本文主要研究内容
作者张甜（2019）在《新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶挖掘及其生物转化应用》一文中研究指出：α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase,E.C.3.2.1.40）是一类糖苷水解酶,可通过专一性水解黄酮类化合物末端的α-L-鼠李糖基从而提高其生物利用率及生物学活性。α-L-鼠李糖苷酶作为一类生物催化剂,有广泛的应用前景。目前已表征的细菌源GH78家族α-L-鼠李糖苷酶仅有19个,有关其在生物催化应用方面的报道主要集中在真菌,因此,新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶资源的挖掘及其对天然黄酮糖苷的生物转化研究具有重要意义。本研究首先利用基因组信息挖掘新酶发现策略,从解肝磷脂土地杆菌基因组中得到三个α-L-鼠李糖苷酶基因PhRha78D、PhRha78E和PhRha78G,通过传统的双酶切连接法构建于表达载体pET-28a,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行异源表达,SDS-PAGE及酶活检测结果表明,PhRha78D、PhRha78E、PhRha78G大部分以催化活性包涵体形式异源表达。PhRha78D酶活力较低,仅对PhRha78E和PhRha78G进行了酶学特性研究,二者的最适pH分别为6.5和7.0,但最适反应温度却相差很大,分别为60oC和40oC;动力学常数KM分别为0.55和0.4 mM,kcat分别为0.18 s-1和0.12 s-1;PhRha78E的T50为51℃,在40-50℃孵育30 min后还有59%以上的活性,而PhRha78G的T50为36℃,20-36℃热失活30 min仍有50%以上的残余活力;有机溶剂耐受性显示,二者均可耐受1%低浓度的有机溶剂。第一种策略获得新酶的催化活性不可预测,可溶性表达不可控。基于此引入第二种策略—宏基因组高通量测序结合催化关键基序虚拟筛选的新酶发现策略,利用该策略从人粪便宏基因组中获得三个目标候选酶基因HFM-RhaA、HFM-RhaB和HFM-RhaC,密码子优化与全基因合成后,利用新颖的无缝克隆技术构建重组质粒。在大肠杆菌中异源表达后,SDS-PAGE表明,三者大部分以可溶性形式表达于上清中,利用镍柱亲和纯化后进行了酶学性质表征,三个酶的最适pH分别为6.0、6.0、5.7,最适温度分别为40 oC、60oC、40oC;HFM-RhaA和HFM-RhaC的KM均很小,分别为1.59 mM和0.053 mM,最大反应速率分别为57.6μmol min-1mg-1和37.6μmol min-1mg-1,kcat分别为92.8 s-1和62.9 s-1;HFM-RhaA和HFM-RhaC的T50分别为35℃和28℃;HFM-RhaA对5%甚至10%的醇类有机溶剂有很好的耐受性,而HFM-RhaC仅对5%的醇类有机溶剂有较好的耐受性。对酶学性质有一定的了解后,进一步探究了HFM-Rha对芦丁和柚皮苷的生物转化情况。HFM-RhaA可以高效水解芦丁和柚皮苷,但水解柚皮苷的效率更高效,30μg/mL的HFM-RhaA催化水解柚皮苷时,88.6%的底物转化为樱桃苷,而120μg/mL的HFM-RhaA水解芦丁时,转化率达80.8%。200μg/mL HFM-RhaB水解柚皮苷120min,转化率达58.8%,但对芦丁几乎没有活性。HFM-RhaC对芦丁和柚皮苷的催化活性较好,180μg/mL的HFM-RhaC水解芦丁和柚皮苷120 min时,转化率分别为66.1%和49.2%。本研究提供了获得高概率活性的新酶资源挖掘策略,获得了具有自主知识产权的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶资源,并对黄酮类化合物进行了生物转化研究,对下一步酶法或全细胞法生物转化天然来源的黄酮类化合物具有指导作用。
Abstract
α-L-shu li tang gan mei （α-L-rhamnosidase,E.C.3.2.1.40）shi yi lei tang gan shui jie mei ,ke tong guo zhuan yi xing shui jie huang tong lei hua ge wu mo duan de α-L-shu li tang ji cong er di gao ji sheng wu li yong lv ji sheng wu xue huo xing 。α-L-shu li tang gan mei zuo wei yi lei sheng wu cui hua ji ,you an fan de ying yong qian jing 。mu qian yi biao zheng de xi jun yuan GH78jia zu α-L-shu li tang gan mei jin you 19ge ,you guan ji zai sheng wu cui hua ying yong fang mian de bao dao zhu yao ji zhong zai zhen jun ,yin ci ,xin xing xi jun yuan α-L-shu li tang gan mei zi yuan de wa jue ji ji dui tian ran huang tong tang gan de sheng wu zhuai hua yan jiu ju you chong yao yi yi 。ben yan jiu shou xian li yong ji yin zu xin xi wa jue xin mei fa xian ce lve ,cong jie gan lin zhi tu de gan jun ji yin zu zhong de dao san ge α-L-shu li tang gan mei ji yin PhRha78D、PhRha78Ehe PhRha78G,tong guo chuan tong de shuang mei qie lian jie fa gou jian yu biao da zai ti pET-28a,zhuai ru da chang gan jun BL21（DE3）jin hang yi yuan biao da ,SDS-PAGEji mei huo jian ce jie guo biao ming ,PhRha78D、PhRha78E、PhRha78Gda bu fen yi cui hua huo xing bao han ti xing shi yi yuan biao da 。