导读:本文包含了串联表位论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:恒定链载体,串联基因,免疫原性,新城疫病毒
串联表位论文文献综述
熊冉,艾珊珊,萧晟[1]（2019）在《基于恒定链载体不同抗原表位串联嵌合体免疫原性分析》一文中研究指出为研究多抗原表位串联在恒定链(inviraint chain,Ii)功能片段载体增强免疫作用中的特性,自行设计一系列引物,克隆新城疫病毒HN和鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因片段,用连接序列将其串联,并进一步连接小鼠Ii功能片段Cyt/TM,构建HN/VP2、Cyt/TM/VP2、Cyt/TM/HN、Cyt/TM/HN/VP2和Cyt/TM/VP2/HN共5个嵌合体,定向插入pET-32a原核表达载体,转化大肠杆菌诱导表达并纯化融合蛋白,分别免疫小鼠,经间接ELISA法测定血清抗体效价。结果显示,Ii功能片段可增强小鼠分泌特异性抗体,无论是Ii功能片段连接单一抗原表位,还是Ii功能片段连接多抗原表位串联,均比单用抗原表位免疫组提高抗体效价3倍以上,而多抗原表位串联不同试验组之间差异不明显。结果表明,Ii功能片段(Cyt/TM)具有增强免疫的作用,其连接的抗原表位串联不影响其免疫原性。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2019年08期）
孔里程,王兆飞,孙建和[2]（2019）在《猪链球菌保护性抗原表位串联亚单位疫苗设计及小鼠免疫保护效力分析》一文中研究指出为了筛选和鉴定猪链球菌3个保护性抗原GAPDH、MRP、DLDH的优势B细胞抗原表位,设计表位串联方案,研究重组串联表位蛋白(简称GMD蛋白)免疫小鼠后对猪链球菌攻击的免疫保护效力。采用生物信息学分析工具对优势B细胞抗原表位进行筛选,并将表位串联并构建重组质粒pET28a-GMD,诱导表达且纯化后将GMD蛋白配合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,并评价该蛋白对2型猪链球菌的免疫保护效力。发现经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白大小为43.3 kDa;小鼠免疫保护实验结果显示,免疫小鼠血清中针对猪链球菌HA9801菌株抗体效价最高可达1∶102 400,GMD蛋白对小鼠的免疫保护率可达90%。上述结果表明面对猪链球菌HA9801菌株的攻击,GMD蛋白可以为机体提供良好的免疫保护,本研究结果为猪链球菌新型表位亚单位疫苗的研制提供了基础数据。(本文来源于《上海交通大学学报(农业科学版)》期刊2019年03期）
李阳,杨奕,邵兵,邹悦,宋宇[3]（2019）在《非对称流场流分离-超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱用于过敏原蛋白表位筛选》一文中研究指出应用非对称流场流分离(AF4)技术结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)对过敏原蛋白表位进行筛选。将选择的过敏原蛋白(虾原肌球蛋白,TM)酶解后经UPLC-QTOF-MS分析,建立蛋白质肽谱。将TM酶解后的肽段与免疫球蛋白E混合孵育30 min,孵育过程中含有抗原表位的特异性肽段与免疫球蛋白E(IgE)结合,未结合的肽段仍留在溶液中。将孵育后的溶液进行AF4分离,已结合的肽段随IgE一起由出口流出,未结合的肽段透过分离通道膜,滤出至废液。收集出口流出的组分进行UPLC-QTOF-MS分析,与蛋白质肽谱匹配,找到特异性肽段,进而检测抗原表位。本研究扩展了非对称流场流分离技术的应用,对过敏原蛋白表位的检测进行了初步探索,为过敏原蛋白表位的研究提供了一种新的研究策略。(本文来源于《色谱》期刊2019年04期）
程凯慧,沈付娆,邹积振,朱彤,苗自利[4]（2018）在《牛冠状病毒S蛋白抗原表位基因的串联表达及抗血清制备》一文中研究指出为了构建牛冠状病毒(BCoV)抗原表位基因原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术获得BCoV S蛋白两段抗原表位(351 aa～403 aa、771 aa～784 aa)的基因串联体R,将其重组到pET-28a(+)质粒中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达抗原表位融合蛋白,用纯化的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了BCoV抗原表位基因重组表达质粒,获得了融合蛋白的抗血清,Western-Blot检测显示,该抗血清可与BCoV的融合蛋白特异性结合。表明成功构建了BCoV抗原表位基因原核表达载体并获得了BCo V抗血清,本研究为BCoV诊断试剂盒的开发和BCoV多表位疫苗的研究奠定了基础。(本文来源于《中国兽医杂志》期刊2018年10期）
