阳宁
衡阳市南华大学附属第二医院湖南衡阳421001
【摘要】目的：分析microRNAs在前列腺癌组织中的表达。方法：选取我院2014年1月～2015年1月良性前列腺增生手术切除石蜡标本50例、前列腺癌切除石蜡标本50例，检测其中miR-98、let-7d、let-7g的表达情况，探讨用于前列腺癌早期诊断和分类分级的可能性。结果：与良性前列腺增生相比，miR-98、let-7d、let-7g在前列腺癌组织中的表达例数明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。let-7d、let-7g在前列腺癌组织中的表达例数与患者年龄、AJCC/UICC分期、PSA水平无关，差异不具有统计学意义（P＞0.05），与患者病理组织分型有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，miR-98在前列腺癌组织中的表达例数与患者病理组织分型、AJCC/UICC分期有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：miR-98、let-7d、let-7g的表达情况可在一定程度上反映前列腺癌的进展，可能可以作为一项重要指标，用于前列腺癌早期诊断和预后评估。
【关键词】前列腺癌；microRNA；miR-98；let-7d；let-7g
Abstract：Objective：toanalyzetheexpressionofmicroRNAsinprostatecancer.Methods：50casesofbenignprostatichyperplasiaand50casesofprostatecancerwereselectedfromJanuary2014toJanuary2015inourhospital.Theexpressionoflet-7d，let-7gandmiR-98weredetected，andthepossibilityofearlydiagnosisandclassificationofprostatecancerwasdiscussed.Results：theexpressionoflet-7d，miR-182andmiR-96inprostatecancertissueswassignificantlydecreased，andthedifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05）.Theexpressionoflet-7dandlet-7ginprostatecancertissueshadnostatisticalsignificance（P>0.05），andthedifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05）.Inaddition，theexpressionofmiR-98inprostatecancertissueswasrelatedtothepathologicaltype，AJCC/UICCstaging，andthedifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05）.Conclusion：theexpressionoflet-7d，let-7gandmiR-98canreflecttheprogressofprostatecancertoacertainextent，andmaybeusedasanimportantindexforearlydiagnosisandprognosisofprostatecancer.
Keywords：prostatecancer；microRNA；miR-98；let-7d；let-7g
前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，近年来，其发病率逐渐增高。前列腺癌的发生、发展受多因素多过程的影响[1]。miRNA是一类小分子单链RNA，约18～24个核苷酸，研究显示许多肿瘤发生发展过程中都存在miRNA表达水平的改变[2，3]。本研究采用PCR技术检测BPH和前列腺癌组织中miR-98、let-7d、let-7g的表达情况，并进一步分析前列腺癌组织中6种miRNAs表达的相关性，以期为前列腺癌的早期诊断提供新的参考指标.
1资料与方法
1.1一般资料选取我院2014年1月～2015年1月良性前列腺增生手术切除石蜡标本50例、前列腺癌切除石蜡标本50例。所有标本经l0%的福尔马林固定，石蜡包埋，4μm厚度切片，HE染色。其中，前列腺癌标本组织学类型均为腺癌，石蜡标本均在化疗前采集制作。前列腺癌切除患者年龄52～79岁，平均73.34±4.52岁；体重48～72㎏，平均61.35±6.70㎏。良性前列腺增生手术标本患者年龄53～80岁，平均74.02±5.11岁。体重50～74㎏，平均63.77±6.91㎏。两组一般资料均无无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。
1.2方法（1）DNA提取：采用大连宝生物工程有限公司生产的石蜡切片DNA提取试剂盒，按照说明书规范操作。操作步骤为：将1～3枚4μm厚度的石蜡包埋组织放入1.5mlMicrotube中，加入颠倒混匀的DEXPAT试剂0.5ml。盖上Microtube盖，100℃加热处理10分钟后，以12，000rpm的离心速度，4℃的离心温度离心10分钟。用移液枪吸取水层，采用紫外分光光度计检测提取与纯化得到的DNA片段的浓度与纯度，检测标准为：RNA在OD260处有显著吸收峰，OD260/OD280比值在1.9-2.1范围内。（2）PCR反应：PCR反应：采用针对miR-98、let-7d、let-7g基因序列的引物，由美国Anderson有限公司合成，见表1。
