一、心肌细胞原代培养系统的建立及比率荧光技术对细胞内游离钙离子浓度的测定（论文文献综述）
钱真真[1]（2021）在《基于缝隙连接通道的附子心脏毒性早期预警及风险防控研究》文中研究表明中药的安全性问题一直是影响行业发展的重要问题,从马兜铃事件到何首乌事件,部分有毒药材引起的安全性问题,对中医药的发展和推广应用都造成了严重影响,如何预防中医药的安全性问题,特别是针对有毒药材,建立有毒药材的风险防控措施,对提高中药用药的安全性有重要的意义。附子,辛甘大热,归心肾脾,具有回阳救逆,补火助阳,散寒止痛之用,素为历代医家所喜用,在临床有效性上具有不可替代性。但因其毒性,使得附子及其复方制剂的安全性问题成为限制其临床使用的重要阻碍。附子毒性中以其心脏毒性最为常见,也最为致命。附子心脏毒性机制涉及离子通道、线粒体功能、细胞膜氧化损伤及缝隙连接通道等。其中,缝隙连接通道是一种特殊通道,主要负责连接相邻心肌细胞并参与调控其间化学信息的交换与电耦联,是维持正常心脏电活动的重要保证。目前关于附子心脏毒性的缝隙连接通路研究较少,尚未阐明其具体作用机制。基于此,本研究依托于国家重大科学工程建设项目计划（体现中药特点的重大疾病新药临床评价技术平台建设）,以附子心脏毒性为研究切入点,以缝隙连接通道为机制探索,从“成分-通路-靶点-临床评价”等方面开展“附子生物碱单体-药材-复方”等一体化、全链条的附子毒性研究、机制探索及风险防控,为构建有毒中药安全性评价体系提供参考。本研究包括以下四部分内容:第一部分 文献研究目的基于既往文献研究,围绕附子毒性,层层递进逐步梳理出课题的研究切入点,为进一步开展附子心脏毒性、构建附子安全性评价体系及风险防控研究提供理论基础与指导。方法首先基于Citespace软件对附子不良反应的相关研究进行文献计量分析;其次,基于既往文献研究对附子心脏毒性进行综述;最后,借助Pubchem、PDB数据库、PharmMapper数据库等导出附子双酯型生物碱的化学结构,及缝隙连接通道相关调控蛋白（CX40、CX43、SCN5A）的蛋白结构,并将此调控蛋白对应的基因靶点导入FunRich软件进行基因信息交互及生物进程富集分析。结果第一章文献计量:纳入研究文献245篇,最早研究可以追溯到1980年,大致可分为萌芽期（1980年到2004年）、快速增长期（2004年至今）;涉及作者548人,涉及单位/机构110家,发表文献最多的单位为成都中医药大学旗下相关单位（44篇,17.96%）。快速增长期涉及关键词428个,有23个出现频次≥5的,“心脏毒性”出现频次为11次,为领域研究较新的关键词,故基于此开展下一步关于附子心脏毒性的文献综述研究。第二章文献综述:附子心脏毒性表现包括心悸、心律失常及血压异常等,甚者可伴见心源性休克,甚至引起死亡。梳理化学成分包括生物碱及糖类、脂类等非生物碱成分等。心脏毒性物质基础主要是双酯型生物碱。毒性机制涉及离子通道、线粒体功能、细胞膜氧化损伤及缝隙连接通道等,其中,缝隙连接通道尚未研究清晰,涉及CX40、CX43、SCN5A等,故基于此开展下一步附子心脏毒性缝隙连接通道生物进程调控研究。第三章生物进程:数据库检索附子化学成分结构、缝隙连接通道调控蛋白的2D、3D结构,导入FunRich软件,对各基因进行交互信息分析,发现这3个基因与SRC、CSK等33个基因产生交互,生物进程涉及oligomerization of connexins into connexons、transport of connexons to the palsma membrane、regulation of gap junction activity、c-src mediated regulation of Cx43 function and closure of gap junctions、Transport of connexins along the secretory pathway、Microtubule-dependent trafficking of connexons from Golgi to the plasma membrane 等 6 个。小结附子不良反应众多,心脏毒性逐渐成为学者们的关注热点;附子心脏毒性机制涉及离子通道、线粒体功能、细胞膜氧化损伤及缝隙连接通道等。缝隙连接通道是心肌细胞间进行信息交换及电耦联的重要通路,可能通过参与调控离子通道影响心脏电生理进而产生心脏毒性。缝隙连接通道相关调节蛋白（CX40、CX43、SCN5A）对应的基因靶点与人体多个基因产生交互,参与人体多个生物进程。第二部分 附子生物碱的实验研究目的从附子毒性物质基础出发,探索附子单、双酯2种生物碱的毒性差异,毒性机制及毒性代谢特点,为构建附子安全性评价体系及风险防控研究奠定基础。方法首先,通过大鼠H9C2心肌细胞对附子主要毒性生物碱-双酯型生物碱（乌头碱）进行了心肌细胞毒性实验,实验中涉及的技术方法有:细胞孵育、细胞活力检测、生长曲线绘制、ELISA检测、细胞漏出率计算等;其次,对附子单、双酯2种生物碱进行了大鼠心脏毒性验证与比较,实验中涉及的技术方法有:大鼠灌胃、眼眶丛静脉采血、心电图检测,相关心脏毒性指标的ELISA检测等。最后,对附子单、双酯2种生物碱在大鼠体内的代谢特点进行了探索性研究,研究借助UPLC技术对大鼠灌胃后各时点采集的血液样本进行定性定量分析。结果细胞实验:乌头碱最小毒性浓度为0.03125%（0.2018mol/l）,IC50为2.882mmol/l,低浓度（0.0250mol/l、0.05040mol/l、0.10090mol/l）呈正向激发作用,当浓度在0.2018-1.6144mol/l时呈现出浓度、时间依赖性;在4h内随着药物作用时间的延长,细胞形态逐渐畸变,细胞核逐渐缩小,边界逐渐模糊,细胞间隙逐渐增大,细胞排列不规整;常规指标LDH、c-TNI、CK检测中,各浓度、时间组间差异呈现出统计学意义（P<0.05）;预警指标:与Control组,各浓度、时间组间组的SCN5A、CX43差异均无统计学意义（P值均>0.05）,CX40差异有统计学意义（P值<0.05）。动物实验:乌头碱最小毒性剂量为0.3mg/kg,以此剂量开展的等剂量下2种生物碱的毒性验证与比较,结果:1)ECG:心率:AC组90min、120min与KB组有差异（P值分别为0.0293、0.0093）,BAC组始终与KB组无差异（P值均>0.05）;QTc:AC 组在 5min、10min 时有差异（P 值分别为 0.0097、0.0255）,BAC组除20min时无差异（P=0.0593）其余各时点均有差异（P值分别为0.0080、0.0426、0.0200、0.0007、0.0007、0.0007、0.0413）。2)常规指标:CK:AC组、BAC组均有差异（P值分别为<0.0001、0.0097）;c-TNI:AC组、BAC组均有差异（P值分别为0.0043、0.0005）;LDH:AC组、BAC组均有差异（P值均<0.0001）。3)预警指标:SCN5A:AC组有差异（P=0.0126）、BAC组无差异（P=0.6407）;CX40:AC 组有差异（P<0.0001）、BAC 组无差异（P=0.0828）;CX43:AC组、BAC组均有差异（P值分别为0.0011、0.0107）。4)其他指标:H-FABP:AC组、BAC组均有差异（P值均<0.0001）。药代动力学研究:AC血浆中达峰时间约在45min,BAC约为20min;AC与BAC药代动力学参数比较均存在明显差异,Cmax、Tmax、AUCO-t、AUMCO-t、MRTO-t的 P 值分别为<0.0001、0.0151、0.0013、0.0132、0.0177。小结1)AC较低浓度（0.03125%）即可引起H9C2心肌细胞毒性改变,引起大鼠毒性改变而不引起大鼠死亡的AC剂量为0.3mg/kg;2)BAC毒性剂量下心电图中心率可能无明显改变,需进一步结合QTc、常规心脏毒性指标（CK、LDH、从c-TNI）及缝隙通道相关指标（CX40、CX43、SCN5A）等指标综合考察;4)AC大鼠体内达峰时间在45min左右,BAC在20min左右,但24h时仍可检测到其成分的存在,说明其毒性是急性反应,但是在体内降解吸收需要一定时间;5)AC与BAC之间存在单向、不可逆的降解过程,及AC可以转化成BAC,但BAC不能转化成AC;且同等剂量给药,AC毒性强于BAC。第三部分 附子药材的实验研究目的围绕附子药材开展“不同批次、不同剂型、不同煎煮时间”的“毒性验证-毒性比较-毒性物质基础探索-毒性代谢特点研究”,探索附子最佳用药方案,构建一体化、全链条的附子心脏毒性研究及风险防控体系,并为临床用药提供参考。方法首先,从物质基础层面出发,采用UPLC检测技术对不同批次、不同剂型、不同煎煮时间的附子药材进行2种生物碱的定性定量分析,实验过程中涉及的技术与方法有:药液的制备与提取、药物的定性定量UPLC检测;其次,从毒性验证角度出发,对附子药材不同剂型、不同煎煮时间的心脏毒性进行了动物实验验证,实验过程涉及的技术方法有药物的制备、大鼠灌胃给药,大鼠眼眶从静脉取血、血样的储存与处理、样本ELISA检测等;最后,从毒性代谢特点出发,对不同剂型、不同煎煮时间的附子药材进行大鼠灌胃给药,以探索各附子给药组中2种生物碱在大鼠体内的代谢特点,实验过程涉及的技术方法有:药物的制备、大鼠灌胃给药,大鼠眼眶从静脉取血、血样的储存与处理、样本UPLC检测等。结果附子药材UPLC检测:构建线性方程:BAC:Y=3980x+489,r=0.9993;AC:Y=20600x+101,r=0.9992。附子粉末AC含量 125.78、534.94、314.34ng/g,BAC 含量 39.52、45.24、45.80;附子水煎 30min AC 含量 0.3056、0.26765、0.168ng/ml,BAC 含量 1796、1352、2516 ng/ml;附子水煎 120minAC 含量 0.3056、0.444、0.3532,BAC 含量 2360、2812、2212。动物实验:附子水煎剂按临床最大剂量的2倍给药,散剂按水煎剂的1/10给药,在此条件下开展的附子不同剂型、不同煎煮时间的毒性验证比较结果提示:1)ECG:心率:F0及FB组在90min、120min时有差异（P值均<0.05）,其余各时点均无差异（P值均>0.05）,FB组始终无差异;QTc:F0组各时点的QTc值与KB组比较,差异均无统计学意义（P值分别为0.0931、0.5877、0.0736、0.0649、0.1212、0.4848、0.3939、0.6277）;FA 组在 5min、10min、20min、30min、45min、60min、90min 的 QTc 值有差异（P 值分别为 0.0007、0.0047、0.0007、0.0007、0.0007、0.0007、0.0007）;FB 组在 5min、20min、30min、45min、60min、90min、120min等时点的QTc值有差异（P值分别为0.0293、0.0386、0.0143、0.0007、0.0007、0.0007、0.0413）。