导读:本文包含了酚氧化酶原激活酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:克氏原螯虾,血蓝蛋白,酚氧化酶,丝氨酸蛋白酶
酚氧化酶原激活酶论文文献综述
张娟,魏克强,赵婷[1]（2016）在《Cu~(2+)胁迫对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)酚氧化酶原激活系统活性的影响》一文中研究指出重金属铜是养殖水体的主要污染物,严重影响甲壳动物的免疫机能。以淡水克氏原螯虾(Procambarus clarkii)为实验对象,以亚致死浓度(1.0、3.0、5.0、10.0 mg·L~(-1),96-h LC50=22.14 mg·L~(-1))的Cu~(2+)为胁迫因子,采用静态水质接触染毒法,通过分析血细胞内酚氧化酶原(pro PO)、丝氨酸蛋白酶(SP)以及血淋巴中酚氧化酶(PO)、血蓝蛋白(Hc)和血细胞数(THC)的水平,探讨了Cu~(2+)胁迫对酚氧化酶原激活系统(pro PO-AS)活性的影响。结果表明,与未染毒的对照组相比,Cu~(2+)显着抑制proPO、PO的活性以及THC、Hc的含量(P<0.05);但仅在10.0 mg·L~(-1)Cu~(2+)浓度下,SP的活性显着降低(P<0.05)。研究结果提示,水体Cu~(2+)对螯虾具有免疫毒性效应,氧化应激导致的血细胞数、血蓝蛋白含量、丝氨酸蛋白酶活性抑制可能是影响pro PO-AS活性的主要机制之一。(本文来源于《农业环境科学学报》期刊2016年05期）
于杰伦[2]（2016）在《日本沼虾酚氧化酶原激活因子基因克隆及其表达分析》一文中研究指出日本沼虾(Macrobrachium nipponense),俗称青虾,属于甲壳纲(Crustarcea)、十足目(Decaplda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Palaemonidae),广泛分布于我国多种淡水水域,是我国淡水虾类养殖中一个重要的养殖品种。近年来,青虾养殖中的病害问题日益凸显,成为制约青虾养殖业健康发展的重要因素,亟待研究和解决。酚氧化酶原激活系统(Prophenoloxidaseactivating system,pro-PO)是无脊椎动物先天免疫机制中最重要的组成部分。酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase-activating Factor,PPAF)是酚氧化物酶原激活及其辅因子丝氨酸同系物活化的重要因子,可以直接影响酚氧化酶的活力和机体的免疫防御机制。这些免疫相关因子在抵御病原微生物入侵,以及参与机体免疫活动,一直倍受关注。本研究通过RACE方法首次克隆了日本沼虾PPAF的cDNA全长序列;通过半定量PCR技术分别对目的基因进行了不同组织的表达谱分析,主要研究内容和结果如下。通过RACE技术首次得到PPAF基因的cDNA全序列,全长1261bp,包括364bp的5'UTR,822bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),75bp的3'UTR。编码区271个氨基酸,预测蛋白质分子量是30.389.86kDa,等电点为9.727,其中包含34个碱性氨基酸(K,R),18个酸性氨基酸(D,E),94个疏水性氨基酸(A,I,L,F,W,V),75个极性氨基酸(N,C,Q,S,T,Y)。开放阅读框的组成分析结果发现其G、C碱基的含量(51.09%)高于A、T碱基的含量(48.91%)。分析日本沼虾PPAF基因的氨基酸序列的结构域,结果发现在84-277区域左右有一个胰蛋白酶功能域,在77-278区域中有一胰蛋白酶家族中的类丝氨酸蛋白功能域。构建了进化树,分析表明日本沼虾PPAF基因与中国对虾的同源性最高,与家蚕、棉铃虫的同源性最低。采用荧光定量PCR技术检测了PPAF基因在沼虾体内不同组织的差异表达情况。检测结果显示,PPAF基因在健康的日本沼虾的不同组织内表达水平差异显着(P<0.05),在肝胰腺、鳃和血细胞等免疫相关的组织中的表达水平较高;而在肌肉、精巢、卵巢和甲壳等组织中的表达水平低。