本文主要研究内容
作者梁学超（2019）在《突变型pVenus-cdc25b表达载体的构建及其功能初探》一文中研究指出：Cdc25b(cell division cycle 25b),细胞分裂周期25b磷酸酶,cdc25磷酸酶家族成员之一,是一种Thr/Tyr双特异性蛋白磷酸酶,在哺乳动物细胞周期调控过程中起到逆转抑制磷酸化的作用。在生殖细胞的减数分裂恢复过程中,cdc25b可以使细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase)CDK1上14/Thr和15/Tyr上发生去磷酸化,从而导致CDK1活性恢复与周期蛋白CyclinB结合发挥功能,启动细胞分裂的进行。Cdc25b蛋白磷酸酶上有两种特异性的短序列,分别是核定位和核输出信号,在细胞质和细胞核的动态穿梭过程中发挥功能,该蛋白磷酸酶在细胞减数分裂启动之前由细胞质进入细胞核,细胞减数分裂恢复由细胞核输出进入细胞质。同时,cdc25b蛋白磷酸酶活性受到磷酸化或去磷酸化作用的调节,在cdc25b上也存在有相应的磷酸化修饰位点149位Ser和321位Ser,蛋白激酶PKA(protein kinase A)通过磷酸化或去磷酸化作用对cdc25b上的这两个位点进行修饰从而调控该酶活性,维持或解除细胞减数分裂的阻滞,进一步来调节细胞周期的进程。本研究采用分子生物方法提取雌性小鼠卵巢组织RNA反转录为cDNA,进行小鼠cdc25b基因的扩增和pVenus-cdc25b真核表达载体的构建;结合蛋白组学技术对cdc25b上PKA结合的特异性磷酸化位点进行分析,实现基因定点修饰以及构建突变型载体过表达cdc25b基因;将野生型pVenus-cdc25b-WT和突变型pVenus-cdc25b-Mut真核表达载体转染体外培养的293T细胞和Hela细胞,对其功能进行了初步验证。结果如下:1.运用特异性扩增引物扩增出小鼠cdc25b基因,完成了pVenus-cdc25-WT真核表达载体构建,对pVenus-cdc25-WT野生型质粒经Hind III和BamH I双酶切和测序分析鉴定,表明成功扩增出小鼠cdc25b基因。2.对cdc25b蛋白磷酸酶上第30位、149位、321位、351位丝氨酸位点突变,完成pVenus-cdc25b-S351A,pVenus-cdc25b-S321A,pVenus-cdc25b-S149A,pVenus-cdc25bS321A-S149A,pVenus-cdc25b-S30A突变载体的构建,经Hind III和BamH I双酶切检测和测序分析,结果显示:cdc25b上第30位、149位、321位、351位已由原来的丝氨酸Ser突变为丙氨酸Ala,成功实现对cdc25b磷酸酶特异性位点的突变。3.利用重组质粒pVenus-cdc25b-WT和pVenus-cdc25b-Mut分别对培养的293T细胞和Hela细胞进行转染,结果显示:pVenus空载和pVenus-cdc25b-WT转染之后,cdc25b磷酸酶主要在两种细胞的胞质中定位表达,只有少量在胞核定位表达;而pVenus-Cdc25b-Mut转染之后,cdc25b磷酸酶均只在两种细胞的胞核中定位表达,而胞质中未见定位表达。结论:本试验成功突变了小鼠cdc25b基因特异性磷酸化位点,构建了pVenus-cdc25b各型突变载体。对突变载体转染体外培养的293T细胞和Hela细胞结果表明,cdc25b磷酸酶在细胞的分裂过程中是一个质核穿梭的动态过程,当cdc25b磷酸酶上特异性磷酸化位点发生突变之后,核定位和核输出序列功能改变出现明显的胞核滞留现象。
Abstract
Cdc25b(cell division cycle 25b),xi bao fen lie zhou ji 25blin suan mei ,cdc25lin suan mei jia zu cheng yuan zhi yi ,shi yi chong Thr/Tyrshuang te yi xing dan bai lin suan mei ,zai bu ru dong wu xi bao zhou ji diao kong guo cheng zhong qi dao ni zhuai yi zhi lin suan hua de zuo yong 。zai sheng shi xi bao de jian shu fen lie hui fu guo cheng zhong ,cdc25bke yi shi xi bao zhou ji dan bai yi lai xing ji mei (cyclin dependent kinase)CDK1shang 14/Thrhe 15/Tyrshang fa sheng qu lin suan hua ,cong er dao zhi CDK1huo xing hui fu yu zhou ji dan bai CyclinBjie ge fa hui gong neng ,qi dong xi bao fen lie de jin hang 。Cdc25bdan bai lin suan mei shang you liang chong te yi xing de duan xu lie ,fen bie shi he ding wei he he shu chu xin hao ,zai xi bao zhi he xi bao he de dong tai chuan suo guo cheng zhong fa hui gong neng ,gai dan bai lin suan mei zai xi bao jian shu fen lie qi dong zhi qian you xi bao zhi jin ru xi bao he ,xi bao jian shu fen lie hui fu you xi bao he shu chu jin ru xi bao zhi 。tong shi ,cdc25bdan bai lin suan mei huo xing shou dao lin suan hua huo qu lin suan hua zuo yong de diao jie ,zai cdc25bshang ye cun zai you xiang ying de lin suan hua xiu shi wei dian 149wei Serhe 321wei Ser,dan bai ji mei PKA(protein kinase A)tong guo lin suan hua huo qu lin suan hua zuo yong dui cdc25bshang de zhe liang ge wei dian jin hang xiu shi cong er diao kong gai mei huo xing ,wei chi huo jie chu xi bao jian shu fen lie de zu zhi ,jin yi bu lai diao jie xi bao zhou ji de jin cheng 。