2)常规指标:CK:F0组、FA组有差异（P值分别为0.0013、0.0104）,FB组无差异（P=0.2824）;c-TNI:F0 组、FA 组有差异（P 值分别为 0.0245、0.0266）,FB 组无差异（P=0.0813）,LDH:F0组、FA组有差异（P值分别为0.0245、0.0266）,FB组无差异（P=0.0813）。3)预警指标:SCN5A:F0组有差异（P=0.0395）,FA、FB组均无差异（P均>0.05）;CX40:F0、FA组有差异（P值分别为0.0088、0.0050）,FB组无差异（P=0.1091）;CX43:F0、FA 组有差异（P 值分别为 0.0280、0.0111）,FB组无差异（P=0.1535）。药代动力学:构建线性方程:BAC:Y=0.85x-0.00127,r=0.9978;AC:Y=2.14x+0.0909,r=0.9993。附子各给药组均大鼠体内AC含量均在定量下限以下,F0组、FB组可检测到BAC含量,FA组BAC含量亦在定量下限以下。比较各组（F0组VS FA组、FA组VS FB组、F0组VS FB组）AC药代动力学参数,Cmax、Tmax、AUC0-t、AUMC0-t、MRT0-t 的 P 值分别为（0.5333,0.7032,0.1905）、（0.2000,0.5317,0.0952）、（0.5000,0.7302,0.0530）、（>0.9999,0.7032,>0.9999）、（0.5333,0.5000,0.1905）、（0.2667,0.5317,0.0952）,各组参数的差异比较均无统计学意义（P值均>0.05）。比较各组（F0组VSFA组、FA组VSFB组、F0组VSFB组）BAC药代动力学参数,Cmax、Tmax、AUC0-t、AUMC0-t、MRT0-t 的 P 值分别为（0.2222,0.3333,0.6200）、（0.5000,>0.9999,0.1981）、（0.5000,0.6667,0.0530）、（0.5000,0.5000,0.0379※）、（0.8889,0.3333,0.0262※）,各组参数的差异比较有无统计学意义的有FO组VSFB组的AUMCO-t、MRTO-t比较（P值均>0.05）,其余各组参数的差异比较均无统计学意义（P值均>0.05）。小结1)不同批次间附子中生物碱含量存在差异,经过煎煮30min可有效缩小差异,控制附子中生物碱含量;2)附子中的毒性生物碱不仅仅是以乌头碱为代表的双酯型生物碱,以苯甲酰乌头原碱为代表的单酯型生物碱亦存在毒性;3)正常煎煮可控制附子药材中双酯型生物碱（乌头碱）含量,但是不能降低其毒性,其毒性可能与其单酯型生物碱成分有关,在临床使用中仍需要久煎。第四部分 附子复方的临床研究目的从附子复方层面出发,开展附子含附子制剂的临床安全性观察研究,综合阐述附子经过炮制及现代制药工艺处理后其临床安全性。方法采用单中心、开放、单次给药的研究设计开展含附子制剂的临床安全性观察研究。结果研究纳入健康受试者8人,男女各半,进行含附子制剂25g 口服给药,观察药前 30min、药后 30min、1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h、96h、120h 生命体征（体温、心率、呼吸、血压）,给药后各时间点较给药前差异无明显统计学意义（P值均>0.05）;心电图:24h内各时点动态心电图指标无明显差异,24h内各时点的PR间期、QRS间期、QT间期、QTC间期较给药前的P值分别为 0.0781、0.5528、0.1406、0.1563、0.1096。1-5d PR 间期、QRS 间期、QT间期、QTC间期较给药前的P值分别为:PR间期:0.4453、0.4844、0.1250、0.4219、0.7422;QRS 间期:>0.9999、0.5859、0.4375、0.0625、0.2188;QT 间期:0.6406、0.1953、0.1719、0.5703、0.0156*;QTC 间期:0.6875、0.7969、0.5469、0.3516、0.0625。心脏损伤标志物:与给药前相比,CTNT的P值分别为>0.9999、0.5000、>0.9999;Pro-BNP 的 P 值分别为 0.7422、0.5469、>0.9999,均无统计学意义。小结试验所选含附子制剂是经过严格炮制制作的复方中成药膏,在临床安全剂量下使用,未发现引起相关实验室检查及毒性指标的异常改变,经过适当的炮制加工可有效控制附子毒性,所以临床实际用药中,需控制用药剂量,进行必要的加工和炮制,还要考虑合适的疗程和人体个体差异等情况。结论1)附子安全性评价体系构建:应用“成分-通路-靶点-临床评价指标”一体化、全链条的研究策略开展了对附子从“生物碱单体-药材-复方”的“毒性体内外验证-毒性物质基础-毒性代谢特点”研究,构建了有毒中药的安全性评价体系,并探索性应用于附子心脏毒性的研究中;2)附子心脏毒性的机制探索及早期预警:缝隙连接通道是位于心肌细胞上负责信息交换及电耦联的重要通路,在附子心脏毒性机制中发挥着重要作用,研究提示可能存在早期预警的敏感性指标,对于构建和完善附子心脏毒性的风险防控体系具有一定的参考价值;3)附子心脏毒性的风险防控:从附子“生物碱单体-药材-复方”层面以明确其“毒性物质基础-毒性机制-毒性代谢特点”,从各个环节层层把控其毒性,做到未病时先防,已病则应早发现、早治疗以防病变。
张维山[2]（2019）在《TDCPP减轻H2O2和缺氧/复氧所致心肌细胞损伤机制的研究》文中研究说明心肌缺血/再灌注（ischemia reperfusion,IR）损伤是指心肌缺血后恢复血供,出现比再灌注前更明显、更严重的损伤和功能障碍。心肌IR损伤是冠状动脉搭桥术、心脏体外循环、大血管外科手术等临床治疗过程中的主要并发症。IR产生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）和Ca2+超载,是目前公认最常见心肌氧化应激损伤（oxidative stress injury）的致病因子,心肌细胞表达Ca2+库操控Ca2+内流（Store-Operated Calcium Entry,SOCE）通道,但其在心肌IR损伤中所发挥的作用及机制尚缺乏深入的研究。磷酸三（2,3-二氯丙基）酯[Tri（2,3-dichloropropyl）phosphate,TDCPP]为应用广泛的有机磷阻燃剂。毒理学研究发现TDCPP具有内分泌干扰毒性、生殖发育毒性、神经毒性和潜在的致癌性。David.W.Killilea等研究显示其毒性效应具有浓度依赖性,在正常生理状态下,低浓度的TDCPP仅引起细胞周期阻滞,抑制细胞生长（IC50为27μM）,只有高浓度的TDCPP引起细胞活力降低（IC50为171μM）和细胞的毒性效应（IC50为168μM）;但在病理状态下,研究发现低浓度的TDCPP亦可发挥保护性作用。Armstrong等（个人通讯）证实TDCPP能抑制thapsigargin诱导的Ca2+内流,具有直接阻断SOCE通道的功能。自噬是一种保守的细胞内成分自我降解过程,可通过溶酶体依赖途径降解细胞内长寿蛋白和受损的细胞器,从而维持细胞稳态。自噬在IR引起的心肌细胞损伤中发挥重要作用。ROS可以激活心肌细胞自噬,在缺血阶段,自噬可降解受损的细胞器,实现能量的再利用,发挥保护性作用;再灌注发生时,自噬过度激活,引起自噬性细胞死亡,加重心肌细胞损伤。TDCPP对H2O2导致的心肌细胞自噬的影响还未见报道。我们研究了自噬和凋亡两种现象,TDCPP对H2O2导致的心肌细胞自噬未见报道,而且TDCPP对H/R及H2O2引起的心肌细胞凋亡也未见报道。本实验旨在研究TDCPP预处理对H2O2和缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）所致心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及初步机制探讨。本研究发现:（1）TDCPP预处理能缓解H/R和H2O2处理的心肌细胞的形态学变化,明显减少H2O2处理组细胞LDH释放水平,降低细胞内ROS和MDA水平,增加H/R和H2O2心肌细胞活力;（2）TDCPP降低心肌细胞毒胡萝卜素（Thapsigargin,Tg）诱发的Ca2+内流,缓解H/R和H2O2诱导的心肌细胞Ca2+超载;（3）H/R和H2O2均诱导心肌细胞Stim1和TRPC6的表达,TDCPP预处理可部分阻断该效应;（4）TDCPP可部分恢复H/R处理心肌细胞线粒体膜电位,保护线粒体功能,减少心肌细胞凋亡;（5）H/R和H2O2诱导的心肌细胞BAX、CC3促凋亡因子表达增加,抑凋亡因子Bcl-2表达减少,BAX/Bcl-2比率增加,TDCPP预处理能部分逆转上述改变;（6）TDCPP抑制H2O2诱导的心肌细胞自噬（阻断H2O2诱导LC3-II增加）;（7）H/R和H2O2均降低心肌细胞AKT（ser473）和GSK-3β（ser-9）磷酸化,TDCPP预处理可部分逆转上述效应,进一步发现PI3K抑制剂LY294002能够部分解除TDCPP预处理后的逆转效应,TDCPP的保护效应消失。本项研究显示:TDCPP抑制心肌细胞SOCE通道,减轻H/R和H2O2诱导的心肌细胞钙超载,减轻H/R和H2O2诱导的心肌细胞凋亡和H2O2诱导的自噬,TDCPP对H/R和H2O2心肌细胞保护依赖PI3K-AKT-GSK3β信号途径。