杜吉革,薛麒,朱真,彭小兵,张秀坤[5]（2018）在《产气荚膜梭菌α毒素C末端与中和抗原表位的串联表达及免疫保护性分析》一文中研究指出为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的C末端(CPAC)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的叁拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GCPAC3NE3。将该片段克隆至原核表达载体p ET30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白。利用Western blot方法检测重组蛋白与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,以纯化的重组蛋白免疫家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。在二免后21 d,以1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素对家兔进行攻毒。结果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免抗血清可中和40个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和80个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,重组蛋白具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。(本文来源于《中国兽药杂志》期刊2018年08期）
张玉晴,汪天杰,许晓升,张峥嵘,许如苏[6]（2018）在《副溶血性弧菌外膜蛋白K的多表位串联表达研究》一文中研究指出[目的]设计和表达Omp K蛋白的多表位串联肽,综合评价其免疫效应。[方法]构建重组表达质粒p ET-32a-repis并进行原核表达,使用Ni-NTA纯化介质对表达产物进行纯化得到重组多表位串联肽(r EPIS),以r EPIS为免疫原免疫昆明小鼠,对r EPIS进行免疫原性和免疫保护性研究,Western-blot分析r EPIS的免疫反应性。[结果]r EPIS具有良好的免疫原性,能够刺激机体产生较高水平抗体,并且能够保护90%的昆明小鼠抵抗10LD50副溶血性弧菌的感染,具有良好的免疫保护效应,Western-blot结果显示重组r EPIS能够与免疫后鼠血清进行特异性结合,具有良好的免疫反应性。[结论]该研究制备的重组r EPIS具有良好的免疫特性,为副溶血弧菌多表位疫苗的研究奠定了物质基础。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2018年23期）
刘建方[7]（2018）在《猪胸膜肺炎放线杆菌重组串联表位抗原的设计表达及免疫保护作用》一文中研究指出猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种接触性呼吸道传染病,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。该病常与其它疾病混合感染或继发感染,使病情更加复杂,免疫预防成为了防控该病的重要途径。但是,APP分为16个血清型,且主要的血清型之间缺乏交叉免疫保护,导致疫苗研究进展缓慢。APP疫苗研究主要集中在亚单位结构上,但其结构复杂,分子较大,暴露在分子表面的有效抗原表位较少。有关APP表位疫苗的研究鲜有报道,表位疫苗免疫后细胞因子变化的相关研究更是少见。因此,设计APP表位疫苗并研究其免疫对攻毒后细胞因子的影响,对于更好地预防该病具有重要意义。