百分比为纵坐标做出AngII减小IKs的量效曲线，经Hill方程拟合得到IC50=30.42±5.97nM。由尾电流制作使用AngII前后IKs电流-电压关系曲线并得到给药前后V1/2分别为33.3±0.8mV和31.6±1.9mV（n=6，P>0.05），AngII不影响心室肌IKs通道电压依赖性激活。AngII（100nM）同样抑制豚鼠心房肌细胞IKs电流。AngII减小IKs尾电流，当电压去极至+70mV时，电流密度由1.76±0.12pA/pF减小到1.29±0.08pA/pF（n=5），冲洗后AngII对电流的抑制作用不能完全恢复。由尾电流制作使用AngII前后IKs电流-电压关系曲线并得到给药前后V1/2分别为37.94±1.19mV和38.90±2.47mV（n=6，P>0.05），AngII不影响IKs通道电压依赖性激活。结论：AngII抑制豚鼠心室肌细胞和心房肌细胞的IKs电流，这种抑制作用不影响通道的电压门控特征。第叁部分NE及Ang II调节豚鼠心肌细胞IKs功能的机制目的：分别观察NE和AngII对豚鼠心室肌细胞IKs调节作用的细胞信号机制。方法：在急性分离的豚鼠心室肌细胞上，采用吸破式全细胞膜片钳技术记录IKs电流，观察PKA、PKC、PLC抑制剂对NE和AngII对IKs作用的影响。结果：α1肾上腺素能受体阻断剂prazosin（1M）和doxazosin（1M）可以部分阻断NE增大IKs的作用，IKs增大作用幅度由42.3±1.9%分别降低至21.9±0.6%和26.1±0.1%。PLC抑制剂U73122（1M）和edelfosine（1M）明显减弱NE增大IKs的作用，IKs增大作用幅度由40.9±2.3%分别降低至21.0±0.4%和12.7±1.2%。PKC抑制剂Bis-1（100nM）也明显减弱NE增大IKs的作用，IKs增大作用幅度由40.9±2.3%降低至22.6±0.6%。低浓度α1肾上腺素能受体特异性激动剂phenylephrine（PE）（10M）对豚鼠心室肌细胞IKs没有明显的增大作用。高浓度α1肾上腺素能受体特异性激动剂phenylephrine（PE）（60M）增大IKs百分比为24.4±0.8%。在β肾上腺素能受体阻断剂propranolol（1M）存在情况下，PE不再增大IKs，反而抑制IKs。β肾上腺素能受体阻断剂propranolol（1M）几乎完全阻断NE增大IKs的作用，IKs增大作用幅度由40.9±2.3%降低至5.78±0.2%。PKA阻断剂H89（30M）也几乎完全阻断NE增大IKs的作用，IKs增大作用幅度由40.9±2.3%降低至5.4±1.1%。AT1受体阻断剂Losartan（1μM）几乎完全消除AngII对IKs电流的抑制作用。PLC抑制剂U73122（1M）和edelfosine（1M）明显减弱AngII抑制IKs的作用，IKs减小作用幅度由29.8±0.9%分别降低至15.2±2.7%和12.9±0.3%。PKC抑制剂Bis-1（100nM）也明显减弱AngII抑制IKs的作用，AngII抑制IKs的作用由29.8±0.9%降低至8.9±1.0%。结论：NE激动心肌α1和β肾上腺素能受体增加IKs电流，分别通过α1受体-PLC-PKC和β受体-PKA途径完成，而且β受体-PKA途径交联影响α1受体-PKC途径，共同完成NE对IKs的调节。AngII激动AT1受体对IKs产生抑制作用，这种抑制作用是通过AT1-PLC-PKC途径介导的。(本文来源于《河北医科大学》期刊2014-04-01）