郭建路[3]（2019）在《CaN/NFAT3介导线粒体乙醛脱氢酶2对高糖诱导的心肌损伤保护作用及机制研究》文中研究说明目的:探讨CaN/NFAT3信号通路是否介导线粒体乙醛脱氢酶2对糖尿病大鼠心肌损伤保护作用及可能分子机制方法:无菌条件下取出生3天内SD大鼠乳鼠心脏,心尖部剪碎并用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ混合酶消化成单个细胞,经差速贴壁后并在培养液中加入5-Brdu进行原代培养,当其生长呈融合状态时对心室肌细胞进行处理。应用免疫荧光检测培养的乳鼠心肌细胞内α-SA蛋白以此鉴定原代培养心室肌细胞纯度;实验涉及如下分组:5.5mmol/L糖对照组（M）、30mmol/L高糖组（MH）、30mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂（Alda-1）组（MHA）、30mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2抑制剂（Daidzin）组（MHD）、30mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂（Alda-1）和抑制剂（Daidzin）组（MHAD）、30mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂（Alda-1）和NFAT3抑制剂（11R-VIVIT）组（MHAV）;CCK8试剂盒测量NFAT3抑制剂最佳使用浓度;荧光探针检测细胞内钙离子浓度;ELISA测定细胞内CaN含量;免疫荧光检测细胞内CaNAβ含量;Western blot检测ALDH2、CaN、NFAT3蛋白表达;CCK8检测各组细胞活性;羟脯胺酸试剂盒检测细胞培养上清液羟脯胺酸含量;DHE探针检测各组细胞内氧化应激水平。结果:1.心肌细胞鉴定结果:通过差速贴壁结合5-Brdu得到纯度较高的心肌细胞,并且通过对特异性表达于心肌细胞和骨骼肌细胞中α-横纹肌肌动蛋白进行免疫荧光染色后,心肌α-SA抗原免疫荧光呈阳性反应,为绿色,位于细胞浆内,DAPI细胞核染色为蓝色。2.NFAT3抑制剂最佳使用浓度:根据实验结果显示出随着NFAT3抑制剂11R-VIVIT浓度增加,细胞活性也随之增加,当药物浓度达到2uM时,细胞活性达到最高（P<0.01）,且再增加药物使用浓度,细胞活性反而降低。3.心肌细胞内钙离子浓度:与M组相比,MH组Ca2+浓度均增高（P<0.01）;与MH组相比,MHA组Ca2+浓度降低（P<0.05）,MHD组Ca2+浓度升高（P<0.01）,而MHAD组Ca2+浓度相对于MHD组有所降低。4.心肌细胞内CaN含量:与M组相比,MH组细胞内CaN含量显着升高（P<0.01）;与MH组相比,MHA组细胞内CaN含量降低（P<0.01）,MHD组细胞内CaN含量升高（P<0.05）;与MHD组相比,MHAD组细胞内CaN明显降低（P<0.01）;5.心肌细胞内CaNAβ含量:心肌细胞内CaNAβ含量在正常组M组中最低;与M组相比,心肌细胞内CaNAβ含量在MH组、MHD组、MHAD组显着升高（P<0.01）;与MH组相比,心肌细胞内CaNAβ含量在MHA组显着减低（P<0.01）;相比于MHA组,心肌细胞内CaNAβ含量在MHAD组再次升高（P<0.01）;而相比于MH组,心肌细胞内CaNAβ含量在MHD组显着升高。6.心肌细胞内ALDH2、CaN、NFAT3蛋白表达:与M组相比,MH组ALDH2蛋白表达降低（P<0.05）,CaN蛋白表达增高（P<0.05）、NFAT3蛋白表达增高（P<0.01）;与MH组相比,MHA组CaN蛋白和NFAT3蛋白表达降低（P<0.05）、ALDH2蛋白表达增加（P<0.05）;与MHA组相比,MHAV组的ALDH2蛋白表达量无明显变化（P>0.05）,NFAT3蛋白表达量降低（P<0.05）。7.心肌细胞活性:心肌细胞活性在MH、MHAD、MHD组较M组活性明显降低（P<0.01）;与MH组相比,MHA组细胞活性升高（P<0.05）,MHV组中心肌细胞活性也明显增高（P<0.05）;与MHAD组相比,MHD组心肌细胞活性显着降低（P<0.05）。8.心肌细胞培养上清液羟脯胺酸含量:与M组相比,MH组心肌细胞培养上清液中羟脯胺酸含量明显增高;与MH组相比,MHA和MHA组中心肌细胞培养上清液中羟脯胺酸含量显着减少,而在MHD组中羟脯胺酸含量则明显增加;与MHA组相比,MHAD在中羟脯胺酸含量明显增高（P<0.01）。9.心肌细胞内氧化应激水平:与正常组相比,MH组中DHE荧光密度显着增加;与MH组相比,荧光密度在MHA和MHV组则明显减小,而在MHD组则进一步增大;与MHD组比较,MHAD组荧光密度则显着减少（P<0.01）。结论:1.激动线粒体ALDH2可提高心肌细胞活力、减弱心肌细胞内氧化应激及羟脯胺酸水平;2.抑制CaN/NFAT3信号通路后,线粒体ALDH2的表达无明显影响,心肌细胞活力增加,心肌细胞内氧化应激及羟脯胺酸水平减弱;3.线粒体ALDH2对高糖诱导的乳鼠心肌细胞起保护作用,其机制可能与ALDH2对Ca2+-CaN-NFAT3信号通路的负调节作用有关。
乔娜[4]（2018）在《TRPC对腹水综合征肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响》文中进行了进一步梳理肉鸡肺动脉高压综合征（pulmonary hypertension syndrome,PHS）又叫做肉鸡腹水综合征（ascites syndrome,AS）,是一种由多种因素共同作用所产生的营养代谢病,其主要危害生长较快的肉鸡。肺血管重构和肺血管收缩反应增强是PHS主要的两个病理变化。肺动脉所产生的这种病理变化与肺动脉平滑肌细胞的异常增殖密切相关。规范瞬时受体电位离子通道（canonical transient receptor potential channel,TRPC）是细胞膜上钙离子内流的主要通道,与细胞的程序性死亡、转录因子的活化和细胞增殖密切相关。目前虽在哺乳动物身上发现TRPC与肺动脉平滑肌细胞的异常增殖密切相关,但其在PHS肉鸡肺动脉病理变化中的作用尚未见报道。本研究从肺动脉平滑肌细胞中TRPC诱导的钙离子内流对肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡的作用入手,进一步研究PHS的发病机制,为防治肉鸡PHS提供新的思路以及理论支持。在体内实验部分,将20日龄的肉鸡随机分为对照组（n=30）和实验组（n=90）,实验组肉鸡静脉注射浓度为0.02g/mL的离子交换纤维素颗粒0.3 mL,对照组注射等体积的生理盐水。在42日龄时进行采样,并测量肉鸡腹水发生的相关指标变化和肺血管张力。同时,检测肺组织和肺动脉中TRPC1、TRPC4和TRPC6 mRNA的表达情况,并使用免疫组化检测TRPC6在肉鸡肺组织中的分布情况。结果发现实验组肉鸡的右心室与全心室重量比,红细胞压积,血清中的谷草转氨酶和三磷酸激酶均极显着升高（P<0.01）。实验组肉鸡肺血管弹性极显着下降（P<0.01）,对钙离子阻断剂的敏感性下降,且实验组肉鸡的肺组织和心肌都出现了明显的病理变化。实验组肉鸡心肌中游离钙离子浓度极显着提升（P<0.01）。在肺动脉中TRPC1 mRNA的表达量显着降低（P<0.05）,但TRPC4和TRPC6 mRNA表达显着升高（P<0.05）。在肺组织中TRPC1mRNA表达量显着降低（P<0.05）,TRPC4 mRNA表达量显着升高（P<0.05）。免疫组化结果显示TRPC6在实验组肉鸡肺动脉上表达增多。在体外实验部分,使用II型胶原酶消化法培养原代PASMCs,分别在常氧和缺氧的条件下处理细胞,并使用TRPC6抑制剂SKF96365和阻断剂氟芬那酸（Flufenamic acid,FFA）处理细胞,检测细胞活力,细胞TRPC1、TRPC4和TRPC6 mRNA表达的影响,并使用流式细胞仪检测细胞内游离钙离子浓度、细胞周期和细胞凋亡的情况。结果发现,在缺氧24h时PASMCs细胞活力,细胞中TRPC1、TRPC4和TRPC6 mRNA表达量没有明显变化（P>0.05）;而在缺氧48 h时细胞活力,细胞中TRPC1、TRPC4和TRPC6 mRNA表达量均显着升高（P<0.05）,但G1期的细胞比例显着下降（P<0.05）,S期细胞比例极显着上升（P<0.01）。同时,缺氧48 h时,总的细胞凋亡和早期凋亡的细胞比例极显着下降（P<0.01）。而在使用TRPC6的抑制剂SKF96365处理缺氧的PASMCs 24h后,与缺氧PASMCs相比,TRPC6 mRNA表达量、细胞活力、细胞内游离钙离子浓度均显着下降（P<0.01）,但是细胞在G1期的比例显着上升（P<0.05）。而在使用TRPC6的激活剂FFA处理24h后,与缺氧PASMCs相比,细胞活力、细胞内游离钙离子浓度、细胞内TRPC6 mRNA的表达量均显着升高（P<0.05）,且细胞凋亡细胞比例及细胞在S期和G2期的比例显着上升（P<0.01）。但是SKF96365和FFA处理缺氧PASMCs 48h后,与缺氧PASMCs相比,细胞周期以及细胞凋亡未发生明显变化（P>0.05）。结果表明,PHS肉鸡血管弹性变差,TRPC参与了PHS肉鸡肺组织和肺动脉的病理变化,且缺氧PASMCs的异常增殖以及凋亡减少与TRPC密切相关。
戴柳玲[5]（2015）在《丹参红花有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元的保护作用研究》文中指出目的观察丹参红花（丹红）有效成分（丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、羟基红花黄色素A）配伍对原代培养的乳鼠海马神经元细胞缺氧损伤的保护作用,并初步探讨丹红有效成分配伍对原代培养乳鼠海马神经元细胞缺氧损伤的保护机制,进一步研究其配伍规律,阐述中药配伍规律的科学性。方法1.以原代培养的乳鼠海马神经细胞为研究对象,建立海马神经元细胞缺氧损伤模型。2.MTT法确定丹红有效成分、尼莫地平、阿司匹林对海马神经元细胞的非毒性剂量;选取合适浓度分组:正常组、模型组、阳性对照组及丹红四个有效成分组成的9个配伍组。3.化学比色法测定神经细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）含量、TBA法测定神经细胞内丙二醛（MDA）水平以及黄嘌呤氧化酶法测定胞内总超氧化物歧化酶（T-SOD）的活性的变化。4.ELISA法测定神经细胞内6酮前列腺素F1a(（6-keto-PGF1a）和血栓素B2（TXB2）水平的变化5.激光共聚焦技术测定神经元细胞内线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）和胞内游离钙离子浓度（[Ca2+]i）的变化、流式细胞仪检测神经元细胞的早期凋亡率。结果1.乳鼠海马神经元离体培养8d后,神经细胞清晰可见,多呈锥体状或多级形,胞体有明显的折光性,立体感强,细胞膜边界光滑、清楚,神经突起相互交错成网。用NSE免疫组织化学染色法鉴定海马神经元细胞,神经元细胞占比大于90%。2.药物毒性实验:通过MTT实验确定丹红各有效成分对海马神经元的最佳浓度梯度（丹参素 50、100、150μg/mL;原儿茶醛 60、120、180μg/mL,丹酚酸 B50、100、150μg/mL;羟基红花黄色素A40、80、120μg/mL）,按高中低浓度正交配伍。尼莫地平浓度100μg/mL、阿司匹林200μg/mL作为阳性对照。3.抗氧化损伤:配伍1～3、5～9组组方能显着抑制上清液LDH含量;配伍1、2、3、4、8、9组组方能明显增强SOD活性;配伍1、2、3、7、8、9组组方能显着降低MDA水平。正交设计直观分析丹参素和原儿茶醛的抗氧化作用最强。4.抗血栓形成:配伍1、2、3、4、5、6组组方能显着升高6-keto-PGF1a的水平;配伍7、8组组方能显着降低TXB2的水平。正交设计直观分析和方差分析可知,可能丹参素的抗血栓作用最强。5.抗凋亡损伤:配伍1～3、5～9组组方能显着升高MMP水平;配伍1～3、5～9组组方能明显抑制胞内钙超载现象;1～4、6～9组组方能显着抑制细胞早期凋亡。正交设计直观分析可知,原儿茶醛的抗凋亡作用最强。结论1.本实验成功培养原代海马神经元细胞并体外建立缺氧损伤模型2.丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元具有保护作用。3.丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元细胞的保护作用机制可能与抑制氧化应激损伤、抗血栓形成、减轻胞内钙超载和抑制细胞凋亡有关。