课题组前期研究发现APP的叁聚体自转运粘附素(TAA)的头部(ADH)是其关键功能区,在细菌的粘附、侵袭、生物被膜的形成和逃避宿主免疫应答方面有重要作用,而且ADH对APP的感染具有免疫保护作用。另外,课题组发现痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes,PA)与APP有较强的交叉免疫保护,其共同抗原表位Ba1、Bb5、C1可以有效地预防APP感染。此外,深入研究发现APP的外毒素ApxⅣ上的表位PH1、高亲和力细胞周质锌转运蛋白上的表位PH2与PA的单链DNA结合蛋白具有较高的同源性,且对APP感染具有较好的免疫保护效果。为研究表位抗原的免疫效果和细胞因子对免疫效果的影响,本试验利用DNAstar软件和Bepipred 1.0共同预测ADH的有效抗原表位,并将其与Ba1、Bb5、C1、PH1和PH2通过柔性linker串联起来,并比较获得最佳组合序列。基因合成后构建原核表达载体p ET28a-RTA,经大肠杆菌BL21原核表达后通过镍柱亲和层析法纯化出目的蛋白RTA。在0、14、28 d时将其与铝胶盐水佐剂混匀后背部皮下免疫ICR小鼠,同时设置APP5b活菌、APP1灭活菌、APP5b灭活菌和PBS组作为对照,并在0、14、28、35 d分别进行尾静脉采血以检测血清抗体效价。在35 d进行APP1和APP5b攻毒前24 h和0 h分别给两组RTA蛋白免疫组进行腹腔注射IL-2、滴鼻GM-CSF处理。攻毒感染后观察临床症状和小鼠体重丢失情况,3天后处死小鼠,检测肺指数、肺匀浆中T淋巴细胞数、存活率以及BALF和血清中细胞因子的变化情况,以评价RTA蛋白的免疫保护效果和对细胞因子的影响及IL-2、GM-CSF的预处理对RTA蛋白保护效果的影响。结果显示,RTA蛋白大小为20.6 k Da,其最佳表达条件是37℃诱导表达6-8 h。Western blot结果显示RTA蛋白与抗APP5b高免血清具有良好的结合活性。将RTA蛋白免疫后,ICR小鼠产生了103数量级的抗体效价,且产生的抗体能与APP1和APP5b特异性结合。攻毒感染后RTA蛋白有效地减轻了临床症状和体重丢失,IL-2和GM-CSF预处理后肺指数略高于RTA免疫组,IL-2的预处理使肺匀浆中的T细胞数减少,GM-CSF则不影响T细胞的数目。RTA蛋白免疫使小鼠对APP1感染产生了40%的保护率。这些结果表明RTA蛋白对APP感染有一定的免疫保护作用,IL-2和GM-CSF预处理降低了RTA蛋白的保护作用。此外,RTA免疫组细胞因子IL-17、IL-1β、Fas-Ligand、IL-21、G-CSF、CCL4水平降低,表明RTA免疫有效地降低了炎症反应的发生。与RTA组相比,IL-2和GM-CSF预处理上调了TNF-α、IL-1β、IL-21、G-CSF、GM-CSF、CCL4等炎性因子,加重了炎症反应,从而降低了RTA蛋白的免疫保护效果。本研究设计了表位抗原RTA,并通过临床症状、体重丢失、存活率和细胞因子变化等指标综合评价了RTA蛋白的免疫保护效果,为APP新型表位疫苗的设计提供了理论基础,对于预防APP的感染具有重要意义。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-06-01）
林永润[8]（2018）在《RHDV VP60与Pm OmpH、OmpA抗原表位串联原核表达及其免疫原性研究》一文中研究指出兔病毒性出血症和兔巴氏杆菌病是目前对养兔业发展构成极大威胁的两种重要传染病,分别由兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)和多杀性巴氏杆菌(Pasteurela multocida,Pm)引起的。临床上两种疫病呈现出发病急、发病率和死亡率高,且常常出现混合感染,兔场发生这两种病时常导致巨大的经济损失。目前防控这两种疾病的疫苗主要为兔瘟、巴氏杆菌病的二联灭活疫苗,该疫苗存在使用剂量大、只产生体液免疫等缺点,研发新的疫苗十分必要。多表位疫苗是近年来借助生物技术研究的一种新型亚单位疫苗,可携带多个目标抗原,具备一苗多防、安全性好等特点。本研究旨在构建含有RHDV、Pm的主要保护性抗原多表位的原核表达载体,进行原核表达,研究重组蛋白的免疫保护效果,为研发同时防控兔瘟和兔巴氏杆菌病的多表位疫苗提供新思路。