选取肝胰腺组织来检测PPAF基因在沼虾感染嗜水气单胞菌后不同时期的表达量变化情况,以空白组的β-actin基因作标准,检测不同时期表达量变化规律。半定量PCR分析结果发现,在感染了嗜水气单孢菌后的72h内,日本沼虾的PPAF基因在肝胰腺、鳃、血细胞组织中的mRNA表达差异显着(P<0.05)。PO活性在攻毒组中变化明显,在嗜水气单胞菌刺激后,PO活性在注射3小时后增加到4.23倍,与生理盐水注射组相比有显着的提高。嗜水气单胞菌注射后的PO活性的显着变化现象表明,细菌可以触发酚氧化酶原激活系统转换成PO,说明青虾的酚氧化酶原系统可以抵御外界细菌的侵袭,表明酚氧化酶原系统在青虾的免疫系统中起到着重要的作用。PPAF是日本沼虾最重要的体液免疫系统proPO的关键性因子,在机体的免疫系统中占有重要地位。本研究对PPAF基因在感染嗜水气单胞菌后免疫组织中的表达规律的研究,揭示了日本沼虾在对抗细菌性疾病的免疫防御中的遗传机制奠定了基础;进一步揭示了酚氧化酶原激活系统参与免疫防御的遗传机制奠定了基础。(本文来源于《山东农业大学》期刊2016-04-28）
王景[3]（2015）在《拟穴青蟹酚氧化酶原激活系统关键基因及血蓝蛋白基因的研究与分析》一文中研究指出拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国重要的海水养殖经济蟹类之一。近年来,青蟹的人工养殖规模不断扩大,但在青蟹的人工育苗和养殖过程中因容易受水质、微生物感染等导致存活率仍较低,同时养殖业抗生素药品的大量使用使病原微生物的耐药性不断增加,这些都极大地限制了产业的发展。因此对青蟹免疫机制的研究具有十分重要的意义。酚氧化酶系统是无脊椎动物特有的一套非自身识别免疫系统,尤其是在节肢动物的免疫机制中具有非常重要的作用。血蓝蛋白是一类在节肢动物和软体动物中负责运输氧气的含铜呼吸蛋白。近年来很多研究表明节肢动物的血蓝蛋白和酚氧化酶具有同源关系,结构上非常相似,且在一定条件下血蓝蛋白又具有酚氧化酶活性。本研究主要通过构建拟穴青蟹的c DNA文库,借助c DNA末端快速扩增(RACE)技术和实时荧光定量PCR技术对拟穴青蟹酚氧化酶原激活系统中的两个相关基因以及血蓝蛋白基因进行了克隆和不同模式下的表达分析,并利用生物信息学的方法对获得的序列进行了分析研究,试图从分子生物学的角度来探讨这些基因之间的关系以及它们在拟穴青蟹免疫过程中的作用,以期为缓解拟穴青蟹养殖业的病害问题提供重要的理论基础。本文主要研究结果总结如下:1、酚氧化酶原激活酶(PPAF)是一类含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶,可以激活无活性的酚氧化酶原(pro PO),从而引起病原菌的黑化反应,是酚氧化酶系统的关键组成部分。本文克隆到了拟穴青蟹PPAF1和PPAF2两个基因的c DNA全长,比对结果显示它们与其他物种的PPAF具有较高的同源性,综合分析后分别命名为Sp PPAF1和Sp PPAF2。Sp PPAF1序列c DNA全长为1677bp,其中包括52bp的5’-末端非转录区(5’-UTR),1131bp的ORF和494bp的3’-末端非转录区(3’-UTR),共编码376个氨基酸,预测蛋白分子量38.43 k Da。Sp PPAF2序列c DNA全长为1808bp,其中包括88bp的5’-UTR,1125bp的ORF和595bp的3’-UTR,共编码374个氨基酸,预测蛋白分子量38.56 k Da。Sp PPAF1和Sp PPAF2都含有如下结构:信号肽区域、一个典型的N端clip结构域和具有催化活性的C端丝氨酸蛋白结构域。两者氨基酸序列相似性为81.0%。荧光定量PCR实验结果显示Sp PPAF1和Sp PPAF2在7个组织(血液、肝胰腺、鳃、精巢、心脏、肌肉和卵巢)中均有表达,其中Sp PPAF1在鳃、精巢和血液中表达量较高,Sp PPAF2主要在血液中表达。用副溶血弧菌感染处理大眼幼体,结果显示Sp PPAF1和Sp PPAF2的表达量除了感染的前6 h变化趋势有略微不同外,在接下来的6 h都显着升高,至12h时达到最大值,随后下降,至72 h时基本恢复正常水平。