陈振振[6]（2014）在《醒脑静中芳香开窍药促进栀子有效成分经鼻入脑转运机制研究》文中指出目的:由于血脑屏障的存在,药物经常规途径如口服给药后在脑内的浓度较低,限制了对脑部疾病的治疗。鼻腔在生理解剖上与脑具有天然的联系,使鼻腔给药成为有效治疗脑部疾病的一种潜在新途径。在很多情况下可以作为注射给药的替代途径,非常适用于急救、自救。目前,常用的鼻腔制剂评价模型多采用牛、羊、猪等大型动物的鼻腔黏膜,均存在一定的种属差异性,且所需给药剂量较大,因而不适用于药物的早期筛选。细胞模型可以从细胞、分子水平评估药物的黏膜渗透特点,适用于药物有效成分的吸收,特别是中药复方制剂的吸收机制研究。因此,本论文建立了原代人鼻黏膜上皮细胞和血脑屏障细胞模型,对醒脑静处方中芳香开窍药促进水溶性成分栀子苷经鼻入脑的转运方式及其作用机制进行了研究。方法:选用醒脑静处方中的水溶性有效成分栀子苷为指标,以原代人鼻黏膜上皮细胞模型研究栀子苷及其复方配伍在鼻-脑通路的转运;以MDCK、MDCK-MDR1细胞系研究栀子苷及其复方配伍经鼻入血,跨血脑屏障入脑的转运过程。通过分子生物学技术,如细胞紧密连接蛋白分布、细胞膜流动性、Na+/K+-ATP酶活性、细胞膜电位和细胞内钙离子等,研究方中开窍药艾片、麝香促进栀子提取物经鼻入脑转运的作用机制。鼻黏膜吸收促进剂被认为普遍存在黏膜毒性,芳香开窍药具有较强的脂溶性,多具辛香走窜之性,因此在研究其促进药物吸收的同时,选用黏蛋白基因（MUC5AC、5B和8 mRNAs）和炎症细胞因子IL-8 mRNA为指标,对其可能引起的毒性反应进行研究。结果:（1）鼻黏膜上皮细胞和血脑屏障细胞模型的建立。我们采用酶消化法分离得到鼻黏膜上皮细胞,使用改良的消化法,得到大量的鼻黏膜单细胞和许多鼻黏膜组织小碎片,先将其进行常规传代培养,在得到一定数量细胞后,再以特异性免疫磁珠法,对目的细胞（鼻黏膜上皮细胞）进行纯化,最终可以得到99%以上纯度细胞。经过筛选得到含有细胞添加因子培养基,BEGM和BEGM:DMEM/F12（1:1）培养基有对HNEC细胞生长有明显促进作用。扫描电镜观察所获得的鼻黏膜上皮细胞纤毛分化良好,形态和功能与体内类似,且操作简便、高效、重复性好。实验建立了较为稳定的MDCK、MDCK-MDR1细胞培养和传代方法,细胞间连接紧密,彼此相嵌排列,透明度较高,折光性强,细胞生长状态良好。（2）醒脑静所含药物的细胞毒性实验。栀子苷在0-400 μg·mL-1、艾片在0-200 μg·mL-1、麝香酮在0-40 μg·mL-1、艾片与栀子苷配伍组（栀子苷:艾片=0.9:1）以艾片量计在0-150 μg·mL-1、麝香酮与栀子苷配伍组（栀子苷:麝香酮=6:1）以麝香酮量计在0-30μg·mL-1、艾片麝香酮栀子苷配伍组（栀子苷:艾片:麝香酮=0.9:1:0.15）以艾片量计在0-150 μg·mL-1浓度范围内对HNEC、MDCK、及MDCK-MDR1细胞均没有毒性。在相同药物浓度条件下,栀子苷的细胞毒性明显小于艾片和麝香酮,三者中麝香酮的毒性最大。（3）栀子苷单独及其与开窍药配伍后的单层细胞跨膜转运实验研究。不同浓度的栀子苷（25、50、100 μg·mL-1）在HNEC、MDCK、MDCK-MDR1单层细胞模型上吸收和外排速率相比较无显着性差异,栀子苷的吸收速率不受药物浓度的影响,同时外排率Re均小于2,提示栀子苷的跨膜转运方式为被动扩散,无主动转运过程。栀子苷在HNEC吸收和外排方向的表观渗透系数在1 ×106cm·s-1至10×10-6 cm·s-1范围内,具有中等透过吸收速率;在MDCK、MDCK-MDR1单层细胞模型上吸收和外排方向的表观渗透系数均小于1×10-6 cm·s-1,较难透过细胞膜,与栀子苷水溶性性质相符,在三种单层细胞模型上吸收和外排的途径,主要通过细胞间隙孔道进行转运。按照醒脑静处方组成,与开窍药艾片、麝香酮配伍后,栀子苷的转运速率较单独给药有所增大,高剂量配伍具有显着性差异。（4）栀子苷配伍开窍药在单层细胞模型跨膜转运的作用机理研究。艾片、麝香酮可以使给药部位细胞间的紧密连接暂时疏松,加速药物通过。它们主要可以引起骨架蛋白actin结构的改变,细胞膜及胞核周边肌动蛋白丝带模糊、部分断裂,细胞间连接松散,出现细胞间裂隙,促进栀子苷经细胞旁路吸收;还可以作用于细胞膜的脂质,增加细胞膜脂质的流动性,降低膜的黏度,从而增加栀子苷穿细胞途径的转运吸收。艾片、麝香酮可以使细胞膜电位去极化程度增加,进而可以降低细胞膜的黏滞性,提高细胞膜流动性,增强物质通透性;此外,还可以调节细胞内钙离子浓度促进细胞收缩并相互分离,促进栀子苷经细胞旁路转运吸收。栀子苷的跨膜转运不消耗ATP能量,艾片、麝香酮能够提高Na+,K+-ATP ase、Ca2+-ATP ase活性,提示其可能对于一些主动载体转运的药物具有促进吸收作用。（5）栀子苷配伍艾片、麝香酮作用HNEC细胞24h后,可以引起细胞中MUC5AC、MUC5B和MUC8 mRNA表达量的增加,随着药物剂量的增加表现出作用增强的趋势,配伍高剂量组的表达量是对照组的2-4倍;艾片、麝香酮对炎症细胞因子IL-8 mRNA表达量也具有增加作用,配伍高剂量组是对照组的2-2.5倍。我们采用Elisa法测定了栀子苷配伍艾片、麝香酮作用HNEC细胞24 h后上清液中黏蛋白和细胞因子的表达,结果与PCR一致。可以得出,艾片、麝香酮可能引起正常鼻腔黏蛋白的分泌增加,并导致炎症因子释放增加,引起一定的炎症反应,提示其对鼻黏膜具有一定的刺激性,且麝香酮的刺激作用较艾片强。结论:艾片麝香酮具有芳香开窍作用,其作用机制可能与打开细胞紧密连接、增强细胞膜的流动性和Na+,K+-ATP酶,Ca2+-ATP酶活性、降低细胞膜电位以及调节细胞内钙离子浓度等有关。艾片、麝香酮对鼻黏膜具有一定的刺激性,要注意控制给药浓度和选择合适的药物剂型。
王雨薇[7]（2014）在《当归挥发油对血管紧张素Ⅱ所致心肌细胞肥大CaN通路及T通道的影响》文中提出目的：观察当归挥发油（Angelicanaphtha，AN）对血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）诱导的肥大心肌细胞CaN通路及T型钙离子通道的影响，探讨当归挥发油抑制AngⅡ诱导心肌细胞肥大的作用及其机制。方法：选择H9c2心肌细胞株，将细胞浓度调整到1×106cells/mL，37℃、5%CO2培养箱中培养72h。用10-4mg·L-1血管紧张素Ⅱ作用于心肌细胞24h成功建立心肌细胞肥大模型。应用超临界萃取装置提取当归挥发油。实验分为5组：空白对照组；模型组；低剂量（5mg·L-1）组、中剂量（10mg·L-1）组、高剂量（20mg·L-1）组。MTT法检测心肌细胞活力的改变；激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位和细胞内钙离子浓度，用试剂盒检测的活性及表达变化、用western blot检测CaN蛋白、T型钙离子通道相关基因蛋白Cav3.1（CACNA1G）、Cav3.2（CACNA1H）以及凋亡蛋白caspase-3、caspase-12的表达情况。结果：1.MTT法检测心肌细胞存活率：血管紧张素Ⅱ造模后心肌细胞存活率明显增加，与对照组比较，差异有显着性（P＜0.05）。与血管紧张素Ⅱ组相比，当归挥发油干预组心肌细胞的细胞存活率均有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。2.激光共聚焦检测细胞内钙离子浓度：与空白组相比，模型组Ca2+平均荧光强度明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，当归挥发油干预组Ca2+平均荧光强度明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。3.激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位，与空白组相比，模型组AngⅡ（浓度10-4mg·L-1）细胞体积增大，平均荧光强度明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，当归挥发油干预组细胞体积缩小，线粒体数目减少，荧光强度明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。4.流式细胞术检测细胞周期，与空白组相比，模型组G2期细胞增多，差异具有显着性（P＜0.05）；与模型组相比，当归挥发油干预组的G2期细胞有所减少，差异统计学意义（P＜0.05）。5.Western Blot检测CaN蛋白、Cav3.1（CACNA1G）、Cav3.2（CACNA1H）蛋白的表达情况：AngⅡ组与空白组比较，CaN、Cav3.1、Cav3.2表达增高，caspase-3和caspase-12凋亡相关蛋白表达增高，差异具有统计学意义（P＜0.05），与模型组比较，当归挥发油干预组CaN、Cav3.1、Cav3.2及caspase-3、caspase-12表达水平降低，差异具有显着性（P＜0.05）。结论：1．当归挥发油可通过钙离子阻滞作用和抑制心肌细胞凋亡来治疗心肌细胞肥大。2．本研究从微观上证实了当归挥发油为“血中气药”和中医的气血理论。