吴婷婷[8]（2014）在《α_1和β_1肾上腺素受体急性激活对豚鼠心室肌细胞快激活延迟整流钾电流的交叉影响》一文中研究指出背景心肌细胞膜上分布着各种离子通道,其中包括快激活延迟整流钾通道(由hERG基因参与编码形成),它介导快激活延迟整流钾电流(IKr电流)。IKr电流的电流特性相对复杂,具有去极化过程中激活缓慢、失活快速,复极化过程中复活快速、去激活缓慢的特点,使得IKr电流在形成心肌细胞动作电位(AP)复极化过程中扮演着极其重要的角色。当hERG基因发生突变或者hERG蛋白通道受到某些药物的抑制,即先天性2型长QT综合征(LQTS-2)和获得性长QT综合征,将会出现IKr电流受抑减小,心脏复极化延迟,动作电位时程(APD)延长,表现在体表心电图上为QT间期延长,极易诱发尖端扭转型室性心动过速(TdP),甚至心源性猝死(SCD)。运动或者情绪激动会引起交感神经的兴奋,并激活体内α-肾上腺素能受体(a-AR)和p-肾上腺素能受体(β-AR),包括心肌细胞膜表面的a-AR和p-AR。近年来诸多研究证明：心肌细胞膜上的al-肾上腺素能受体(al-AR)和p1-肾上腺素能受体(β1-AR)在激活以后,可以影响hERG/IKr电流的大小。也有学者提出al-AR和β1-AR激活后对hERG/IKr电流的调控或许存在交叉作用,这对机体应当是一种保护性调节机制,然而直到目前为止并无十分直接的证据和具体的报道。因此,本实验旨在研究当a1-AR和p1-AR分别或者同时急性激活后,hERG通道及其介导的IKr电流将如何变化及其变化程度如何,并且其中一种肾上腺素能受体在激活后对另一种肾上腺素能受体会产生何种作用以及程度如何,为机体肾上腺素能受体急性激活后对于hERG/IKr电流产生复杂而精细的网络状调控机制提供一些新证据,并为临床上防治由应激引起恶性心律失常事件提供一些新的诊疗思路和线索。第一部分成年豚鼠心室肌细胞的获取以及IKr-电流的描记目的建立稳定有效的分离豚鼠心室肌细胞的方法以及IKr电流的描记方法。方法利用改良后Landendorff装置,采用逆行主动脉灌流和酶降解的方法,得到游离的具有活性的单个豚鼠心室肌细胞。在全细胞膜片钳装置中针对单个豚鼠心室肌细胞,利用电压钳技术,测量IKr电流。结果胶原酶消化的方法可以有效分离出单个有活性的心室肌细胞,绝大部分(约70～80%)边缘锐利、横纹清晰、立体感强,能够经受膜片钳试验长达40分钟,且可重复性较好。在膜片钳装置中,电压钳状态下,通过一定的刺激程序引出并记录豚鼠心室肌细胞的IKr电流。结论本试验中含胶原酶的配方可以简单、可靠、有效地分离出单个豚鼠心室肌细胞,本试验中的刺激程序可以稳定记录到豚鼠心室肌细胞的IKr电流。第二部分al-AR和β1-AR分别急性激活以及同时激活对豚鼠心室肌细胞IKr电流和通道蛋白的影响目的分别急性激活a1-AR和p1-AR,以及同时激活两种受体,从而观察豚鼠心室肌细胞IKr电流大小的变化,并观察叁种情况下介导IKr电流的hERG通道蛋白表达量的变化。方法应用逆行灌流心脏及酶解的方法得到单个豚鼠左心室肌细胞的混悬液,将其随机分为叁组,分别予以a1-AR激动剂(苯肾上腺素,PE)、p1-AR激动剂(扎莫特罗、Xamo),和同时予以两种激动剂,利用全细胞膜片钳技术,于一定时间内观察IKr电流的大小变化,并比较叁种情况下IKr电流变化的程度。利用蛋白免疫印迹技术,比较叁组情况下,细胞内介导IKr电流的hERG通道蛋白的表达量在处理前后的差别。结果苯肾上腺素(PE)和扎莫特罗(Xamo)均浓度依赖性抑制IKr,其半抑制浓度(IC50)分别为0.93μmol/L和6.40 μmol/L。其中,1 μmol/L PE和10 μmol/LXamo分别使IKr下降为用药前的0.79+0.02和0.72+0.01,并使电压依赖性激活曲线不同程度左移,半激活电压(V0.5)分别从-2.99 mV±1.44 mV变为-9.10mV±1.74 mV,-4.54 mV±1.48 mV变为-7.24 mV±1.93 mV,而斜率(k)变化很小。