反应体系包括PCR缓冲液2μl，10.0mmol/LdNTP0.8μl，基因上下游引物各0.4μl，模板DNA1μl，Taq酶0.15μl，加水至总体积20μl。循环条件：先95℃预变性10min，然后以95℃变性15sec，60℃退火延伸60sec的循环条件作40个循环，最后40℃延伸10min。③基因多态性测定：采用适当的限制性内切酶消化PCR产物后进行电泳分析，电泳条件为琼脂糖浓度1%，电压200V，30min，通过观察条带的反应情况确定相关基因多态性。
1.3统计学分析所有数据均采用SPSS19.0统计软件对本研究相关数据进行统计学分析，计数资料用卡方检验，采用Fisher确切概率法，以P＜0.05作为差异具有统计学意义的标准。
2.2miRNAs的表达与临床各项参数的关系：见表3。由表中数据可见，let-7d、let-7g在前列腺癌组织中的表达例数与患者年龄、AJCC/UICC分期、PSA水平无关，差异不具有统计学意义（P＞0.05），与患者病理组织分型有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，miR-98在前列腺癌组织中的表达例数与患者病理组织分型、AJCC/UICC分期有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
3讨论
前列腺癌特异抗原（PSA）作为前列腺癌的早期检测和预后评估的指标广泛应用于临床，但实际操作中发现，其敏感性和特异性并不理想[4]。寻找一种高敏感性、高特异性的评价指标一直是前列腺癌研究的热点。miRNA是一类小分子RNA，通过参与调控基因表达，在细胞生长、分化、凋亡甚至癌变中发挥了重要作用[5-7]。目前已知一半以上的人类miRNA基因位于肿瘤相关基因区域，有研究证明miRNA的表达情况可在一定程度上反映肿瘤进展和分化的状态，并有研究利用miRNA成功培养出低分化肿瘤[8-10]。近年来，人们对存在与前列腺癌和良性前列腺增生组织中的miRNA进行监测，结果提示某些miRNA（如miR-98等）可能可以作为特异性标记物，应用于前列腺癌的鉴别诊断和分类分级[11]。miRNA的检测和功能分析不仅可以辅助前列腺癌的早期诊断，也可以辅助我们理解前列腺癌的发生发展过程。
本研究通过对50例前列腺癌和50例良性前列腺增生组织的石蜡标本进行miR-96、let-7d、let-7d的表达情况检测，探究miR-96、let-7d、let-7d对前列腺癌诊断和预后判断的意义。miR-98、let-7d、let-7g分别位于人类性染色体X、第9号染色体、第3号染色体，隶属于let-7基因家族。而let-7家族编码的miRNAs是第一个被发现的致癌miRNA，通过调节癌基因ras表达发挥作用。本研究结果显示，相比于良性前列腺增生组织，miR-98、let-7d、let-7g在前列腺癌中的表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），与国外相关研究结果相符，提示前列腺癌进展过程中let-7基因家族（如miR-98、let-7d、let-7g等）发挥了抑癌基因的作用。此外，本研究通过进一步分析miR-98、let-7d、let-7g的表达与前列腺癌临床各项指标之间的关系，结果发现miR-98、let-7d、let-7g与病理组织类型均具有相关性。其中，miR-98还与前列腺癌的临床分期具有相关性。这提示miR-98、let-7d、let-7g应用于前列腺癌的鉴别诊断和分类分级具有一定的价值。
综上所述，miR-98、let-7d、let-7g的表达情况可在一定程度上反映前列腺癌的进展，可能可以作为一项重要指标，用于前列腺癌早期诊断和预后评估。
参考文献：
[1]韩苏军，张思维，陈万青，李长岭.中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析[J].临床肿瘤学杂志，2013，04：330-334.
[2]XiaoLi，JinYanyang，TongMing.EffectofmiRNA-21onitstargetgenePTENinprostatecancerintheexpressionregulationmechanism[J].Modernpreventivemedicine，2013，06：1112-1115.[3]李靖.前列腺癌异常表达microRNAs的筛选及miRNA-182作用机制的初步研究[D].天津医科大学，2014.
[4]王苏贵.前列腺癌去势抵抗转化相关miRNA及其调控网络的整合分析[D].苏州大学，2013.
[5]张菊.miRNAlet-7a-1对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响[D].山东大学，2010.
[6]凌晓辉.miR-30c在前列腺癌中的临床意义及功能研究[D].南方医科大学，2013.
[7]张成.miRNA-141和miRNA-375在前列腺癌患者组织和血清中的表达及意义研究[D].南昌大学，2011.
[8]朱琳.前列腺癌患者血清中相关miRNA的检测[D].第四军医大学，2011.
[9]杨阳，张成，娄远蕾，谢安，王共先，汪泱.前列腺癌患者血清miRNA-192的表达及其靶基因预测分析[J].广东医学，2012，15：2259-2261.
[10]BaoYi，ZhuLiXiaojuan，CaiYi.ProstatecancermiRNAexpressionspectrumandmir-96inoxidativestresssignalingpathwayinrole[J].Medicalscience，2012，05：567-570.
[11]高维寅.miR-27a作为前列腺癌早期诊断标志物的初步研究[D].南昌大学，2014.