PhRha78Dmei huo li jiao di ,jin dui PhRha78Ehe PhRha78Gjin hang le mei xue te xing yan jiu ,er zhe de zui kuo pHfen bie wei 6.5he 7.0,dan zui kuo fan ying wen du que xiang cha hen da ,fen bie wei 60oChe 40oC;dong li xue chang shu KMfen bie wei 0.55he 0.4 mM,kcatfen bie wei 0.18 s-1he 0.12 s-1;PhRha78Ede T50wei 51℃,zai 40-50℃fu yo 30 minhou hai you 59%yi shang de huo xing ,er PhRha78Gde T50wei 36℃,20-36℃re shi huo 30 minreng you 50%yi shang de can yu huo li ;you ji rong ji nai shou xing xian shi ,er zhe jun ke nai shou 1%di nong du de you ji rong ji 。di yi chong ce lve huo de xin mei de cui hua huo xing bu ke yu ce ,ke rong xing biao da bu ke kong 。ji yu ci yin ru di er chong ce lve —hong ji yin zu gao tong liang ce xu jie ge cui hua guan jian ji xu xu ni shai shua de xin mei fa xian ce lve ,li yong gai ce lve cong ren fen bian hong ji yin zu zhong huo de san ge mu biao hou shua mei ji yin HFM-RhaA、HFM-RhaBhe HFM-RhaC,mi ma zi you hua yu quan ji yin ge cheng hou ,li yong xin ying de mo feng ke long ji shu gou jian chong zu zhi li 。zai da chang gan jun zhong yi yuan biao da hou ,SDS-PAGEbiao ming ,san zhe da bu fen yi ke rong xing xing shi biao da yu shang qing zhong ,li yong nie zhu qin he chun hua hou jin hang le mei xue xing zhi biao zheng ,san ge mei de zui kuo pHfen bie wei 6.0、6.0、5.7,zui kuo wen du fen bie wei 40 oC、60oC、40oC;HFM-RhaAhe HFM-RhaCde KMjun hen xiao ,fen bie wei 1.59 mMhe 0.053 mM,zui da fan ying su lv fen bie wei 57.6μmol min-1mg-1he 37.6μmol min-1mg-1,kcatfen bie wei 92.8 s-1he 62.9 s-1;HFM-RhaAhe HFM-RhaCde T50fen bie wei 35℃he 28℃;HFM-RhaAdui 5%shen zhi 10%de chun lei you ji rong ji you hen hao de nai shou xing ,er HFM-RhaCjin dui 5%de chun lei you ji rong ji you jiao hao de nai shou xing 。dui mei xue xing zhi you yi ding de le jie hou ,jin yi bu tan jiu le HFM-Rhadui lu ding he you pi gan de sheng wu zhuai hua qing kuang 。HFM-RhaAke yi gao xiao shui jie lu ding he you pi gan ,dan shui jie you pi gan de xiao lv geng gao xiao ,30μg/mLde HFM-RhaAcui hua shui jie you pi gan shi ,88.6%de de wu zhuai hua wei ying tao gan ,er 120μg/mLde HFM-RhaAshui jie lu ding shi ,zhuai hua lv da 80.8%。200μg/mL HFM-RhaBshui jie you pi gan 120min,zhuai hua lv da 58.8%,dan dui lu ding ji hu mei you huo xing 。HFM-RhaCdui lu ding he you pi gan de cui hua huo xing jiao hao ,180μg/mLde HFM-RhaCshui jie lu ding he you pi gan 120 minshi ,zhuai hua lv fen bie wei 66.1%he 49.2%。ben yan jiu di gong le huo de gao gai lv huo xing de xin mei zi yuan wa jue ce lve ,huo de le ju you zi zhu zhi shi chan quan de xin xing xi jun yuan α-L-shu li tang gan mei zi yuan ,bing dui huang tong lei hua ge wu jin hang le sheng wu zhuai hua yan jiu ,dui xia yi bu mei fa huo quan xi bao fa sheng wu zhuai hua tian ran lai yuan de huang tong lei hua ge wu ju you zhi dao zuo yong 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自山西大学的张甜，发表于刊物山西大学2019-11-12论文，是一篇关于鼠李糖苷酶论文,家族论文,基因组挖掘论文,催化关键基序论文,黄酮糖苷的生物转化论文,山西大学2019-11-12论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自山西大学2019-11-12论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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