但当同时给予1 μmol/L PE和10 μmol/L Xamo,仅使IKr下降为用药前的0.71±0.01,电压依赖性激活曲线左移,V0.5从-2.71 mV+1.95 mV变为-8.45mV±1.97 mV,k变化很小。分别单独激活α1-AR和p1-AR,以及同时激动al-AR和p1-AR,各组使IKr减小(20.73±2.46)%,(27.99±0.68)%,和(30.56±±1.80)%,叁组间差异具有统计学意义(P=0.0062)。然而,急性激活不同肾上腺素受体(仅激活α1-AR、仅激活p1-AR、同时激活α1-AR和β1-AR)后,介导IKr电流的hERG通道蛋白的表达量却未发生明显改变,其差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论分别急性激活a1-AR和p1-AR,将对豚鼠左心室心肌细胞IKr产生不同程度的抑制作用,而当同时激活a1-AR和β1-AR,却并未产生更为剧烈的抑制作用。与此同时,介导IKr电流的hERG通道蛋白在翻译和转录水平并未发生明显变化,提示al-AR和p1-AR急性激活后抑制IKr的调节作用发生在IKr通道蛋白修饰水平,且这种调节机制存在一定程度的交叉重迭,这种交叉重迭作用对于机体面临应激状态是一种保护机制。第叁部分α1-AR和β1-AR急性激活对豚鼠心室肌细胞IKr交叉影响的机制初步探索目的分别急性激活a1-AR和β1-AR,后续再急性激活另一种受体,从而观察豚鼠心室肌细胞IKr电流大小的变化,重点观察一种受体已经激活时对于另一种受体调节IKr电流存在何种交叉影响,并初步探索两条信号调节通路在何种水平上发生了交叉作用。方法应用逆行灌流心脏及酶解的方法得到单个豚鼠左心室肌细胞的混悬液,将其随机分为两组：Ppre+X组和Xpre+P组,分别予以a1-AR激动剂(苯肾上腺素,PE)和p1-AR激动剂(扎莫特罗、Xamo),利用全细胞膜片钳技术,于一定时间内观察IKr电流的大小变化；当两组细胞IKr电流达到稳定水平后,分别再续以p1-AR激动剂(Xamo)口a1-AR激动剂(PE),继续观察一定时间内亿电流的大小变化。比较两组细胞中一种受体激活后对IKr电流的调节能力,并且重点比较在一种受体提前激活的情况下,续以激活另一种受体对,Kr电流大小的调节能力有无改变。结果在两组细胞中,1μmol/L苯肾上腺素(PE)使,Kr电流下降了(21.67±3.19)%(即1μmol/L PE使IKr电流下降为处理前的0.79±0.03),而10 μmol/L扎莫特罗(Xamo)使IKr电流下降了(27.57±0.64)%(即10μmol/L Xamo使IKr电流下降为处理前的0.72±0.01),两组均出现电压依赖性激活曲线不同程度的左移,其中半激活电压(V05)分别改变了(-6.35±1.53)mV和(-1.95±2.22)mV,而斜率(k)变化都很小。但当两组细胞在上述处理的基础上,继续予以10 gmol/LXamo或者1μmol/L PE之后,两组均只表现出IKr电流的小幅度下降：10μmol/L Xamo仅使IKr电流下降了(12.85±1.05)%,而1μmol/L PE仅使IKr电流下降了(14.44±2.94)%；而两组细胞的电压依赖性激活曲线也仅出现小幅度的移动,其半激活电压(V0.5)和斜率(k)均变化不明显。单独激活a1-AR和单独激活β1-AR均可使IKr电流减小((21.67±3.19)%&(27.57±0.64)%),两者之间差异不具有统计学意义(P>0.05)；然而p1-AR的预激活抑制了α1-AR激活引起的IKr电流减小程度,与单独激活α1-AR介导IKr电流减小程度之间的差异具有显着的统计学意义(P<0.05)；与此同时,α1-AR的预激活亦抑制了p1-AR激活引起的IKr电流减小程度,与单独激活p1-AR介导IKr电流减小程度之间的差异亦具有显着统计学意义(P<0.001)。