导读:本文包含了谷氨酸兴奋毒性论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:谷氨酸转运体,缺血耐受,大鼠脑,胶质细胞
谷氨酸兴奋毒性论文文献综述
[1]（2014）在《脑缺血预适应通过上调胶质细胞谷氨酸转运体-1的摄取活性降低谷氨酸的兴奋毒性》一文中研究指出以往的研究表明,脑缺血预适应(CIP)在诱导大鼠脑缺血耐受性的同时,可以上调胶质细胞谷氨酸转运体-1(GLT-1)的表达。研究者们通过微透析和高效能液相色谱法来观察细胞外谷氨酸的浓度,并进一步证实脑缺血耐受中GLT-1的摄取活性。研究表明,在对大鼠致死性缺血性打击后,谷氨酸浓度出现显着波动,其浓度峰值可达到基线值的7倍,这与海马CA1区神经细胞的延迟性死亡有关。若大鼠在致死性缺血性打击前,用CIP进行预处理2 d(CIP预处理(本文来源于《中国脑血管病杂志》期刊2014年06期）
张观坡[2]（2014）在《谷氨酸兴奋毒性在糖尿病大鼠选择性nNOS神经元减少及胃轻瘫中的作用》一文中研究指出研究背景及目的胃轻瘫是指胃在无机械性梗阻时出现的一组延迟性胃排空症状的临床表现，主要包括早饱、恶心、呕吐、胃肠胀气及腹部不适等。其中，糖尿病是胃轻瘫最主要的致病因素，且由于糖尿病发病人数的急剧增多，由糖尿病引起的胃轻瘫也越来越受到重视。胃轻瘫虽然不会直接增加死亡率，但是其可以引起营养不良、电解质失衡、血糖控制差、频繁住院等，严重影响了患者的生活质量。正常的胃排空需要肠神经、肠外自主神经、卡哈尔间质细胞（ICC，interstitial cellsof Cajal）以及平滑肌细胞之间的相互作用，许多研究者在糖尿病胃轻瘫的动物模型及患者上观察到了肠神经、迷走神经、ICC以及平滑肌细胞的病理改变。在这些病变中，肠神经中含神经源性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）神经元表达的减少最引人注目，但是其确切的病变机制尚不清楚。谷氨酸是中枢神经系统中一种经典的兴奋性神经递质，既介导了兴奋性神经传递的生理作用，又在病理条件下介导了神经兴奋毒性作用，后者主要是通过过度激活表达在nNOS神经元上的NR2B受体继而导致钙离子过度内流，一氧化氮（nitricoxide，NO）产生过多最终诱发神经元凋亡。但如果给予NR2B受体拮抗剂，虽然可以保护神经元避免神经兴奋毒性反应，却阻断了正常的神经元细胞活动，产生了较大的副作用，增加了脑卒中患者的死亡率。因而，越来越多的研究者在寻找更特异的神经元兴奋毒性的阻断靶点。既往有报道谷氨酸及其受体亦可分布在肠神经系统，但未有报道其在糖尿病胃轻瘫及选择性nNOS神经元凋亡中的作用。在本课题中，我们将证明：1、谷氨酸系统存在于胃肌间神经丛中；2、谷氨酸兴奋毒性可以导致糖尿病胃轻瘫及选择性nNOS神经元减少；3、特异性阻断NMDAR-PSD-95-nNOS蛋白相互作用可以保护nNOS神经元及改善糖尿病胃轻瘫。实验方法1、利用Sprague-Dawley大鼠建立糖尿病胃轻瘫动物模型。1）链脲霉素（streptozotocin，STZ）（55mg/kg）腹腔注射，48h后尾静脉采血监测血糖及体重变化。2）6周后测量4小时胃固体排空率评估大鼠是否出现胃排空延迟。3）利用免疫荧光、Western blot技术确定nNOS、乙酰胆碱转移酶（Cholineacetyltransferase，ChAT）表达的变化。2、通过抑制谷氨酸重摄取来模拟谷氨酸兴奋毒性。谷氨酸被释放进入突触间隙后，依赖于再摄取作用来终止其神经递质作用，分布于胶质细胞的兴奋性氨基酸转运体2（excitatory amino acid transporter2，EAAT2）承担了90%以上的转运任务。小干扰RNA（small interfering RNA， siRNA）是一种小RNA分子，可与之互补的mRNA结合从而沉默后者的表达。