结果表明拟穴青蟹中PPAF可能与机体对外来病原的免疫防御作用密切相关,作用周期大约为72 h。2、酚氧化酶原(pro PO)是一种含铜的保守酶,也是酚氧化酶原激活系统的关键组成部分和黑色素生成的关键酶。本文获得了拟穴青蟹pro PO基因的c DNA全长,比对结果显示它与其他物种的pro PO具有较高的同源性,经综合分析后确定命名为Sppro PO。该序列全长为2688bp,其中包括40bp的5’-UTR,2133bp的ORF和515bp的3’-UTR,共编码710个氨基酸,预测蛋白分子量约为81.5 k Da,等电点约为6.01。序列分析结果显示Sppro PO含有叁个串联的血蓝蛋白保守结构域和两个保守的铜离子结合位点。运用荧光定量PCR技术检测了Sppro PO在拟穴青蟹不同组织中的表达差异情况,结果显示Sppro PO在拟穴青蟹的7个不同组织中均有表达,其中在血液和精巢中表达量较高,在心脏中的表达量最低。本实验为深入研究拟穴青蟹酚氧化酶原基因的结构和功能奠定了基础。3、血蓝蛋白(Hc)是许多节肢动物和软体动物中重要的呼吸蛋白,为动物的生存提供了重要的支撑。本文克隆到了拟穴青蟹中Hc1、Hc2、Hc3和Hc4四个基因的c DNA全长,比对结果显示它与其他物种的Hc具有较高的同源性,综合分析后分别命名为Sp Hc1、Sp Hc2、Sp Hc3和Sp Hc4,全长分别为2281 bp,2002 bp,2184 bp和2069 bp,分别编码676,570,672和671个氨基酸,预测蛋白分子量分别为76.8,65.0,76.3和76.4 k Da。序列分析结果显示Sp Hc含有叁个串联的血蓝蛋白保守结构域和两个保守的铜离子结合位点。运用荧光定量PCR技术研究了血蓝蛋白基因在拟穴青蟹各个不同组织,溞状幼体Z1-Z5期、大眼幼体M期以及仔蟹C1期等7个不同发育阶段的时空表达差异。分析结果表明Sp Hc在各个组织中均有表达,其中主要在肝胰腺、精巢和血液中表达;另外,在不同的发育时期也均有表达,其中在前6个发育时期时,Sp Hc3和Sp Hc4的表达量要显着高于Sp Hc1和Sp Hc2,但到仔蟹期时Sp Hc3和Sp Hc4的表达量突然下降,低于Sp Hc1和Sp Hc2。副溶血弧菌感染试验结果表明:在感染后的前3 h内,Sp Hc的表达量明显下降,在随后的9 h逐渐上升,至12 h时达到最大值。研究结果说明血蓝蛋白基因可能参与了拟穴青蟹的免疫抗菌过程,且四个血蓝蛋白基因在拟穴青蟹不同发育时期可能发挥着不同的作用,Sp Hc3和Sp Hc4可能在青蟹浮游生活时期发挥主要作用,而Sp Hc1和Sp Hc2可能在其底栖及以后的生活中发挥主要作用。综上所述,本研究共克隆得到了7个与拟穴青蟹酚氧化酶系统相关的基因的c DNA全长序列,并研究了他们在拟穴青蟹中不同模式下的表达差异情况。研究结果初步揭示了拟穴青蟹酚氧化酶系统及血蓝蛋白的分子基础以及应对微生物感染的调控趋势,为今后这些基因的功能研究奠定了基础。(本文来源于《上海海洋大学》期刊2015-06-10）
陈晓宇,时敏,陈学新[4]（2015）在《昆虫酚氧化酶原激活酶研究》一文中研究指出昆虫酚氧化酶原激活酶(Prophenoloxidase activating proteinase,PAP)是酚氧化酶原激活过程中的一个关键酶,是昆虫先天性体液免疫体系的重要组成部分。外界的免疫刺激能够诱导级联反应上游的蛋白对酚氧化酶原激活酶的前体进行剪切激活,而激活后的酚氧化酶原激活酶能够将无活性的酚氧化酶原剪切激活为有活性的酚氧化酶并最终生成细胞毒素物质来消灭外源物。本文综述了昆虫酚氧化酶原激活酶的结构与特性及其在酚氧化酶原级联激活系统中的作用机制,并探讨了寄生蜂对寄主昆虫酚氧化酶原激活酶的调控。(本文来源于《应用昆虫学报》期刊2015年02期）