秦瑶[8]（2011）在《CaMKⅡδ对心房肌细胞钙离子流影响的研究》文中进行了进一步梳理研究背景钙离子是一种细胞内重要的电荷载流子,同时作为一种普遍的介质参与各种细胞过程。在心肌细胞里,这些过程包括基因转录、兴奋-收缩耦联及凋亡。众所周知,细胞内钙离子传递电信号到机械活动,造成单个心肌细胞的短缩进而整个心脏的收缩。然而,近期的研究结果越来越多的证据显示细胞内钙超载会导致许多心脏疾病,如心肌病、心功能不全和心律失常。钙/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它可以磷酸化细胞内的许多种蛋白,从而使得细胞内的钙离子浓度提高。CaMKⅡ在正常的心肌细胞以及病理状态下的心肌细胞里的钙循环都起着重要的调控作用。而且,近期证实,CaMKⅡ有可能成为一个针对心脏疾病治疗的潜在药物靶标。许多报道证实在心肌肥厚、心力衰竭和心律失常的病例中,CaMKⅡ的活性增加、表达上调。在心脏疾病中,CaMKⅡ蛋白的含量和活性程度会随着离子通道的高表达而得到激活和提高。CaMKⅡ有四种亚型α、β、γ及δ,其中δ亚型是CaMKⅡ在心脏最主要的表型。心肌细胞的动作电位有一个独特的以平台期为特征的延长的除极电位,它的形成主要是钙离子内流与钾离子外流动态平衡的结果。在很多心脏疾病中心肌细胞的电活动的改变是由于钙信号蛋白的重塑和其它离子通道蛋白的改变而发生的。CaMKⅡ是一种广为人知的调控细胞内钙离子迁移的频率和幅度的蛋白激酶,能被细胞CaMKⅡ内较高浓度的钙离子激活,比如当心率加快时,细胞内钙增加,激活CaMKⅡ,活化后的CaMKⅡ可以磷酸化许多种丝氨酸/苏氨酸钙调控蛋白,诸如L型钙离子通道（LTCC）、软诺丁受体（RyR2）、基质网钙离子受体2a抑制蛋白（PLN）。心肌细胞内CaMKⅡ通过调控细胞内钙离子浓度而改变动作电位的时程,因此,CaMKⅡ被认为可能与增加心律失常的发生机会有关。但其中的机制还在不断探求中。心房纤颤（房颤）是一种临床上最为常见的心律失常,它的发生伴随着血栓栓塞事件的增加和住院率的增加等危害,具有较多的致死率和致残率。心房纤颤发生的潜在电生理机制是快速的异位触发心律和折返机制,而究其发生主要是由于延长的动作电位时程及决定于心肌细胞减慢的电传导和/或缩短的心房肌细胞不应期。临床上,在心房纤颤的患者的心房肌细胞里,发现存在有异常增高的细胞内钙蓄积,并且研究证实心肌细胞内钙超载,在心律失常的发生中起着关键的作用。同时,在房颤患者的心房肌细胞里也发现有CaMKⅡ的异常高表达。最近,更多的研究者在关注CaMKⅡ与各种心律失常的联系机制,但更多的试验正在涉及到确认是否心房纤颤的发生及维持与CaMKⅡ直接相关。给予培养的原代心房肌细胞以快速的电场刺激,被用来模拟在体外心房纤颤的细胞微环境,且电场刺激被证实通过缩短动作电位时程致易于发生房颤使得心房肌发生电重构。但在这一过程中CaMKⅡ的功能及作用还未被明确。我们设想增加心房肌细胞内CaMKⅡδ的表达量会影响到基质网的钙释放以及L型钙通道钙离子内流,而快速的电场刺激模拟增加的心率致细胞内钙短暂增加而激活CaMKⅡδ,从而改变细胞内钙离子稳态,致房颤的发生。本研究通过改变CaMKⅡδ表达量来探索其在电场刺激导致心肌细胞钙变化中的作用,可以为房颤的治疗提供一定的理论基础。实验方法病毒载体构建和病毒制备:大鼠CaMKⅡδ（NM012519）的cDNA从Open Biosystems购买（7939424）。开放阅读框通过PCR的方法连接到慢病毒载体LV-IRES-RFP中,得到质粒LV-CaMKⅡδ-IRES-RFP. CaMKⅡδ通过CMV启动子驱动表达。为了下调CaMKⅡδ表达,我们设计了三对siRNA,并且连入慢病毒载体,此载体中siRNA通过双向启动子表达。所有质粒都通过测序验证。慢病毒颗粒通过将包装质粒和病毒载体共转染293FT细胞获得,粗制的病毒液收集后超速离心可获得滴度108 TU/ml的病毒液,用于后继实验。原代心肌细胞培养和转染:从新生大鼠（1-2天）上快速分离心脏,再将心室分离并用0.125%胰酶和0.1%胶原酶I消化。收集单细胞悬液,按0.5～1×104/cm2的密度接种于6孔板或玻片上。48小时后,按MOI=10加入慢病毒。培养48小时后,将培养基换为新鲜DMEM,继续培养细胞待后继使用。心肌细胞电场刺激:培养的原代心肌细胞置于培养箱内,加上连续电场刺激24小时。电场由计算机控制,电波频率10Hz,电压1.5 V/cm。细胞钙检测:咖啡因刺激的钙流通过扫描共聚焦显微镜进行观察。L型钙离子通道电流通过膜片钳检测。挑选带有红色荧光的心肌细胞进行检测。为了消除细胞大小差异的影响,电流强度定义为电流密度除以细胞电容。结果成功构建了CaMKⅡδ基因的表达慢病毒载体,通过转染293FT细胞制备慢病毒,可以得到高滴度的病毒液,用此病毒转染原代心肌细胞,能够在细胞内获得较好的基因表达。另一方面设计了三条干扰序列,通过转染293FT细胞并用Western blot检测筛选出2#序列具有较好的干扰效率,将此序列构建到慢病毒载体中获得了干扰CaMKⅡδ的病毒载体。成功从新生大鼠心脏分离培养出原代心肌细胞,并通过免疫组化和免疫荧光鉴定培养的心肌细胞纯度可达到90%以上。将制备的慢病毒浓缩到108 TU/ml以上,按MOI=10转染原代心肌细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪检测感染率可以达到70%。而进一步通过western blot和qPCR检测过表达及干扰病毒的效果,发现过表达病毒转染的细胞CaMKⅡδ表达为对照病毒的两倍,而干扰病毒转染后,CaMKⅡδ表达约为对照病毒的50%。从而成功的在原代细胞中获得了CaMKⅡδ的过表达和干扰。对原代心肌细胞进行电场刺激后检测CaMKⅡδ变化,发现CaMKⅡδ的活性增加,但是表达量未发生变化。进一步检测过表达和干扰CaMKⅡδ的细胞,其表达量在电场刺激前后均未发生变化。在未刺激情况下,CaMKⅡδ的表达变化会导致内质网钙释放和L型钙流的变化。高表达细胞中,L钙流增加了约25%;而低表达细胞中,其下降了约28%。在电场刺激情况下,CaMKⅡδ表达依然导致了胞内钙的变化。L钙流在高表达细胞中增加了23%,而在低表达细胞中降低了26%。降低CaMKⅡδ表达量,可以将电刺激导致的钙流增强降低到正常水平。结论本研究主要结论:电场刺激导致原代心肌细胞内钙变化,此过程中CaMKⅡδ活性增加,但表达量未变化。通过过表达或RNA干扰改变CaMKⅡδ表达量,可以调节电场刺激导致的钙变化,从而改善电异常环境下的胞内钙。
丁翔[9]（2010）在《大鼠原代培养心房肌细胞钙超载模型建立及CaMKⅡ抑制剂KN93的干预作用研究》文中指出背景和目的心房颤动（简称为房颤）是最常见的心律失常之一,其中70岁以上人群发生率高达10%,已经成为威胁人类健康和生活质量的重要疾病之一。房颤能诱导心房发生以心房肌有效不应期（AERP）缩短为特征的电重构及心房肌结构发生适应性与非适应性改变引起的结构重构。“钙超载”是心肌细胞电重构的关键,也可能是房颤发生并持续的重要基础。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/ calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, CaMKⅡ）作为Ca2 +/CaM调节蛋白家族中的一个主要成员,其在细胞的病理生理过程中发挥重要的生物学作用。有研究表明房颤时CaMKⅡ蛋白含量明显增加,其中在左房增加更为明显,而且随着房颤时间的延长CaMKⅡ蛋白含量也逐渐增多。因此,探讨房颤、细胞钙超载和CaMKⅡ三者之间的关系可能有助阐明房颤的确切发病机理。本研究采用钙离子载体伊屋诺霉素（ionomycin）建立新生大鼠心房肌细胞的钙超载模型,在此基础上观察CaMKⅡ抑制剂KN93对新生大鼠心房肌细胞钙负荷的影响,并对细胞CaMKⅡ的变化进行检测,其目的旨在进一步探讨房颤的确切发病机理,并为今后研究CaMKⅡ抑制剂KN93防治房颤发生的可行性奠定实验基础。方法1.用酶消化法分离新生大鼠心房肌细胞并行原代培养。纯化培养96小时后随机分为对照组（C组）、实验组（E1,E2,E3组）,依次加入不同浓度ionomycin（0、0.5、1.0、2.0μmol/L）,以钙离子指示剂Fluo-3/AM负载心房肌细胞,激光扫描共聚焦显微镜检测心房肌细胞游离钙离子浓度（[Ca2+]i）,建立新生大鼠心房肌细胞不同程度钙超载模型。2.新生大鼠心房肌细胞原代培养96小时,应用钙离子导入剂ionomycin（1.0μmol/L）建立心房肌细胞钙超载模型,并在KN93三种浓度（0.25、0.5、1.0μmo/L）的干预下,以钙离子指示剂Fluo-3 /AM负载心房肌细胞,激光共聚焦显微镜观察心房肌细胞内游离钙的变化;并应用Western blot方法检测CaMKⅡ表达的变化。结果1.原代培养至第4天,细胞生长密度可以达到瓶底70%左右;免疫组织化学染色鉴定:90%以上培养细胞α-肌动蛋白抗体染色阳性。对照组心房肌细胞活性比率为（73.00士2.37）%,与各实验亚组间心房肌细胞活性相比无显着性差异（P>0.05）。经不同浓度ionomycin处理l h后,各实验亚组心房肌细胞[Ca2+]i明显增高,与对照组相比有显着性差异（431.54±20.97、705.87±28.34、1305.05±53.69 vs 257.08±18.63, P<0.05）,且各实验亚组间心房肌细胞[Ca2+]i水平随ionomycin浓度的增加而上升,亚组间差异显着（P<0.05）。光镜下形态学观察也表明,随ionomycin浓度的增加,荧光强度逐渐加强,呈浓度依赖性。2.与对照组比较,钙离子导入剂ionomycin明显增加细胞内钙离子荧光值（660.16士108.47 vs 376.12士57.57,p<0.01）;而KN93对细胞内钙离子荧光值无明显影响（389.00士64.01 vs 376.12士57.57,p>0.05）。预先加入三种不同浓度KN93（0.25、0.5、1.0μmo/L）可显着降低ionomycin导致的细胞内钙离子荧光强度的增加幅度（vs 660.16士108.47,p<0.01）,与对照组相比也有显着差异（vs 376.12士57.57,p<0.01）。钙超载组细胞CaMKⅡ表达明显增加,与对照组比较,p<0.01;而KN93对细胞CaMKⅡ表达影响不明显。不同浓度KN93（0.25、0.5、1.0μmo/L）预处理后,钙超载细胞CaMKⅡ的表达显着降低,与钙超载组比较,p<0.01。结论1.应用钙离子载体ionomycin能够建立可靠的心房肌细胞钙超载模型。2. CaMKⅡ抑制剂KN93可降低ionomycin引发的大鼠心房肌细胞钙超载,并下调钙超载细胞CaMKⅡ表达。