试验在分离鉴定RHDV和Pm毒株的基础上,PCR分别扩增RHDV VP60、Pm OmpH和OmpA基因序列,采用BepiPred-2.0在线工具分析筛选叁个蛋白抗原性强的表位区域,用柔性的连接肽Linker(Gly_4Ser)_3将其串联,优化编码表位蛋白的密码子后合成DNA序列;构建pET30a(+)-3epi原核载体,转入大肠杆菌BL21进行原核表达;纯化鉴定重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫家兔研究其免疫保护效果。结果如下:1.RHDV SZ/2016的鉴定及其VP60基因序列分析2016年到重庆石柱疑患RHD的某兔场采集样品,采用RT-PCR法检测样品中VP60基因,获得约为1.7 kb片段,纯化后进行序列测定并分析。结果显示:该序列全长1 740bp,共编码579个氨基酸,与GenBank上公布16株的RHDV VP60基因核苷酸同源性达94.9~95.9%,证明为兔瘟病毒(SZ/2016)。血凝试验显示SZ/2016毒株的血凝价为1:320。用1 mL SZ/2016毒株(1:10肝组织悬液)接种2Kg左右健康家兔,家兔于20 h~48 h发病死亡,表明SZ/2016毒株具有较强毒力。将测序的VP60 DNA序列翻译成氨基酸序列,利用BepiPred-2.0在线工具预测VP60蛋白的抗原表位。结果显示VP60蛋白的B细胞表位主要位于4~86、230~258位氨基酸区域内。2.巴氏杆菌的分离及其OmpH、OmpA基因序列分析2016年到重庆石柱疑患兔巴氏杆菌病的某兔场采集样品,通过细菌分离、形态染色、生化及16S rRNA方法鉴定,证明分离株为多杀性巴氏杆菌(Pm SZ/2016)。构建Pm SZ/2016的16S rRNA基因系统进化树,表明Pm SZ/2016菌株与GenBank上公布的12株参考菌株可分为两个族,其中与KX579747.1、MG597100.1等可聚为一族。用Pm SZ/2016菌株测定了对家兔的最小致死量,结果为10 CFU/mL。PCR法扩增Pm SZ/2016的OmpH、OmpA基因,纯化后进行序列测定并分析。结果显示:OmpH基因全长1 056 bp,共编码351个氨基酸,与GenBank中公布的16株Pm OmpH核苷酸序列同源性达98~99%;OmpA基因全长1 062 bp,共编码353个氨基酸,与GenBank中公布的14株Pm OmpA核苷酸序列同源性达96~100%。将测定的OmpH、OmpA DNA序列翻译成氨基酸序列,利用BepiPred-2.0在线工具预测OmpH、OmpA蛋白的抗原表位。结果显示OmpH蛋白的B细胞表位主要位于25~56、121~216、223~280、326~340位氨基酸区域内;OmpA蛋白的B细胞表位主要位于38~63、83~122、139~231、315~340位氨基酸区域内。3.表达载体pET30a(+)-3epi的构建及重组蛋白原核表达在分析RHDV(SZ/2016)VP60、Pm(SZ/2016)OmpH和OmpA蛋白的抗原表位的基础上;筛选了叁个蛋白抗原性强的表位区域,VP60、OmpH和OmpA分别选取1~102、121~216、139~231位氨基酸区域。用柔性Linker按OmpA(aa139~231位)-Linker-VP60(aa1~102位)-Linker-OmpH(aa121~216位)方式串联;合成的序列长978 bp,共编码323个氨基酸。将合成的DNA序列构建表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21;经菌液PCR、双酶切及测序鉴定表明表达载体pET30a(+)-3epi构建成功。将重组菌进行诱导表达,SDS-PAGE试验结果表明大肠杆菌BL21成功表达出重组目的蛋白,其分子量约为46 Ku,纯化蛋白经SDS-PAGE分析显示蛋白质凝胶上只出现一条清晰条带,Western-blot检测结果显示重组蛋白可被RHDV和Pm阳性血清所识别。4.免疫原性研究用弗氏佐剂与重组蛋白乳化后的产物免疫20日龄健康家兔,0.25 mg重组蛋白/只;分别在免疫后14、28、42天采血分离血清;用兔瘟和巴氏杆菌ELISA试剂盒检测不同时期家兔血清中RHDV和Pm的抗体水平,结果显示试验组家兔在免疫后两周均产生了抗RHDV和Pm特异性抗体,且抗体水平均随时间升高,于28天达到高峰并维持稳定。攻毒试验显示:在叁免后第14天试验组家兔能抵抗1mL血凝价为1:320的RHDV SZ/2016和1 mL(10 CFU/mL)剂量的Pm SZ/2016活菌的攻毒,其保护率分别可达81%和63%。综上所述,本试验在获得一株兔瘟病毒和一株多杀性巴氏杆菌基础上。分析了RHDV(SZ/2016)VP60和Pm(SZ/2016)OmpH、OmpA序列,成功表达了含有RHDV、Pm的主要保护性抗原多表位重组蛋白,动物免疫试验表明重组蛋白能够同时诱导家兔产生针对这两种病原的中和抗体,本研究为开发RHDV、Pm多表位疫苗提供了一种新的思路。(本文来源于《西南大学》期刊2018-04-20）