赵永贞,陈秀荔,曾地刚,杨春玲,彭敏[5]（2014）在《凡纳滨对虾酚氧化酶原激活因子基因的克隆及表达分析》一文中研究指出为研究酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase-activating factor,PPAF)在凡纳滨对虾感染传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)过程中所起的免疫作用,实验采用逆转录聚合酶链式反应和cDNA末端快速扩增技术克隆了凡纳滨对虾PPAF基因的全长cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR技术分析了该基因在正常凡纳滨对虾和感染IHHNV凡纳滨对虾不同组织的表达情况。结果显示,克隆获得了1 986 bp凡纳滨对虾PPAF基因cDNA全长序列(GenBank登录号JQ684529),其中含有一个1 629 bp开放阅读框(ORF),两翼分别存在21 bp(5'端)和336 bp(3'端)的非翻译区。该基因的开放阅读框共编码542个氨基酸,氨基酸序列269~517处存在功能结构域——丝氨酸蛋白酶结构域,氨基酸序列494~502区域存在一个ALPHA-2巨球型免疫蛋白功能位点,316~321区域有一个组氨酸酶活性位点;定量PCR分析发现,该基因无论在正常对虾还是感染IHHNV对虾的心脏、肝胰腺、肠、胃和肌肉中的表达量均较低,在血液和鳃腺中的表达量明显高于其他组织,但感染IHHNV对虾不同组织中PPAF基因的表达量均低于正常对虾相应组织中的表达量。定量检测PPAF基因在对虾鳃腺组织中的表达情况显示,对虾感染IHHNV后,PPAF基因的表达量急剧降低,3 h时至最低,之后表达量逐渐上升,48h时达最高值。研究表明,IHHNV可抑制PPAF基因的表达,因而抑制酚氧化酶原免疫系统的有效激活,或是其感染对虾并在对虾组织内增殖的原因之一。(本文来源于《水产学报》期刊2014年08期）
钟锐,丁天波,廖重宇,张昆,豆威[6]（2013）在《柑橘全爪螨酚氧化酶原激活酶基因cDNA克隆及生物信息学分析》一文中研究指出酚氧化酶原激活酶(prophenoloxidase activating enzyme,PPAE)是酚氧化酶激活系统(prophenoloxidase activating system,PPO-AS)的组成部分,是无脊椎动物抵御入侵微生物的关键酶。本研究利用RACE技术从柑橘全爪螨Panonychus citri(McGergor)体内获得一条PPAE基因全长cDNA,命名为PcPPAE(GenBank:KC136292),属于丝氨酸蛋白酶家族。该基因cDNA全长1 676 bp,开放阅读框1 377 bp,编码458个氨基酸。该基因编码蛋白预测分子量为49.9 ku,理论等电点(pI值)为5.68,分子式为C2201H3467N607O678S22,不稳定系数为41.51,总亲水性系数为-0.268。经序列比对发现该基因具有发夹结构域,丝氨酸蛋白酶结构域,以及丝氨酸蛋白酶结构域中保守的催化叁联体。系统发育分析表明该基因与二斑叶螨发夹结构丝氨酸蛋白酶基因的亲缘关系最近。本研究首次从柑橘全爪螨体内克隆获得酚氧化酶原激活酶,为后期进行柑橘全爪螨抵御微生物侵染机制研究奠定了基础。(本文来源于《应用昆虫学报》期刊2013年02期）
潘鲁青,朱现晔,景福涛[7]（2012）在《低溶解氧对凡纳滨对虾酚氧化酶原激活系统和相关免疫因子的影响》一文中研究指出本文研究了凡纳滨对虾在低溶解氧条件下酚氧化酶原系统的激活机制。结果表明:低溶氧(1.5mg/L,3.0mg/L)胁迫对凡纳滨对虾血淋巴中多巴胺含量、血细胞数量、酚氧化酶原激活系统相关酶活力、血淋巴中类α2-巨球蛋白活力影响显着(P<0.05),且各指标表现出明显的时间效应性。在实验时间内,DO为3.0mg/L处理组,总血细胞、小颗粒细胞和透明细胞数量均在12h内降低而后趋于稳定,大颗粒细胞数量在24h内降低后保持稳定,DO为1.5mg/L处理组,总血细胞数量和叁类血细胞数量均在24h内降低而后趋于稳定;DO为3.0mg/L和1.5mg/L处理组凡纳滨对虾血淋巴中多巴胺含量分别在24h、12h内呈峰值变化,至12h、6h时达到最大值,在24h、12h后恢复至对照组水平并趋于稳定;血细胞中酚氧化酶原活力分别在12h、6h时显着降低,且均在24h时趋于稳定;丝氨酸蛋白酶活力在6h时均显着降低,在24h时达到最低值,而后趋于稳定,蛋白酶抑制剂活力显着降低,但类α2-巨球蛋白活力48h内呈峰值变化,与对照组比较均显着升高,48h后趋于稳定。实验期内对照组DO为5.5mg/L各指标变化不显着。(本文来源于《海洋湖沼通报》期刊2012年02期）