结论分别急性激活α1-AR和β1-AR均可对hERG通道的活性产生明显的抑制,从而使其介导的IKr电流减小。然而,在预先激活其中一种肾肾上腺素能受体时,另一种肾上腺素能受体的激活对于IKr电流的调节作用却明显减弱。简言之,当一种肾肾上腺素能受体业已激活的情况下,另一种肾上腺素能受体的激活,其结果并非是加强了对IKr电流的抑制作用,反而是削弱了其对IKr电流的抑制作用。这从另一个层面和角度再次证明：肾上腺素能受体对IKr电流的调节过程是相互制约和影响的,具有交互作用的特点；而这种调节机制对于机体面临循环中超负荷量的儿茶酚胺类物质(如应激、剧烈运动、情绪过度激动)时,是一种调节性反馈保护机制。因而需要进行更多更深入的研究,从而揭示交叉作用更深层次的分子机制,并鉴定出介导交叉作用的中间蛋白分子,为临床防治特定的恶性心律失常疾病提供新的思路。(本文来源于《南京医科大学》期刊2014-04-01）
王森,吴婷婷,郭妍,许迪[9]（2014）在《α_1肾上腺素受体在调控快激活延迟整流钾电流中的作用》一文中研究指出目的探讨α1肾上腺素受体在调控快激活延迟整流钾电流(Ikr)中的作用。方法制备豚鼠心肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录心肌细胞Ikr。心肌细胞采用α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素0.1μmol/L处理后分为五组:A组作为对照;B1、B2、B3和B4组分别以α1肾上腺素受体阻滞剂哌唑嗪1μmol/L、α1肾上腺素受体α1A亚型阻滞剂5-甲基乌拉地尔1μmol/L、α1肾上腺素受体α1B亚型阻滞剂氯乙基可乐定10μmol/L和α1肾上腺素受体α1D亚型阻滞剂BMY-7378 1nmol/L干预,比较干预前后心肌细胞Ikr的变化。结果 B1组和B2组心肌细胞Ikr降为干预前的0.92±0.07和0.97±0.04,高于A组的0.67±0.03(P<0.01),而B3和B4组心肌细胞Ikr降为干预前的0.64±0.06和0.73±0.07,与A组相仿(P>0.05)。结论α1肾上腺素受体激活可降低心肌细胞Ikr;该作用主要通过α1肾上腺素受体和α1A亚型介导。(本文来源于《江苏医药》期刊2014年03期）
曾芳,赵强,王淑香,李彪,吴同果[10]（2013）在《β_3肾上腺素能受体激动对心力衰竭大鼠心房肌细胞超速激活延迟整流钾电流的影响》一文中研究指出目的探讨选择性β3肾上腺素能受体(β3-AR)激动剂BRL-37344对慢性心力衰竭(CHF)大鼠左心房心肌细胞超速激活延迟整流钾电流(IKur)的影响。方法 24只雄性Wistar大鼠分为假手术组(Sham组,n=6)和CHF组(n=18),采用主动脉缩窄法建立CHF大鼠模型。CHF组大鼠再分为CHF对照组和BRL组(经尾静脉注射BRL-37344 0.4 nmol/kg,每周2次,共4周)。酶解法分离得到大鼠左心房肌细胞。采用全细胞膜片钳技术测定左心房肌细胞Ikur(以电流密度pA/pF表示)。结果当指令电压为+60 mV时,叁组心房肌细胞Ikur电流密度最大,分别为(12.07±2.35)pA/pF、(8.15±1.14)pA/pF、(4.81±1.25)pA/pF。当指令电压在0~+60 mV时,CHF对照组大鼠心房肌细胞IKur较Sham组明显减弱(P<0.05或<0.01);指令电压在-30~+60 mV,BRL组大鼠心房肌细胞IKur显着低于CHF对照组(P<0.05或<0.01)。结论 BRL-37344激动β3-AR显着抑制了CHF大鼠心房肌细胞IKur。(本文来源于《中华临床医师杂志(电子版)》期刊2013年24期）