盛艳梅[10]（2010）在《基于“钙信号通路—血脑屏障”偶联的中药脑神经保护有效组分筛选方法研究》文中认为目的：选择临床抗脑缺血损伤疗效确切的中药（灯盏细辛、川芎、石菖蒲）,研究其化学组分的脑神经保护作用、钙信号通路调节作用以及透血脑屏障能力,揭示三者的关联性,探讨建立基于“钙信号通路-血脑屏障”偶联的中药脑神经保护有效组分筛选新方法的可行性。方法：1.采用MTT法测量药物对原代培养的大鼠大脑皮层神经细胞存活率的影响,筛选脑神经保护活性组分；2.采用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）技术检测活性组分对谷氨酸、KC1致体外培养的皮层神经细胞内钙荧光强度变化的影响,筛选出具有钙信号通路调节作用的活性组分；3.采用大鼠脑微血管内皮细胞、星型胶质细胞共培养技术,建立血脑屏障体外模型,结合HPLC技术检测活性组分的透血脑屏障程度；4.采用线栓法阻塞大脑中动脉（MCA）复制大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,进行整体动物的药效学验证。以行为观察、脑梗死比率、血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮合酶（N0S）等为指标,评价活性组分对脑缺血的保护作用。结果：1.灯盏细辛注射液、灯盏乙素、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、川芎挥发油、川芎嗪、阿魏酸、石菖蒲挥发油、α-细辛醚等在一定剂量范围内都能不同程度促进体外培养的皮层神经细胞存活。2.灯盏细辛注射液、3,5-二咖啡酰奎宁酸、川芎挥发油、川芎嗪、阿魏酸以及石菖蒲挥发油等都能抑制谷氨酸、KCl引起的神经细胞内钙超载。灯盏乙素、α-细辛醚只对谷氨酸引起的细胞内钙超载有抑制作用。3.灯盏细辛注射液、3,5-二咖啡酰奎宁酸、川芎挥发油、川芎嗪、石菖蒲挥发油、α-细辛醚均可透过BBBM,灯盏乙素不能透过BBBM。其结构修饰物灯盏乙素乙酯能透血脑屏障,且具有脑神经保护作用和钙信号通路调节作用。4.研究表明3,5-二咖啡酰奎宁酸、川芎挥发油可通过增加模型大鼠SOD、GSH-Px、NOS活性,降低MDA含量,发挥脑缺血保护作用。5.综合分析表明,灯盏细辛注射液、3,5-二咖啡酰奎宁酸、川芎挥发油、川芎嗪、石菖蒲挥发油、α-细辛醚等样品的钙信号通路调节作用与其脑神经保护作用密切相关,且透血脑屏障能力是影响其发挥抗脑缺血损伤作用的关键因素。结论：本研究结果提示药物的钙信号通路调节作用、透血脑屏障能力及脑神经保护作用与其抗脑缺血损伤作用之间存在很好的关联性,建立基于“钙信号通路-血脑屏障”偶联的中药脑神经保护有效组分筛选新方法具有可行性,为治疗脑缺血创新药物的研制提供了新思路。
二、心肌细胞原代培养系统的建立及比率荧光技术对细胞内游离钙离子浓度的测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、心肌细胞原代培养系统的建立及比率荧光技术对细胞内游离钙离子浓度的测定（论文提纲范文）
（1）基于缝隙连接通道的附子心脏毒性早期预警及风险防控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 图文摘要 |
| 中英文缩略语对照 |
| 前言 |
| 第一部分: 文献研究 |
| 第一章 附子不良反应的文献计量及关键词分析 |
| 1.文献来源及研究方法步骤 |
| 2.结果 |
| 3.分析与讨论 |
| 第二章 基于文献综述的附子心血管毒性研究进展 |
| 1.附子心血管毒性的研究背景 |
| 2.附子心血管毒性的毒性表现 |
| 3.附子的化学成分梳理 |
| 4.附子的心血管毒性的物质基础及作用机制 |
| 5.附子心血管毒性的评价方法 |
| 6.小结 |
| 第三章 附子心脏毒性缝隙连接通道基因生物调控进程研究 |
| 1.材料方法 |
| 2.结果 |
| 3.分析与讨论 |
| 第一部分 结语 |
| 第二部分: 附子生物碱的实验研究 |
| 第一章 细胞毒性验证研究: AC诱导大鼠H9C2心肌细胞损伤及缝隙连接通道的验证研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 第二章 动物毒性验证研究: 附子2种生物碱成分的毒性观察及基于缝隙连接通道机制的验证研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 第三章 毒性代谢特点研究: 基于UPLC-MS/MS的大鼠单次灌胃给药后附2种生物碱的药代动力学动物实验研究 |
| 1.实验试剂与药品 |
| 2.实验仪器与实验器材 |
| 3.实验动物及分组方案 |
| 4.实验方法 |
| 5.UPLC-MS 条件 |
| 6.方法学验证 |
| 7.主要药代动力学结果 |
| 8.讨论 |
| 9.本章小结 |
| 第二部分 结语 |
| 第三部分: 附子药材的实验研究 |
| 第一章 毒性物质基础研究: 基于UPLC-MS/MS的附子不同剂型及煎煮时间下2 种生物碱的定性定量研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验仪器与实验器材 |
| 3.实验方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 6.本章小结 |
| 第二章 动物毒性验证研究: 附子不同煎煮时间的毒性观察及基于缝隙连接通道的探索验证研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 第三章 毒性代谢特点研究: 基于UPLC-MS/MS大鼠单次灌胃给药后附子不同煎煮时间的药代动力学 |
| 1.实验试剂与药品 |
| 2.实验仪器与实验器材 |
| 3.实验动物及分组方案 |
| 4.实验方法 |
| 5.UPLC-MS 条件 |
| 6.方法学验证 |
| 7.主要药代动力学结果 |
| 8.讨论 |
| 9.本章小结 |
| 第三部分 结语 |
| 第四部分: 附子复方的临床研究 |
| 含附子制剂在健康受试者中临床安全性观察研究 |
| 1.研究方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.本章小结 |
| 课题小结 |
| 创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附件 |
（2）TDCPP减轻H2O2和缺氧/复氧所致心肌细胞损伤机制的研究（论文提纲范文）
| 关键缩略词一览表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 TDCPP对H_2O_2 所致心肌细胞损伤保护机制的研究 |
| (一)材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| (二)结果 |
| 1.TDCPP抑制H_2O_2心肌细胞钙超载 |
| 2 TDCPP抑制H_2O_2心肌细胞凋亡和自噬,保护H_2O_2心肌细胞活力 |
| 3 TDCPP减轻 H_2O_2所致心肌细胞损伤的信号通路 |
| (三)讨论(第一部分) |
| 第二部分 TDCPP对 H/R所致心肌细胞损伤保护机制的研究 |
| (一)材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| (二)结果 |
| 1 TDCPP减轻H/R心肌细胞钙超载 |
| 2 TDCPP减轻H/R心肌细胞凋亡 |
| 3 TDCPP减轻H/R心肌细胞凋亡依赖PI3K/AKT/GSK3β信号途径 |
| (三)讨论(第二部分) |
| 结论 |
| 创新点、不足之处及后续研究计划 |
| 创新点 |
| 不足之处及后续研究计划 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（3）CaN/NFAT3介导线粒体乙醛脱氢酶2对高糖诱导的心肌损伤保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 中英文缩略词对照 |
| 附录 B 主要试剂配制 |
| 附录 C 个人简历及论文发表情况 |
| 附录 D 文献综述 |
| 参考文献 |
（4）TRPC对腹水综合征肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表或符号表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 肉鸡肺动脉高压的发病原因 |
| 1.3 肉鸡肺动脉高压发病机制 |
| 1.3.1 代谢性缺氧引起心输出量增加 |
| 1.3.2 肺血管重构导致的肺血管阻力增加 |
| 1.3.3 心脏病变导致的心脏功能异常 |
| 1.3.4 遗传选育导致发病率升高 |
| 1.4 TRPC与PHS的关系 |
| 1.4.1 TRPC对血管内皮细胞的影响 |
| 1.4.2 TRPC对血管平滑肌细胞的影响 |
| 第二章 诱导肉鸡肺动脉高压模型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.2.1 实验动物分组及处理 |
| 2.2.2 实验主要仪器与设备 |
| 2.2.3 方法 |
| 2.2.4 数据统计与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PHS发病率比较 |
| 2.3.2 RV/TV和PCV比较 |
| 2.3.3 血清 AST 和 CK 活性比较 |
| 2.3.4 肺组织和心肌病理学观察 |
| 2.3.5 肺动脉血管环张力的变化 |
| 2.3.6 心肌游离钙离子浓度变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PHS肉鸡肺组织中TRPC表达的变化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 实验动物分组及处理 |
| 3.2.2 实验主要仪器与设备 |
| 3.2.3 方法 |
| 3.2.4 数据统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 TRPC各亚型mRNA在肺组织和肺动脉中表达量 |
| 3.3.2 TRPC6蛋白在肺组织中的分布 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 缺氧对体外培养肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.2.1 实验主要仪器与设备 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.4 数据统计与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 体外培养PASMCs原代细胞生长情况 |