岳磊磊[8]（2012）在《凡纳滨对虾酚氧化酶原激活因子和细胞黏附蛋白基因的克隆与序列分析》一文中研究指出无脊椎动物没有真正的抗体和获得性免疫系统,主要依靠先天性免疫系统来抵御外来病原微生物的侵害。酚氧化酶原激活系统(Prophenoloxidase activating system, pro-PO)是无脊椎动物先天免疫机制中具有重要作用的免疫系统。酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase activating factor, PPAF)和细胞黏附蛋白(Peroxinectin, PX)基因是酚氧化酶原激活系统中的两个重要因子,这些免疫相关因子是如何抵御病原微生物入侵,如何参与机体的免疫活动一直以来受到广泛关注,因此本研究通过RACE方法首次克隆了PPAF的cDNA全长(GenBank登录号JQ684529),及PX基因的部分序列,并对2个基因序列进行初步分析；通过半定量PCR分别对2个基因进行了不同组织的表达谱分析,研究结果如下：1.PPAF基因cDNA全长1986bp,其中含有一个1629bp开放阅读框(ORF),两翼分别存在21bp(5’端)和336bp(3’端)的非翻译区。该基因的开放阅读框共编码542个氨基酸,以SMART软件分析该氨基酸序列,269-517a区域是其功能域,是胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶；494-502a区域有一个ALPHA-2巨球型免疫蛋白功能位点；316-321a区域有一个组氨酸酶活性位点。进化树分析表明凡纳滨对虾PPAF基因与斑节对虾的同源性最高,与果蝇、蚊的同源性最低。通过半定量PCR分析发现该基因在正常对虾的心脏、肝胰腺、肠、胃和肌肉中的表达量没有差别,血液中的表达量明显高于其他组织；在感染IHHNV病毒的对虾的组织中的表达量下降明显,但是血液中的表达量仍明显高于其他组织。2.PX基因部分cDNA序列长度为1529bp,分析发现该序列含有1个1308bp的开放阅读框(ORF),3'端含有1个长度为221bp的非翻译区,开放阅读框共编码436个氨基酸。所获得的PX氨基酸序列理论等电点为4.64,分子量为48.86945KDa。经Signal P软件分析发现此氨基酸序列在72-86a区域有信号肽特征,82a是信号肽剪切位点的可能性最大。通过Motif Scan程序对其氨基酸序列进行分析,发现该氨基酸序列在其336-378a处有氧化物酶功能域；在172-179a处有一个八肽铜锚定位点；进化性分析表明PX序列与斑节对虾编码的氨基酸序列最高,与果蝇的相似度最低；半定量PCR分析发现该基因在正常对虾的血液中表达量最高,肝胰腺次之,在心脏、肠、胃和肌肉中的表达量没有差别,该基因在IHHNV病毒感染对虾的血液、心脏、肝胰腺、肠、胃和肌肉中的表达量下降明显,但在血液和肝胰腺中的表达量仍比其他组织要高。(本文来源于《广西大学》期刊2012-05-01）
陈晓宇[9]（2012）在《小菜蛾酚氧化酶原激活酶基因克隆与功能初探》一文中研究指出酚氧化酶原激活蛋白酶(PAPs)是酚氧化酶原激活过程中的一个关键酶。外界的免疫刺激能够诱导级联反应上游的蛋白对PAP的前体进行剪切激活,而激活后的PAP能够将无活性的酚氧化酶原剪切激活为有活性的酚氧化酶并最终生成细胞毒素物质来消灭外源物。本文克隆了两个小菜蛾PAP基因,并对其功能进行了初步研究。现将研究结果总结如下：1)采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得了2条cDNA的全长序列,所克隆的2条全长cDNA序列命名为Px-PAP1和Px-PAP3b,长度分别为1595及1650bp,开放阅读框长度分别为1149与1323bp。序列分析结果表明,Px-PAP1和Px-PAP3b均含有信号肽序列,羧基末端都包含完整的催化叁联体,Px-PAP1在氨基末端含有一个发夹结构域,然而Px-PAP3b在氨基末端含有两个发夹结构域。多序列比对结果表明,Px-PAP1和Px-PAP3b编码的氨基酸序列和其它鳞翅目昆虫的PAP存在较高相似性。