快激活延迟整流钾电流论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
延迟整流钾电流(I_K)包括快激活I_Kr和慢激活I_Ks两种成分,其中KCNQ1和KCNE1分别编码I_Ks通道的孔区α亚单位和辅助β亚单位。I_Ks是大动物2、3相复极的重要电流。已有报道,KCNQ1及KCNE1基因突变引起I_Ks减小或者增大,致动作电位复极延迟或加速,心电图上分别表现为长QT综合征(long QT syndrome,LQT1或者LQT5)和短QT综合症(short QT syndrome,SQT2)。在高血压、冠心病和心肌缺血等引发的心肌肥厚和心衰以及糖尿病等病理状态下,均伴有I_Ks减小,而这是造成获得性LQT综合征的重要原因。LQT和SQT均以高发室性心律失常为特征。因此,研究KCNQ1/KCNE1通道的功能调节具有重要意义。据报道,磷酸化是通过调节通道功能从而影响心肌电生理功能的有效方式之一,其中PKC磷酸化对离子通道的调控备受关注。早期实验结果显示,PKC对克隆的小鼠、大鼠心脏的I_Ks表现明显的抑制作用,而对豚鼠心脏的I_Ks表现为增大作用,对此种属依赖性产生的原因解释为,PKC使KCNE1的Ser102位点磷酸化而抑制电流,而豚鼠缺乏此位点,故表现为增大电流。最新研究表明,PKC磷酸化KCNE1-S102后,通过加快膜蛋白内吞而下调通道功能。然而,激活PKC可增大表达人源的KCNQ1/KCNE1通道电流(KCNE1上存在S102),故KCNQ1上存在可上调通道功能的磷酸化位点。我实验研究结果发现,在豚鼠心室肌细胞(KCNE1上缺乏S102),通过激活PKC通路抑制I_Ks。综上,激活PKC对I_Ks的调控作用表现为增大电流和抑制电流两种结果。由于不同PKC亚型对通道功能可能具有相反的作用,因此我们推测PKC对I_Ks不一致的调控结果可能由不同的PKC亚型所致。有报道PKCβⅡ、ε亚型选择性增大I_Ks,而α、β1、δ亚型对电流没有明显影响;PKCε亚型中介PMA和肾上腺素α受体增大豚鼠心房I_Ks的作用。综上,PKC可显着地调控I_Ks功能,但迄今对于不同PKC亚型特异性调控I_Ks的认识非常有限。为此,本研究主要采用膜片钳电生理技术拟解决以下问题(1)激活不同PKC亚型对I_Ks的调节作用。(2)确定介导抑制、增大I_Ks两种相反作用的PKC亚型。(3)PKC亚型特异性调控I_Ks的分子机制。第一部分不同PKC亚型对I_Ks的调节作用目的:激活不同PKC亚型对I_Ks的影响。方法:构建稳定表达KCNQ1和KCNE1的HEK293细胞线,观察PMA、cPKC激动肽和PKCε激动肽对通道电流的影响。为避免电流的衰减,实验采用穿孔膜片全细胞模式记录I_Ks。结果:在稳定转染I_Ks的HEK293细胞,外液中加入PMA(100 nM)后,去极化外向电流及复极化的尾电流明显增加。在+50mV电压下,尾电流密度由37.20±6.98 pA/pF 增加到 45.39±7.01 pA/pF(P<0.05)。PMA对I_Ks的增大作用5min出现,10-15 min左右达到稳态,冲洗后不能完全恢复。由激活曲线得出给药前V_1/2和斜率因子分别为20.04±1.31 mV和15.69±0.76,应用PMA后的V_1/2和斜率因子分别为14.48±2.21 mV和16.99±1.94,PMA使I_Ks激活曲线发生左移。在电压+10 mV～+50 mV范围内,PMA可明显降低通道的激活时间常数,在+50 mV电压下,激活时间常数由926.14±128.01 ms减小到756.57±115.23 ms(P<0.05)。