1）利用免疫荧光技术确认谷氨酸系统的全部组成成分如vGLUT1、NR2B、PSD-95、GS、EAAT2等是否存在于胃肌间神经丛中。2）将针对EAAT2siRNA注射进入浆肌层，利用电穿孔技术将siRNA转入细胞内。3）利用qPCR以及Western blot技术确认siRNA是否有抑制目的基因EAAT2mRNA及蛋白的表达。4）5天后测量4小时胃固体排空率评估注射siRNA大鼠是否出现胃排空延迟。5）利用免疫荧光、Western blot技术确定nNOS、ChAT的表达变化。3、合成特异性干扰NMDAR-PSD-95-nNOS蛋白相互作用的肽段Tat-NR2B9c（Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg--Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val），并通过离体与在体的方法验证其对nNOS神经元及胃轻瘫的作用。1）给予自带荧光基团5-FAM的100uM的Tat-NR2B9c，在胃全层（去除胃黏膜层及黏膜下层，保留固有肌层及其中的肠神经，whole mount）离体培养1小时后，利用免疫荧光评估其能否进入神经元细胞。2）在胃全层离体培养中，利用酶联免疫法测定cGMP的含量，评估预先1小时给予50nM Tat-NR2B9c能否抑制由100uM NMDA诱导产生的cGMP。3）在胃全层离体培养中，利用免疫荧光，评估预先1小时给予50nM Tat-NR2B9c能否抑制nNOS神经元的凋亡。4）siRNA注射及电穿孔后，在D0、2、4天给予大鼠Tat-NR2B9c（2.6mg/kg）腹腔注射，在D5天评估其EAAT2、nNOS、ChAT的表达以及胃固体排空率。5）STZ诱导大鼠糖尿病模型成功后，从第四周持续每天给予Tat-NR2B9c（2.6mg/kg）腹腔注射至第六周，在第六周评估其nNOS、ChAT的表达以及胃固体排空率。实验结果1、STZ可以成功诱导糖尿病胃轻瘫大鼠模型1）STZ（55mg/kg）腹腔注射后可以使STZ大鼠血糖上升（波动于300~450mg/dl之间），对照组则稳定在70~110mg/dl之间。2）STZ诱导糖尿病大鼠出现胃固体排空率下降，46.8+3.3%VS对照组71.7+4.4%。3）STZ诱导糖尿病大鼠nNOS表达量下降，为对照组的54.1±3.55%；但ChAT的表达量与对照组相比无明显差异。2、注射针对EAAT2的siRNA可以使大鼠出现胃排空延迟及nNOS表达下降。1）免疫荧光显示vGLUT1、NR2B、PSD-95、GS、EAAT2存在于胃肌间神经丛中。2）给予胃浆肌层注射针对EAAT2的siRNA组大鼠，EAAT2mRNA的表达量下降至对照组的54.03±3.54%；EAAT2蛋白的表达量下降至对照组的67.47±2.92%。3）siRNA组大鼠nNOS表达量下降，为对照组的40.9±2.73%；但ChAT的表达量与对照组相比无明显差异。4）siRNA组大鼠出现胃固体排空率下降，43.4±4.04%VS对照组72.6±2.93%。3、Tat-NR2B9c在离体及在体实验中可保护nNOS神经元及改善胃排空率。1）在胃全层体外培养中，免疫荧光显示Tat-NR2B9c可以进入神经元。2）NMDA可以引起胃全层cGMP的升高，50nM Tat-NR2B9c可以使100uMNMDA产生的cGMP下降26.8±3.12%。3）在胃全层体外培养中，100uM NMDA刺激可以使nNOS神经元的Caspase-3表达上升（59.17±3.43%VS对照组0）；给予50nM Tat-NR2B9c可以减少nNOS神经元的Caspase-3的表达（24.58±3.14%VS59.17±3.43%）。