进化树分析结果表明,Px-PAP1与Px-PAP3b分别能与其它昆虫的PAP1与PAP3聚类,同源关系较近。2)明确了大肠杆菌诱导后酚氧化酶原激活酶基因的转录规律。在小菜蛾幼虫体内注入已灭活的大肠杆菌进行免疫诱导,并于注射后0、2、4、8、12及24h取样,提取血细胞的RNA,进行rt-qPCR检测。结果显示,经大肠杆菌免疫诱导后,Px-PAP1、x－PAP3a和Px-PAP3b叁个基因的表达量都会显着升高,大肠杆菌诱导后0-4h,Px-PAP1及Px-PAP3a的转录水平逐渐升高,并且两个基因都于诱导后4h达到峰值,而后4-24小时内,这两个基因的表达量逐渐回落。而Px-PAP3b基因的转录水平在大肠杆菌诱导后0-8h都逐渐升高,并于诱导后8h达到峰值,而后8-24小时内,此基因的表达量逐渐回落。在大肠杆菌诱导后,Px-PAP3b的表达量显着高于Px-PAP1和Px-PAP3a。3)明确了CvBV对酚氧化酶原激活酶基因的转录激活有抑制作用。将E. coli+CvBV(0.05VREs)注射到4龄初期小菜蛾幼虫体内,以仅注射E.coli为对照,于注射后4、8h进行取样,提取血细胞的RNA,进行rt-qPCR检测。结果显示,在注射后4h和8h后,Px-PAP1、Px-PAP3a和Px-PAP3b叁个基因相对于仅注射E.coli的对照组而言,其表达量都被下调。4)进行了小菜蛾酚氧化酶原激活酶基因的RNA干扰实验。在小菜蛾幼虫体内注入E. coli+700ng dsPAP,以注射E. coli+700ng dsGFP为对照。处理组与对照组都于注射后6、12及24h后进行取样,采用rt-qPCR的方法对RNA干扰的效果进行检测。结果表明,在针对Px-PAP1基因的干扰试验中,发现12h后Px-PAP1基因表达没有受到抑制,而与其同源的Px-PAP3a基因的表达却成功地被抑制；在针对Px-PAP3a基因的干扰试验中,发现12h后Px-PAP1与Px-PAP3a基因表达同时被抑制；在针对Px-PAP3b基因的干扰试验中,6h后未检测到干扰效果,12h及24h后才检测到明显的干扰效果,且随着时间的推移干扰效果逐渐下降,此时Px-PAP1与Px-PAP3a基因都未检测到干扰效果。(本文来源于《浙江大学》期刊2012-05-01）
翟会锋[10]（2012）在《亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis幼虫酚氧化酶原激活蛋白酶cDNA克隆和表达分析》一文中研究指出为研究亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)幼虫体内酚氧化酶原激活蛋白酶(prophenoloxidase activating proteinase,PAP)表达调控的分子机理,本研究通过RACE技术获得该基因的cDNA序列,对PAP基因序列进行了生物信息学,通过原核表达并纯化了表达产物,采用Western blot和酶活测定进行鉴定。对玉米螟幼虫进行细菌注射,通过Real timePCR检测注射前后PAP基因在不同组织中mRNA水平上的表达变化情况。主要研究结果如下：(1)采用RT-PCR及RACE技术从亚洲玉米螟幼虫中克隆PAP基因全长cDNA序列。该基因全长1455bp,开放阅读框为1200bp,编码400个氨基酸；5’和3’非编码区分别为66bP和189bp。PAP的计算分子量约为44.8kDa,估测等电点pI为6.66。生物信息学分析表明：该基因序列中含有丝氨酸蛋白酶样结构域中保守的催化叁联体,含有两个发夹结构域(Clip),分别为位于23-70位氨基酸的结构域和153-394位氨基酸的结构域,其中153-394位氨基酸也被称为丝氨酸蛋白酶结构域(serine proteinase,SP)。PAP蛋白无跨膜结构域,无糖基化位点,N端含有信号肽,切割位点为18与19位氨基酸之间,含有19个磷酸化位点均匀分布于整个多肽链中。BlastP分析结果表明：该片段的氨基酸序列与鳞翅目烟草天蛾Manduca sexta PAP3precursor、Manduca sexta PAP3、Manduca sexta PAP2、家蚕Bombyx mori PPAE、蓖麻蚕Samia cynthia ricini PAP和斜纹夜蛾Spodoptera litura PPAE3氨基酸序列具有较高的同源性,其氨基酸一致性在37%以上。