在电极内液中加入cPKC激动肽和PKCε激动肽及其各自乱码对照肽(所有肽都连接穿孔肽),结果如下:与cPKC对照肽相比,cPKC激动肽使I_Ks电流密度增加,当电压去极至+50 mV时,尾电流密度由26.26±4.46 pA/pF(cPKC 对照肽)增加到 37.13±4.72 pA/pF(cPKC激动肽)(P<0.05)。应用cPKC对照肽激活曲线的V_1/2和斜率因子分别为18.03±2.2 mV和17.8±1.5,而应用cPKC激动肽激活曲线的V1/2和斜率因子分别为8.9±2.7mV和15.6±0.9,曲线明显发生左移。在电压+10 mV～+50 mV范围内,cPKC激动肽可明显减小通道的激活时间常数,在+50 mV,激活时间常数由1142.09±168.85 ms降低到608.71±99.38 ms(P<0.05)。与PKCε对照肽相比,PKCε激动肽使I_Ks电流密度下降,当电压去极至+50 mV时,尾电流密度由40.81±6.78 pA/pF(PKCε 对照肽)下降到 16.68±2.26 pA/pF(PKCε 激动肽)(P<0.01),而激活曲线V1/2和斜率因子没有发生改变,激活时间常数也没有发生改变。小结:PMA和cPKC激动肽增大I_Ks,使通道激活曲线发生左移,降低激活时间常数;PKCε激动肽抑制I_Ks,但不影响激活曲线和激活时间常数。第二部分确定中介I_Ks不同调节的PKC亚型目的:前期报道血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)通过PKC信号通路抑制豚鼠心室肌I_Ks,第一部分实验发现PMA增大I_Ks,为此本部分实验确定中介抑制、增大I_Ks两种相反作用的PKC亚型。方法:在稳定转染I_KsHEK293细胞上,瞬时转染人的Ang Ⅱ受体AT1cDNA,观察AngⅡ对I_Ks的影响。进一步采用siRNA技术分别敲低PKCα PKCβ和PKCε亚型,观察AngⅡ和PMA对以上细胞的调节作用,从而确定中介抑制、增大I_Ks两种相反作用的PKC亚型。结果:首先在表达系统进一步确定Ang Ⅱ对I_Ks的影响。在稳定转染I_Ks的HEK293细胞上,共转染人AT1 cDNA,外液中加入Ang Ⅱ(100 nM)后2-3 min去极化外向电流及复极化的尾电流均明显减小,10-15 min左右达到稳态,在+50 mV,尾电流密度由55.40±11.03 pA/pF减小到42.29±8.89pA/pF(P<0.05),抑制作用冲洗后不能完全恢复。其中约400%细胞在给药后1 min出现一过性微弱增大(约7%)。在0.1-1000 nM范围内,Ang Ⅱ以浓度依赖性方式抑制I_Ks,以I_Ks尾电流抑制率为纵坐标做Ang Ⅱ抑制I_Ks的量效曲线,经Hill方程拟合后得到IC50=7.5 nM。Ang Ⅱ对I_Ks的半数激活电压及激活时间常数都没有影响。转染siRNA特异性敲低PKC亚型的表达,观察Ang Ⅱ(K100 nM)和PMA(100 nM)对抑制、增大I_Ks的影响。结果发现,转染PKCα+PKCβ siRNA后,Ang Ⅱ对I_Ks的抑制作用与转染对照siRNA无明显差别;而转染PKCε siRNA特异性敲低PKCε表达后,Ang Ⅱ对尾电流的抑制(+50 mV下)显着弱于对照(10.95%vs 26.06%,P<0.05),表明Ang Ⅱ对电流的抑制由PKCε中介。转染(乱码)对照PKC siRNA后,PMA使I_Ks(+50 mV下)增加31.84%,分别敲低PKCα、PKCβ的表达,PMA对尾电流的增加幅度较对照显着减弱,分别为16.82%(P<0.05)、10.58%(P<0.01);共同敲低 PKCα 和 PKCβ后,电流增强作用几乎消失;敲低PKCε的表达不影响PMA的作用(28.87%vs 31.84%,P>0.05)。表明PMA对电流的增强作用由cPKC的PKCα和PKCβ中介。