张尔夫[9]（2018）在《肺孢子菌p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗构建及其免疫原性检验》一文中研究指出目的:肺孢子菌肺炎(Pneunocystis pneumonia,PCP),是由机会性致病真菌——肺孢子菌(Pneumocystis,Pc)所引起的一种感染性疾病,最常发生于肺部,严重可致死。PCP最开始引起人们的关注是由于研究揭示了它与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染密切相关,特别在1981年将PCP定义为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的标志性疾病;近年来的流行病学资料显示,随着器官移植、恶性肿瘤、长期应用激素等非HIV感染的免疫功能抑制患者增多,在这类患者中并发PCP的临床病例不断上升,PCP再次引起了国内外研究者的极大关注。目前PCP临床治疗主要以复方磺胺甲基异恶唑为主,虽然能够取得一定的疗效,但因其毒副作用较大,造成部分患者不能耐受,加之出现的耐药性等问题,药物防治PCP面临严峻挑战。于是,国内外研究者纷纷将注意力转移到针对PCP的新防治策略及相关疫苗的开发上。先前有研究发现,作为Pc抗原成分之一的P55蛋白,在抗PCP中具有重要作用。机体主动免疫天然P55蛋白后,产生的免疫反应可以使机体在感染的初期得到一定程度的保护,故有研究者认为P55蛋白最有希望成为抗PCP的候选疫苗之一。然而,由于P55蛋白存在5种变异体,再加上到目前为止Pc在体外很难培养出足够的数量用于抗原制备,以致抗原的来源受阻,造成P55蛋白疫苗的开发一直没有取得有效进展。基于上述原因,本课题组利用生物信息学和分子生物学技术,人工设计构建了包括5种变异体有效抗原表位在内的p55多表位串联基因(p55TAG),并在前期研究中用原核表达载体及真核表达载体验证出p55TAG能有效表达出目的抗原蛋白,且该基因的分子疫苗在免疫抑制的大鼠PCP模型中具有一定的免疫保护潜力。但因Pc作为一种机会性感染真菌,主要侵犯免疫功能低下患者,对于这类人群采用常规单一的分子疫苗往往难以达到预期的免疫效果,于是课题组提出采用异质性“初次-加强免疫策略”(prime-booststrategy),即用两种异质的分子疫苗进行免疫,以提高疫苗抗PCP的效果。根据上述构想,本研究计划首先利用腺病毒载体搭载p55TAG构建一个重组腺病毒载体疫苗;其次验证其在真核细胞HEK293中的蛋白表达情况;最后用包装好的重组腺病毒载体疫苗免疫小鼠,检测小鼠体内相关免疫指标,以分析构建疫苗的免疫原性。期望能为抗PCP感染的异质性“初次-加强免疫策略”提供一种具有“加强免疫”作用的制剂,为最终建立有效的抗PCP疫苗奠定前期实验基础。研究方法:第一部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证1.p55TAG的获取与扩增用BglⅡ和XhoⅠ双酶切pMD18-T克隆载体上p55TAG目的基因,产物测序鉴定;PCR扩增鉴定正确的目的基因,产物胶回收。2.p55TAG重组腺病毒载体构建经EcoRI酶切的腺病毒连接质粒pHBAd-EF1-MCS-GFP与p55TAG目的基因进行连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态中,PCR扩增Amp+LB培养基上的单克隆菌落,产物测序鉴定。3.p55TAG重组腺病毒载体的病毒包装将重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染进HEK293细胞后观察GFP表达及CPE改变,包装后的重组腺病毒命名为pHBAd-p55TAG。4.p55TAG重组腺病毒的鉴定及真核细胞中目的蛋白表达提取pHBAd-p55TAG核酸,PCR扩增后产物测序鉴定;对重组腺病毒在HEK293细胞内所表达的蛋白进行SDS-PAGE与Western blot鉴定。第二部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验5.