构建系统发育树,对其进化关系进行了初步分析,结果显示：亚洲玉米螟PAP与烟草天蛾PAP3和斜纹夜蛾PPAE3的亲缘关系较近,与甲壳纲的印度明对虾Fenneropenaeus indicus PPAF和斑节对虾Penaeus monodon PPAE亲缘关系较远。(2)为了对PAP蛋白进行结构分析,对PAP含有第二个Clip(153-394位氨基酸)的丝氨酸蛋白酶(SP)结构域进行了亚克隆,分别获得了3个不同片段：PAP-SP1(144-400位氨基酸)、PAP-SP2(154-400位氨基酸)和PAP-SP3(44-400位氨基酸)。采用pET表达系统对PAP蛋白和SP结构域分别进行了原核表达,PAP全酶蛋白在IPTG的梯度诱导之后在沉淀均有大量表达,重组表达的蛋白质分子的大小与预测蛋白分子量大小一致,约为46.64kDa。pET-28b-PAP-SP1在37℃温度下,可以明显看到0.2mmol/L和0.1mmol/L IPTG诱导下有明显的蛋白表达。pET-28b-PAP-SP2在28℃温度诱导下,可以明显观察到0.1mmol/L IPTG诱导下蛋白在上清有明显表达。PAP-SP3通过构建融合表达载体并进行诱导表达发现pET-28a-HMsbT-PAP-SP3在25℃温度、0.1mmol/L IPTG诱导时有较为明显的上清蛋白表达。通过FLAG标签蛋白的单克隆抗体对原核表达的PAP-SP3进行Western blot验证,结果与SDS-PAGE一致,然后对大量表达的蛋白进行Ni2+柱纯化,结果在洗脱液1(Elution1)中获得了HMsbT-PAP-SP3重组蛋白。采用测定PAP蛋白的酰胺酶活测定方法,以乙酰基-异亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(acetyl-Ile-Glu-Ala-Arg-p-nitroanilide,IEARpNa)为底物进行了表达产物酶活的初步测定。其中]PAP、PAP-SP1、PAP-SP2分别以含有重组质粒的表达菌株在无IPTG诱导和0.1mmol/L IPTG诱导下,破碎细菌后对菌液上清进行酶活测定,结果表明均有活性,分别为139.2U/mg、1853.1U/mg、1743.3U/mg,但无IPTG诱导下的菌液上清也有蛋白活性,分别为25.0U/mg、1573.6U/mg、568.7U/mg,诱导前后菌液上清蛋白的比活力无显着差异(P>0.05)。对纯化获得的HMsbT-PAP-SP3重组蛋白PAP-SP3进行活性测定,结果显示其比活力为1135.1U/mg。以上结果表明：我们己成功获得PAP蛋白及其SP结构域的表达产物,且纯化获得HMsbT-PAP-SP3具有较高的比活力重组蛋白。(3)为研究细菌(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)注射对亚洲玉米螟幼虫体内PAP基因转录水平的影响,对玉米螟幼虫进行生理盐水、革兰氏阴性菌大肠杆菌及革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌注射,并通过Real time PCR检测注射后不同时间(0h、4h、8h、12h、24h、36h)PAP基因在不同组织(血细胞、脂肪体、中肠、体壁)中的表达变化。结果表明：亚洲玉米螟血细胞中PAP基因的表达只在大肠杆菌注射后有显着的变化,4h时剧烈上升达到了115.3±23.2倍,随后又急剧下降,而在其他诱导物诱导后无显着变化(P>0.05)。脂肪体中PAP mRNA的表达整体上变化不显着(P>0.05)。在中肠中,枯草芽孢杆菌注射处理与对照组相比PAP mRNA的表达有明显差异(P>0.05),并随时间变化有上升的趋势,在36h时PAP mRNA表达量最高,达到了107.6±7.2倍,其他处理组无显着变化(P>0.05)。在体壁中,不同的注射处理与对照组相比PAP mRNA的表达均有一定程度的升高,其中枯草芽孢杆菌处理组表达最为明显,在12h时PAP mRNA表达量达到了对照组的105.2±1.6倍,生理盐水处理组在8h达到了36.4±0.5倍,大肠杆菌处理组在36h时也达到了21.3±0.3倍。(本文来源于《扬州大学》期刊2012-04-01）