4）在胃whole mount体外培养中，100uM NMDA刺激可以使每个神经节nNOS神经元数目下降（4.0±0.40个/神经节VS对照组7.0±0.40个/神经节）；给予50nMTat-NR2B9c可以减少每个神经节nNOS神经元数目的下降（6.25±0.63个/神经节VS4.0±0.40个/神经节）。5）给予胃浆肌层注射针对EAAT2siRNA的大鼠，给予Tat-NR2B9c，nNOS的表达上升（78.4±4.36%VS40.9±2.73%），nNOS阳性神经元的数目也上升（14.8±1.15%VS24.4±2.25%）；同时，大鼠胃固体排空率也上升（65.9±5.38%VS43.4±4.04%）。6）STZ诱发糖尿病大鼠，给予Tat-NR2B9c，nNOS的表达上升（77.8±3.38%VS54.1±3.55%），nNOS阳性神经元的数目也上升（26.3±0.95%VS16.8±0.85%）；同时，大鼠胃固体排空率也上升（64.6±2.61%VS46.8+3.3%）。实验结论1、STZ腹腔注射可以模拟出糖尿病胃轻瘫大鼠模型，并出现选择性nNOS表达下降。2、谷氨酸系统存在于胃肌间神经丛中，针对EAAT2的siRNA于胃浆肌层中注射，可以诱发谷氨酸兴奋毒性，引起模型组大鼠选择性nNOS表达下降，并出现胃轻瘫。3、Tat-NR2B9c不仅可以进入神经元细胞，还可以通过抑制nNOS的活性来降低cGMP的产量。4、Tat-NR2B9c既可以在离体中保护nNOS神经元避免谷氨酸兴奋毒性，又可以在体在siRNA模型组及STZ诱导糖尿病组大鼠中保护nNOS神经元的凋亡和改善胃固体排空率。(本文来源于《第二军医大学》期刊2014-05-01）
唐静[3]（2012）在《叁七总皂苷对视神经节细胞谷氨酸兴奋毒性的保护作用》一文中研究指出目的观察叁七总皂苷（total panax notoginseng saponins，tPNS）对谷氨酸（glutamate，Glu）所致的视神经节细胞兴奋毒性的保护作用，并初步探讨其作用机制，从而为其用于青光眼的治疗提供理论依据。方法体外培养视神经节细胞系RGC-5，根据分组给予不同的处理。其中空白对照组加入等量培养基，Glu兴奋模型组加入1mM Glu刺激24h，阳性对照组在模型组的基础上加入10μM MK-801，观察组在Glu基础上加入100～500μg/mltPNS。24h后，通过钙黄绿素-乙酰甲酯染色法观察RGC-5的活性改变情况，流式细胞术检测RGC-5细胞凋亡。同时，采用RT-PCR检测细胞处理后Thy-1的表达情况，激光共聚焦法检测细胞内Ca~(2+)的水平，Western blot检测caspase-3表达，硝酸还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide，NO)的产生情况。结果1. Calcein-AM染色结果显示， Glu作用RGC-5细胞24h后，使其活细胞数明显降低（P<0.01），而同时加入100～500μg/ml tPNS共孵育，能以剂量依赖性方式增加活细胞数。当tPNS浓度为500μg/ml时，RGC-5活细胞数比Glu组增加了112.3%；2. RT-PCR结果显示，Glu处理能使Thy-1mRNA水平降低。tPNS和MK-801干预后，Thy-1的mRNA表达水平较Glu组明显上调，且tPNS和Thy-1的表达呈一定的剂量依赖性；3.流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，Glu能明显诱导RGC-5细胞，100～500μg/ml tPNS以及MK-801干预后凋亡细胞减少，呈一定的剂量-效应关系；4.正常对照组几乎未检测到caspase-3的活性亚基（17-kDa），Glu处理后，17-kDa活性亚基明显增多。不同浓度tPNS处理后，caspase-3活性亚基量显着降低；5. RGC-5细胞经Glu处理24h后，细胞内Ca~(2+)浓度显着增高。