重组腺病毒的扩增、纯化、滴度测定用pHBAd-p55TAG反复感染HEK293细胞叁次,收集最后一次的病毒液,CsCl梯度离心法纯化病毒,TCID50法测定纯化后的病毒滴度。6.重组腺病毒载体疫苗免疫动物将6～8周龄、雌性BALB/c小鼠,按随机分组原则分为pHBAd-GFP、pHBAd-p55TAG、PBS叁组,每组10只;腹腔单针免疫,注射量为50μl/只。7.重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验于免疫后的第3d、1w、2w、3w末采集小鼠血清,MSD法检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子的水平;ELISA法检测3w末小鼠血清中IgG总抗体、IgG1和IgG2a抗体亚类的水平;流式细胞术对3w末小鼠脾细胞进行CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群分析,同时用qPCR法检测脾细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子相对表达量变化。8.统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计分析,计量资料数据以均数±标准差(X±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),两组间比较采用LSD-t检验,P<0.05表示有统计学差异。结果:第一部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证1.p55TAG的获取与扩增结果从本室保存的载体上经酶切、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测,结果在1200bp左右处出现特异条带(p55TAG基因片段全长1164bp),测序结果与原始p55TAG目的基因序列一致。2.p55TAG重组腺病毒载体构建结果转化后,从Amp+LB平板挑选8个单克隆菌落,经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定,有6个转化子在1500bp处出现特异性条带,选取阳性PCR产物进行测序,测序结果与原始p55TAG目的基因序列一致,证明重组腺病毒载体成功构建。3.p55TAG重组腺病毒载体的病毒包装结果重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,48h后观察到GFP明显表达,证明转染成功;8d后细胞出现典型CPE现象,证明重组腺病毒包装成功。4.p55TAG重组腺病毒的鉴定结果PCR扩增pHBAd-p55TAG,产物电泳后在1500bp出现特异性条带,测序结果与原始p55TAG目的基因序列比对结果一致,证明包装出的腺病毒中携带有p55TAG目的基因。5.p55TAG重组腺病毒在HEK293细胞中蛋白表达结果Western blot显示:与空载病毒相比,重组腺病毒在60kDa处有一明显条带,与预期结果相符,证明pHBAd-p55TAG在HEK293细胞中成功表达出目的蛋白。第二部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验6.重组腺病毒的扩增、纯化后滴度测定结果pHBAd-p55TAG扩增叁代,纯化后的病毒采用TCID50法测定的病毒滴度为1.99×1010PFU/ml,可用于下一步动物免疫实验。7.鼠脾CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群流式分析结果流式细胞术分析3w末小鼠脾T淋巴细胞,统计学分析结果显示;pHBAd-p55TAG组的CD4+T淋巴细胞升高水平相较于pHBAd-GFP和PBS组具有统计学意义(P<0.05;P<0.01);而在各组CD8+T淋巴细胞水平比较中,pHBAd-p55TAG组CD8+T淋巴细胞升高水平相较于PBS组具有统计学意义(P<0.05)。8.鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子变化水平分析结果MSD法检测鼠血清中四种细胞因子的浓度随时间变化水平,统计学分析结果显示:pHBAd-p55TAG组细胞因子IFN-γ和IL-17浓度升高水平相比其他两组具有统计学差异(P<0.01);而IL-2和IL-4的变化则不具有统计学意义(P>0.05)。