| 4.3.2 缺氧对体外培养的PASMCs增殖的影响 |
| 4.3.3 缺氧对体外培养的PASMCs中TRPC1,TRPC4和TRPC6mRNA表达情况的影响 |
| 4.3.4 缺氧对体外培养的PASMCs细胞内游离钙离子浓度的影响 |
| 4.3.5 缺氧对体外培养的PASMCs细胞周期的影响 |
| 4.3.6 缺氧对体外培养的PASMCs细胞凋亡的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 TRPC6激活剂与抑制剂对缺氧的PASMCs增殖与凋亡的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.2.1 实验主要仪器与设备 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.3 数据统计与分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 化学抑制剂和激活剂的最适浓度 |
| 5.3.2 TRPC6抑制剂和激活剂对缺氧PASMCs增殖的影响 |
| 5.3.3 TRPC6抑制剂和激活剂对缺氧PASMCs中TRPC6表达的影响 |
| 5.3.4 TRPC6抑制剂和激活剂多缺氧PASMCs细胞内游离钙离子浓度的影响 |
| 5.3.5 TRPC6抑制剂和激活剂对缺氧PASMCs细胞周期的影响 |
| 5.3.6 TRPC6抑制剂和激活剂对缺氧PASMCs凋亡的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（5）丹参红花有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元的保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 海马神经元细胞的原代培养鉴定及缺氧损伤模型的建立 |
| 一、材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 主要仪器及材料 |
| 2. 试剂和药品 |
| 3. 实验动物 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 溶液配制 |
| 2. 实验前器具灭菌处理 |
| 3. 海马神经元细胞的原代培养 |
| 4. 原代海马神经元细胞形态学观察 |
| 5. 原代培养的海马神经元细胞鉴定 |
| 6. 建立缺氧损伤海马神经元细胞模型 |
| 二、结果 |
| (一) 原代海马神经元细胞的形态学观察 |
| (二) 原代海马神经元细胞的鉴定 |
| (三) 缺氧对海马神经元细胞的形态影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) 海马神经元细胞的优点及原代培养注意事项 |
| (二) 海马神经元细胞的鉴定方法 |
| (三) 脑中风与海马神经元细胞缺血模型 |
| 四、小结 |
| 第二部分 细胞毒性试验确定给药浓度及实验分组 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 实验动物 |
| 2. 主要仪器和材料 |
| 3. 主要药品与试剂 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 溶液配制 |
| 2. MTT法细胞毒性实验 |
| 3. 给药浓度的确立及实验分组 |
| 二、结果 |
| (一) 丹红各有效成分及阳性对照药毒性实验结果 |
| (二) 确定分组给药浓度 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) 细胞毒性实验 |
| (二) MTT实验注意事项 |
| 四、小结 |
| 第三部分 丹红主要有效成分配伍对缺氧损伤乳鼠海马神经元细胞药效学研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 主要仪器及材料 |
| 2. 试剂和药品 |
| 3. 实验动物 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 缺氧后收集各组细胞及上清液 |
| 2. 细胞的裂解 |
| 3. 神经细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的测定 |
| 4. 采用BCA法测定各组细胞总蛋白浓度 |
| 5. 海马神经元细胞内总超氧化物歧化酶(T-SOD)的测定 |
| 6. 海马神经元细胞内丙二醛(MDA)的测定 |
| 7. ELISA检测6酮前列腺素F1a |
| 8. ELISA检测TXB_2 |
| 9. 神经细胞内线粒体膜电位(MMP)的测定 |
| 10. 海马神经细胞内游离钙离子含量的测定 |
| 11. Annexin V-FITC细胞凋亡检测 |
| 12. 数据统计分析 |
| 二、结果 |
| (一) BCA法测蛋白浓度标准曲线结果 |
| (二) 丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元细胞LDH释放量的影响 |
| (三) 丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元细胞SOD活性的影响 |
| (四) 丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元细胞MDA含量的影响 |
| (五) 丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元细胞中6-keto-PGF1a的影响 |
| (六) 丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元细胞中TXB2的影响 |
| (七) 丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元细胞MMP的影响 |
| (八) 丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元细胞内游离钙离子的影响 |
| (九) 丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元细胞早期凋亡率的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) 自由基与脑缺血 |
| (二) 血栓损伤与脑缺血 |
| (三) 细胞凋亡与脑缺血 |
| 四、小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（6）醒脑静中芳香开窍药促进栀子有效成分经鼻入脑转运机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 鼻腔给药治疗脑部疾病的研究进展 |
| 综述二 常用芳香开窍药的研究进展 |
| 综述三 鼻腔制剂评价方法研究进展 |
| 第二部分 实验内容 |
| 前言 |
| 第一章 细胞培养方法的建立 |
| 第一节 原代人鼻黏膜上皮细胞培养方法的建立 |
| 第二节 血脑屏障MDCK、MDCK-MDR1细胞培养方法的建立 |
| 讨论 |
| 第二章 醒脑静主要有效成分的细胞毒性实验 |
| 第一节 醒脑静主要有效成分的人鼻黏膜上皮细胞毒性实验 |
| 第二节 醒脑静主要有效成分的MDCK、MDCK-MDR1细胞毒性实验 |
| 讨论 |
| 第三章 栀子苷单独及其与艾片、麝香酮配伍后的细胞跨膜转运实验研究 |
| 第一节 细胞单层模型的建立及完整性评价 |
| 第二节 栀子苷含量测定方法的建立 |
| 第三节 栀子苷、艾片和麝香酮的P-gp活性测定 |
| 第四节 栀子苷与艾片、麝香酮配伍后在HNEC细胞单层模型的转运研究 |
| 第五节 栀子苷与艾片、麝香酮配伍后在血脑屏障MDCK、MDCK-MDR1细胞单层模型的转运研究 |
| 讨论 |
| 第四章 艾片、麝香酮促进栀子苷跨细胞单层模型转运作用机理研究 |
| 第一节 艾片、麝香酮对细胞紧密连接蛋白的影响 |
| 第二节 艾片、麝香酮对细胞膜流动性和钠、钾、钙ATP酶活性的影响 |
| 第三节 艾片、麝香酮对细胞膜电位和细胞内钙离子的影响 |
| 第五章 艾片、麝香酮对人鼻黏膜上皮细胞的刺激性研究 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| (一) 课题已完成的工作 |
| (二) 创新点 |
| (三) 课题展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）当归挥发油对血管紧张素Ⅱ所致心肌细胞肥大CaN通路及T通道的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 立题依据 |
| 1.现代医学研究 |
| 1.1 中药的钙通道作用 |
| 1.2 有效成分及复方的钙通道作用 |
| 1.3 高血压左心室肥厚的研究进展 |
| 1.4 高血压左心室肥厚的中医研究 |
| 实验一 心肌细胞的传代培养及肥大模型的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞与试剂 |
| 1.1.2 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 H9c2 心肌细胞培养 |
| 1.2.2 心肌细胞生长曲线的绘制 |
| 1.2.3 心肌细胞形态学观察 |
| 1.2.4 MTT 法确定药物剂量 |
| 1.2.5 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 乳鼠心肌细胞的原代培养 |
| 1.3.2 心肌细胞生长曲线(图 1-2) |
| 1.3.3 MTT 法测定心肌细胞细胞活性 |
| 1.3.4 血管紧张素Ⅱ对心肌细胞的促肥大效应 |
| 1.3.5 心肌细胞直径测定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 心肌细胞的培养 |