ben yan jiu cai yong fen zi sheng wu fang fa di qu ci xing xiao shu luan chao zu zhi RNAfan zhuai lu wei cDNA,jin hang xiao shu cdc25bji yin de kuo zeng he pVenus-cdc25bzhen he biao da zai ti de gou jian ;jie ge dan bai zu xue ji shu dui cdc25bshang PKAjie ge de te yi xing lin suan hua wei dian jin hang fen xi ,shi xian ji yin ding dian xiu shi yi ji gou jian tu bian xing zai ti guo biao da cdc25bji yin ;jiang ye sheng xing pVenus-cdc25b-WThe tu bian xing pVenus-cdc25b-Mutzhen he biao da zai ti zhuai ran ti wai pei yang de 293Txi bao he Helaxi bao ,dui ji gong neng jin hang le chu bu yan zheng 。jie guo ru xia :1.yun yong te yi xing kuo zeng yin wu kuo zeng chu xiao shu cdc25bji yin ,wan cheng le pVenus-cdc25-WTzhen he biao da zai ti gou jian ,dui pVenus-cdc25-WTye sheng xing zhi li jing Hind IIIhe BamH Ishuang mei qie he ce xu fen xi jian ding ,biao ming cheng gong kuo zeng chu xiao shu cdc25bji yin 。2.dui cdc25bdan bai lin suan mei shang di 30wei 、149wei 、321wei 、351wei si an suan wei dian tu bian ,wan cheng pVenus-cdc25b-S351A,pVenus-cdc25b-S321A,pVenus-cdc25b-S149A,pVenus-cdc25bS321A-S149A,pVenus-cdc25b-S30Atu bian zai ti de gou jian ,jing Hind IIIhe BamH Ishuang mei qie jian ce he ce xu fen xi ,jie guo xian shi :cdc25bshang di 30wei 、149wei 、321wei 、351wei yi you yuan lai de si an suan Sertu bian wei bing an suan Ala,cheng gong shi xian dui cdc25blin suan mei te yi xing wei dian de tu bian 。3.li yong chong zu zhi li pVenus-cdc25b-WThe pVenus-cdc25b-Mutfen bie dui pei yang de 293Txi bao he Helaxi bao jin hang zhuai ran ,jie guo xian shi :pVenuskong zai he pVenus-cdc25b-WTzhuai ran zhi hou ,cdc25blin suan mei zhu yao zai liang chong xi bao de bao zhi zhong ding wei biao da ,zhi you shao liang zai bao he ding wei biao da ;er pVenus-Cdc25b-Mutzhuai ran zhi hou ,cdc25blin suan mei jun zhi zai liang chong xi bao de bao he zhong ding wei biao da ,er bao zhi zhong wei jian ding wei biao da 。jie lun :ben shi yan cheng gong tu bian le xiao shu cdc25bji yin te yi xing lin suan hua wei dian ,gou jian le pVenus-cdc25bge xing tu bian zai ti 。dui tu bian zai ti zhuai ran ti wai pei yang de 293Txi bao he Helaxi bao jie guo biao ming ,cdc25blin suan mei zai xi bao de fen lie guo cheng zhong shi yi ge zhi he chuan suo de dong tai guo cheng ,dang cdc25blin suan mei shang te yi xing lin suan hua wei dian fa sheng tu bian zhi hou ,he ding wei he he shu chu xu lie gong neng gai bian chu xian ming xian de bao he zhi liu xian xiang 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西北农林科技大学的梁学超，发表于刊物西北农林科技大学2019-07-11论文，是一篇关于真核表达载体论文,磷酸化论文,位点突变论文,西北农林科技大学2019-07-11论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西北农林科技大学2019-07-11论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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