当给予tPNS处理后，胞内Ca~(2+)浓度随着tPNS剂量的增高而降低；6. Glu组NO含量明显高于阴性对照组(P＜0.01)；tPNS处理后，NO含量随剂量的增加而降低。当tPNS浓度为500μg/ml时，NO含量达（0.9241±0.025）μM，与Glu组相比， P<0.05。结论1．tPNS有效保护Glu兴奋所致的细胞凋亡；2．tPNS对Glu兴奋毒性的细胞保护作用可能是通过抑制胞内Ca~(2+)浓度、NO的产生以及降低caspase-3的活性而实现的。(本文来源于《南华大学》期刊2012-02-01）
胡丽荣,李金明,肖倩,杨峰,张爱军[4]（2011）在《视神经损伤兔视网膜谷氨酸浓度变化及其兴奋毒性作用观察》一文中研究指出目的观察视神经损伤兔视网膜谷氨酸浓度变化及其兴奋毒性作用。方法 48只健康大白兔随机分为A组36只、B组12只。A组右眼制作视神经损伤模型(实验眼),左眼作对照(对照眼);B组双眼制作视神经损伤模型;分别于造模后第13、、7、142、12、8天随机处死A组兔6只、B组兔2只,分别检测A组实验眼及对照眼视网膜谷氨酸,B组观察视网膜病理形态。结果 A组实验眼造模后视网膜内谷氨酸浓度迅速升高,第3天达高峰,之后开始下降,至第21天时与对照眼相近。B组造模后第1天即可见神经节细胞水肿,继而空泡化;自第7天开始,细胞皱缩、核固缩,数量明显减少;第21天时神经节细胞损失严重,残存的细胞外形皱缩、核固缩。结论兔视神经损伤后视网膜谷氨酸浓度迅速升高,并损伤神经节细胞。(本文来源于《山东医药》期刊2011年42期）
吴兰香,滕永真,李春莉,吴明军[5]（2010）在《p75NTR在谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中的表达》一文中研究指出目的:观察谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中神经营养因子受体p75(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)表达水平的变化。方法:建立谷氨酸诱导的新生大鼠海马神经元兴奋毒性损伤模型,RT-PCR和Western blot方法检测p75NTR在mRNA和蛋白质水平的表达变化。结果:谷氨酸刺激后,p75NTR在mRNA(P<0.01)和蛋白质(P<0.05)水平的表达较对照组明显增高;N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)的特异性拮抗剂MK-801可明显减弱p75NTR在mRNA和蛋白质水平的表达上调(P<0.05)。结论:p75NTR的活化与谷氨酸兴奋毒性神经损伤过程密切相关。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2010年07期）
王景春,崔杰,贾济,王启华,鲁大双[6]（2010）在《兔视神经损伤后谷氨酸对视网膜的兴奋毒性损伤作用研究》一文中研究指出目的探讨家兔视神经损伤后谷氨酸浓度变化对视网膜的兴奋毒性及其作用机制。方法 40只健康雄性日本大耳白家兔随机分成2组,A组35只,B组5只。A组家兔左眼为实验制备视神经损伤模型,右眼为对照眼。B组家兔双眼同时制备视神经损伤模型。分别于第1、3、7、14及28d随机处死A组7只家兔及B组1只家兔,检测家兔实验眼和对照眼视网膜谷氨酸浓度,并观察B组家兔视网膜病理形态学改变。结果家兔视神经损伤后视网膜内谷氨酸浓度逐渐升高,3d达到高峰,14d时家兔实验眼视网膜谷氨酸浓度仍高于对照眼(p<0.05),28d时其视网膜谷氨酸浓度无统计学差异(p>0.05)。家兔视网膜病理形态学观察:视神经损伤后1d,神经节细胞排列紊乱;3～7d,视网膜节细胞大量空泡化;7d～14d,视网膜厚度变薄,神经节细胞减少;14d后视网膜各层细胞改变逐步趋于稳定。结论家兔视神经损伤后,视网膜谷氨酸浓度升高是视网膜神经节细胞继发损伤的原因之一。(本文来源于《脑与神经疾病杂志》期刊2010年03期）