9.鼠血清中总IgG抗体及IgG1和IgG2a抗体亚类变化水平分析结果ELISA法检测3w末鼠血清中IgG抗体和IgG2a亚类的变化水平,与其他两组相比,pHBAd-p55TAG组显着升高(P<0.01),而抗体IgG1亚类在叁组之间的变化水平无统计学意义(P>0.05);计算叁组IgG2a与IgG1比值,进行统计学分析结果显示pHBAd-p55TAG组与其他两组比较具有统计学差异(P<0.05)。10.鼠脾细胞中四种细胞因子Real-time PCR相对定量检测结果pHBAd-p55TAG组与pHBAd-GFP组相比PBS组四种细胞因子的表达量均有所升高,pHBAd-p55TAG组相较于PBS组,除IL-4外,其余叁种细胞因子的升高水平都具有不同程度的统计学差异,其中IL-17的升高具有极显着差异(P<0.001);在pHBAd-p55TAG组与pHBAd-GFP组的统计学比较中,只有IL-17的升高水平具有统计学意义(P<0.001)。结论:1.本研究成功构建出p55多表位串联基因腺病毒载体;2.包装后的p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗,可在真核细胞HEK293中成功表达出目的蛋白;3.构建的p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠后,能诱发小鼠体内细胞和体液免疫反应,验证其具有一定的免疫原性,为进一步抗肺孢子菌感染新策略、新疫苗研究奠定了实验基础。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-03-01）
张尔夫,薛婷,何丽,安春丽[10]（2018）在《表达肺孢子菌p55多表位串联基因腺病毒重组载体的构建》一文中研究指出目的构建携带肺孢子菌p55多表位串联基因(p55TAG)的腺病毒重组载体,鉴定其在真核细胞HEK293中的表达情况。方法将人工合成的p55TAG目的片段与腺病毒载体(p HBAd-EF1-MCS-GFP)连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态中,经Amp抗性筛选得到重组载体p HBAd-p55TAG,将重组载体与腺病毒骨架质粒p BHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)验证转染结果,收集包装成功的病毒进行PCR扩增,扩增产物测序验证,用Western blot检测病毒在感染细胞后的目的蛋白表达情况。结果构建的p HBAd-p55TAG腺病毒重组载体转染HEK293细胞后检测到绿色荧光蛋白表达,包装好的病毒PCR扩增产物测序结果与原始序列一致,Western blot检测结果显示在60 k Da处有成功表达目的条带。结论本研究成功构建了表达肺孢子菌p55多表位串联基因的腺病毒重组载体,并验证其能在真核细胞中有效表达。构建的载体为进一步研究抗肺孢子菌感染疫苗奠定了基础。(本文来源于《中国卫生检验杂志》期刊2018年01期）
串联表位论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为了筛选和鉴定猪链球菌3个保护性抗原GAPDH、MRP、DLDH的优势B细胞抗原表位,设计表位串联方案,研究重组串联表位蛋白(简称GMD蛋白)免疫小鼠后对猪链球菌攻击的免疫保护效力。采用生物信息学分析工具对优势B细胞抗原表位进行筛选,并将表位串联并构建重组质粒pET28a-GMD,诱导表达且纯化后将GMD蛋白配合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,并评价该蛋白对2型猪链球菌的免疫保护效力。发现经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白大小为43.3 kDa;小鼠免疫保护实验结果显示,免疫小鼠血清中针对猪链球菌HA9801菌株抗体效价最高可达1∶102 400,GMD蛋白对小鼠的免疫保护率可达90%。上述结果表明面对猪链球菌HA9801菌株的攻击,GMD蛋白可以为机体提供良好的免疫保护,本研究结果为猪链球菌新型表位亚单位疫苗的研制提供了基础数据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
串联表位论文参考文献
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