小结:以上的实验表明,AngⅡ对克隆人的I_Ks呈现抑制作用,此抑制作用由PKCε中介,而PMA对I_Ks的增强作用由PKCα和PKCβ中介。第三部分PKC亚型特异性调控I_Ks的分子机制目的:分析不同PKC亚型对I_Ks调节的分子机制。方法:分别突变KCNQ1、KCNE1上PKC的潜在磷酸化位点,观察Ang Ⅱ和PMA抑制、增强电流作用的改变,分析不同PKC亚型对通道调控的分子机制。结果:KCNQ1上N端有2个、C端有4个评分较高的PKC潜在磷酸化位点,分别是S95、T96和S409、S464、T513、S577,而KCNE1上只有一个潜在PKC磷酸化位点,即S102。将上述KCNQ1上6个和KCNE1上的1个潜在磷酸化位点分别突变为丙氨酸,另外同时将KCNQ1 上N端2个或C端4个潜在磷酸化位点突变,分别为 KCNQ1-2M(含 N 端 S95A 和 T96A)和 KCNQ1-4M(含 C 端 S409A、S464A、T513A、S577A)。经检测,上述所有突变通道的动力学特征与野生型一致。我们发现,Ang Ⅱ(100 nM)对 KCNQ1/KCNE1-S102A突变通道尾电流的抑制程度明显小于对野生型通道的抑制(10.84%,vs 30.59%,P<0.05),以上结果提示KCNE1上的S102是PKC抑制通道功能的磷酸化位点。同时我们注意到,KCNE1上S102突变后AngⅡ对通道的抑制作用并没有完全消失,推测除S102外,KCNQ1上也存在抑制通道功能的磷酸化位点。进一步的实验表明,Ang Ⅱ对KCNQ1N端突变通道(KCNQ1-2M)尾电流的抑制程度为11.71%,显着弱于对野生型通道的作用(30.59%,P<0.01),而KCNQ1的C端突变(KCNQ1-4M)和并不影响Ang Ⅱ的抑制作用(30.62%,P>0.05)。以上结果说明,KCNQ1的N端参与PKC对通道功能的抑制。分别突变N端的S95和T96均可减弱Ang Ⅱ对通道的抑制作用,对S95A和T96A通道的抑制分别为15%(P<0.01)和16.33%(P<0.01),说明S95和T96都参与PKC抑制通道功能。联合突变KCNQ1的N端与 KCNE1 的 S102 后,Ang Ⅱ 对通道(KCNQ1-2M/KCNE1-S102A)的抑制作用几乎消失(2.76%,P<0.01)。以上结果说明PKC在I_Ks上有叁个抑制位点,分别是KCNQ1上的S95、T96和KCNE1上的S102。KCNE1上S102突变并不影响PMA增大I_Ks的作用,我们推断KCNQ1亚基有增强通道功能的位点。PMA对KCNQ1-2M/KCNE1和KCNQ1-4M/KCNE1通道的电流增加分别为31.74%和3.18%,N端突变与野生型通道作用无明显区别(P>0.05),而C端突变几乎取消了其增强作用。结果说明KCNQ1亚基C端参与PKC对通道作用的增强性调控。进一步分别突变C端四个位点,结果显示,PMA对S409A、S464A、T513A、S577A突变通道电流分别增加12.98%、8.56%、6.37%以及11.71%,均较野生型显着降低。结果说明KCNQ1亚基C端的S409、S464、T513以及S577是PKC增强通道功能的磷酸化位点。我们进一步在HEK293细胞上表达克隆的豚鼠KCNQ1/KCNE1通道,将KCNQ1上N端唯一的潜在磷酸化位点S96突变为丙氨酸后,Ang Ⅱ对突变通道的抑制作用几乎消失,进一步表明KCNQ1上N端磷酸化抑制通道功能。小结:KCNQ1亚基存在PKC抑制、增强通道功能的位点,N端磷酸化抑制通道功能,而C端磷酸化增强通道功能;KCNE1上的S102磷酸化则抑制通道功能。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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