| 1.4.2 心肌细胞肥大模型的建立 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 附录(图片结果) |
| 实验二 当归挥发油的超临界萃取及药物浓度的确定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 药材 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 当归挥发油 CO_2超临界萃取工艺流程 |
| 2.2.2 心肌细胞原代培养(同实验一) |
| 2.2.3 MTT 法确定当归挥发油的剂量 |
| 2.3 统计学分析(同实验一) |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 当归挥发油成分分析结果 |
| 2.4.2 当归挥发油对正常心肌细胞的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 实验三 当归挥发油对血管紧张素Ⅱ致心肌细胞肥大的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验细胞(同实验一) |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 乳鼠心肌细胞原代培养(同实验一) |
| 3.2.2 肥大模型的建立和实验分组 |
| 3.2.3 MTT 法检测各组心肌细胞的生长抑制效应 |
| 3.2.4 激光共聚焦检测线粒体膜电位和细胞内钙离子浓度 |
| 3.2.5 蛋白印迹法检测蛋白 CaN、Cav3.1、Cav3.2、Caspase-3、Caspase-12 的表达 |
| 3.2.6 流式细胞术检测细胞周期 |
| 3.2.7 统计学分析(同实验一) |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 各组心肌细胞生长抑制效应 |
| 3.3.2 各组心肌细胞线粒体膜电位的变化 |
| 3.3.3 各组细胞内 Ca~(2+)的变化 |
| 3.3.4 各组细胞周期的变化 |
| 3.3.5 各组 CaN、Cav3.1、Cav3.2、Caspase-3、Caspase-12 的蛋白表达变化: |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 附录 |
| 结语 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 问题与展望 |
| 参考文献 |
（8）CaMKⅡδ对心房肌细胞钙离子流影响的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 CaMKⅡδ过表达及siRNA 慢病毒载体的构建 |
| 第一节 基于HIV 的CaMKⅡδ质粒构建及病毒包装 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 基于 FIV 的 CaMKⅡδ 相关 siRNA 质粒构建与病毒包装 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 乳鼠心房肌细胞原代培养及慢病毒感染 |
| 第一节 鼠心房肌细胞的原代培养与鉴定 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 慢病毒颗粒感染原代培养的乳鼠心房肌细胞 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 电场刺激对CaMKⅡδ调节钙离子流影响 |
| 第一节 电场刺激对CaMKⅡδ的表达及激酶活性的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第二节 激光共聚焦检测电场刺激对CaMKⅡδ调节细胞内钙流的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第三节 膜片钳检测电场刺激对CaMKⅡδ调节细胞内钙流影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 慢病毒在体感染鼠心脏实验的初步探索 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 CAMKⅡ调控CA~(2+)与心房纤颤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（9）大鼠原代培养心房肌细胞钙超载模型建立及CaMKⅡ抑制剂KN93的干预作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩写索引 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 大鼠原代培养心房肌细胞钙超载模型建立及CaMKⅡ抑制剂KN93 的干预作用研究 |
| 前言 |
| 第一部分 新生大鼠原代培养心房肌细胞钙超载模型的建立 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 CaMKⅡ抑制剂KN93 对新生大鼠心房肌细胞钙超载的干预作用研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ与心房颤动 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 细胞钙超载模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 学习期间发表或交流的论文 |
（10）基于“钙信号通路—血脑屏障”偶联的中药脑神经保护有效组分筛选方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词对照表 |
| 引言 |
| 第一章 脑神经保护活性组分筛选研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 第二章 钙信号通路调节作用研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要溶液及其配制 |
| 2.2.2 建立大脑皮层神经细胞内钙超载损伤模型 |
| 2.2.3 药物对谷氨酸诱导的大脑皮层神经细胞内钙超载的影响 |
| 2.2.4 药物对KCl诱导的大脑皮层神经细胞内钙超载的影响 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 药物对谷氨酸诱导大脑皮层神经细胞内钙超载的影响 |
| 2.3.2 药物对KCl诱导的大脑皮层神经细胞内钙超载的影响 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 透血脑屏障研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法与结果 |
| 3.2.1 试剂配制 |
| 3.2.2 体外血脑屏障模型的建立 |
| 3.2.3 药物透血脑屏障试验研究 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 灯盏乙素结构修饰物的相关研究 |
| 4.1 脑神经保护作用研究 |
| 4.1.1 方法与结果 |
| 4.2 透血脑屏障研究 |
| 4.2.1 方法与结果 |
| 4.3 钙信号通路调节作用研究 |
| 4.3.1 方法与结果 |
| 第五章 脑缺血整体动物模型的药效学验证研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 线栓的制备 |
| 5.2.2 MCAO模型的制备 |
| 5.2.3 药物配制及给药方案 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 大鼠一般状态评分 |
| 5.3.2 大鼠神经功能缺失体征评分 |
| 5.3.3 大鼠脑梗死比率(TTC染色) |
| 5.3.4 大鼠血液生化指标 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 研究结果的综合分析 |
| 6.1 钙信号调节与脑神经保护作用的相关性分析 |
| 6.2 透BBB能力与脑缺血保护作用的关联性分析 |
| 6.3 钙信号调节与脑缺血保护作用的相关性分析 |
| 结论 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 不足与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
四、心肌细胞原代培养系统的建立及比率荧光技术对细胞内游离钙离子浓度的测定（论文参考文献）
- [1]基于缝隙连接通道的附子心脏毒性早期预警及风险防控研究[D]. 钱真真. 中国中医科学院, 2021
- [2]TDCPP减轻H2O2和缺氧/复氧所致心肌细胞损伤机制的研究[D]. 张维山. 华中科技大学, 2019(03)
- [3]CaN/NFAT3介导线粒体乙醛脱氢酶2对高糖诱导的心肌损伤保护作用及机制研究[D]. 郭建路. 蚌埠医学院, 2019
- [4]TRPC对腹水综合征肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响[D]. 乔娜. 华南农业大学, 2018(08)
- [5]丹参红花有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元的保护作用研究[D]. 戴柳玲. 浙江中医药大学, 2015(01)
- [6]醒脑静中芳香开窍药促进栀子有效成分经鼻入脑转运机制研究[D]. 陈振振. 北京中医药大学, 2014(04)
- [7]当归挥发油对血管紧张素Ⅱ所致心肌细胞肥大CaN通路及T通道的影响[D]. 王雨薇. 甘肃中医学院, 2014(11)
- [8]CaMKⅡδ对心房肌细胞钙离子流影响的研究[D]. 秦瑶. 第三军医大学, 2011(07)
- [9]大鼠原代培养心房肌细胞钙超载模型建立及CaMKⅡ抑制剂KN93的干预作用研究[D]. 丁翔. 第三军医大学, 2010(04)
- [10]基于“钙信号通路—血脑屏障”偶联的中药脑神经保护有效组分筛选方法研究[D]. 盛艳梅. 成都中医药大学, 2010(12)