酚氧化酶原激活酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
日本沼虾(Macrobrachium nipponense),俗称青虾,属于甲壳纲(Crustarcea)、十足目(Decaplda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Palaemonidae),广泛分布于我国多种淡水水域,是我国淡水虾类养殖中一个重要的养殖品种。近年来,青虾养殖中的病害问题日益凸显,成为制约青虾养殖业健康发展的重要因素,亟待研究和解决。酚氧化酶原激活系统(Prophenoloxidaseactivating system,pro-PO)是无脊椎动物先天免疫机制中最重要的组成部分。酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase-activating Factor,PPAF)是酚氧化物酶原激活及其辅因子丝氨酸同系物活化的重要因子,可以直接影响酚氧化酶的活力和机体的免疫防御机制。这些免疫相关因子在抵御病原微生物入侵,以及参与机体免疫活动,一直倍受关注。本研究通过RACE方法首次克隆了日本沼虾PPAF的cDNA全长序列;通过半定量PCR技术分别对目的基因进行了不同组织的表达谱分析,主要研究内容和结果如下。通过RACE技术首次得到PPAF基因的cDNA全序列,全长1261bp,包括364bp的5'UTR,822bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),75bp的3'UTR。编码区271个氨基酸,预测蛋白质分子量是30.389.86kDa,等电点为9.727,其中包含34个碱性氨基酸(K,R),18个酸性氨基酸(D,E),94个疏水性氨基酸(A,I,L,F,W,V),75个极性氨基酸(N,C,Q,S,T,Y)。开放阅读框的组成分析结果发现其G、C碱基的含量(51.09%)高于A、T碱基的含量(48.91%)。分析日本沼虾PPAF基因的氨基酸序列的结构域,结果发现在84-277区域左右有一个胰蛋白酶功能域,在77-278区域中有一胰蛋白酶家族中的类丝氨酸蛋白功能域。构建了进化树,分析表明日本沼虾PPAF基因与中国对虾的同源性最高,与家蚕、棉铃虫的同源性最低。采用荧光定量PCR技术检测了PPAF基因在沼虾体内不同组织的差异表达情况。检测结果显示,PPAF基因在健康的日本沼虾的不同组织内表达水平差异显着(P<0.05),在肝胰腺、鳃和血细胞等免疫相关的组织中的表达水平较高;而在肌肉、精巢、卵巢和甲壳等组织中的表达水平低。选取肝胰腺组织来检测PPAF基因在沼虾感染嗜水气单胞菌后不同时期的表达量变化情况,以空白组的β-actin基因作标准,检测不同时期表达量变化规律。半定量PCR分析结果发现,在感染了嗜水气单孢菌后的72h内,日本沼虾的PPAF基因在肝胰腺、鳃、血细胞组织中的mRNA表达差异显着(P<0.05)。PO活性在攻毒组中变化明显,在嗜水气单胞菌刺激后,PO活性在注射3小时后增加到4.23倍,与生理盐水注射组相比有显着的提高。嗜水气单胞菌注射后的PO活性的显着变化现象表明,细菌可以触发酚氧化酶原激活系统转换成PO,说明青虾的酚氧化酶原系统可以抵御外界细菌的侵袭,表明酚氧化酶原系统在青虾的免疫系统中起到着重要的作用。PPAF是日本沼虾最重要的体液免疫系统proPO的关键性因子,在机体的免疫系统中占有重要地位。本研究对PPAF基因在感染嗜水气单胞菌后免疫组织中的表达规律的研究,揭示了日本沼虾在对抗细菌性疾病的免疫防御中的遗传机制奠定了基础;进一步揭示了酚氧化酶原激活系统参与免疫防御的遗传机制奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
酚氧化酶原激活酶论文参考文献
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