吴兰香,滕永真,李春莉,吴明军[7]（2009）在《EGb761对谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中p75NTR表达的影响》一文中研究指出目的:观察谷氨酸诱导海马神经元兴奋毒性损伤中神经营养因子受体p75(p75neurotrophin receptor,p75NTR)表达水平的变化,探讨银杏叶提取物(EGb761)抗兴奋毒性神经保护作用与p75NTR的相关性.方法:建立谷氨酸诱导的新生大鼠海马神经元兴奋毒性损伤模型,观察25~200mg/L剂量下EGb761的神经保护作用;RT-PCR,Western Blot及细胞免疫荧光染色方法检测p75NTR的表达变化.结果:100mg/LEGb761预处理给药的神经保护效果最明显;谷氨酸刺激后,p75NTR在mRNA和蛋白质水平的表达较对照组明显增高(P<0.01);EGb761本身对p75NTR表达无影响,而EGb761预处理组p75NTR在mRNA和蛋白质水平的表达较谷氨酸组均显着降低(P<0.05).结论:p75NTR在谷氨酸诱导兴奋毒性神经损伤中起着重要作用,EGb761抗兴奋毒性神经保护作用可能与抑制p75NTR的表达有关.(本文来源于《第四军医大学学报》期刊2009年19期）
徐静,孙长凯,王冬梅,徐红,张健[8]（2009）在《白果内酯对谷氨酸兴奋毒性致神经损害的保护作用》一文中研究指出目的观察不同剂量白果内酯对谷氨酸致海马神经元损害的影响,以探讨白果内酯在抗兴奋毒性神经损害中的应用价值。方法原代培养新生SD大鼠海马神经元,建立谷氨酸诱导的兴奋毒性模型;采用台盼蓝染色、TUNEL染色凋亡神经元测定及乳酸脱氢酶(LDH)活性测定的方法观察不同剂量白果内酯的神经保护作用,并与谷氨酸NMDA(N-甲基-D-天门冬氨酸盐)受体非竞争性拮抗剂MK-801的神经保护作用相比较。结果在一定剂量范围内,白果内酯可提高谷氨酸损伤的海马神经元细胞的存活率、降低细胞凋亡率、减少细胞中LDH的漏出,具有剂量依赖性,于100μmol/L剂量下呈现最佳神经保护效果,但弱于MK-801(浓度为10μmol/L)。结论白果内酯对谷氨酸诱导的兴奋毒性神经损害具有保护作用。(本文来源于《中草药》期刊2009年10期）
陆孟婷,李平华[9]（2008）在《视网膜缺血再灌注损伤中谷氨酸的兴奋毒性及其机制》一文中研究指出视网膜缺血再灌注(retinal ischemia reperfusion,RIR)损伤是多因素综合作用的结果,兴奋性氨基酸学说是其机制之一。谷氨酸本是一种主要的神经兴奋递质,行使重要的生理功能,而RIR过程中,细胞间质内谷氨酸浓度明显升高,过度激活谷氨酸受体,引起兴奋毒性,其机制主要有钙离子超载、过多一氧化氮合成、细胞内氧自由基升高及细胞凋亡等方面。(本文来源于《国际眼科杂志》期刊2008年08期）
雷爱军,王苹,高冬梅,杜波[10]（2008）在《镁离子降低耳蜗谷氨酸兴奋毒性及其对耳蜗神经元细胞钙离子内流的影响》一文中研究指出目的:观察硫酸镁对培养耳蜗神经细胞谷氨酸兴奋毒性的保护作用。方法:将体外培养新生大鼠耳蜗Corti器分为加入0.1mmol·L-1谷氨酸组和不同浓度(0.5、1.0、2.0和4.0mmol·L-1)硫酸镁组以及谷氨酸和硫酸镁联合组,采用Neurofilament 200kDa免疫荧光染色标记神经元和神经纤维,观察细胞形态和神经元存活数目;采用Fluo-3/AM染色法和激光共聚焦显微镜测定谷氨酸和硫酸镁作用组神经细胞内游离钙的变化。结果:谷氨酸作用24h后,神经元胞体变得不规则,数目明显减少,神经末梢出现肿胀。0.1mmol·L-1谷氨酸联合0.5、1.0和2.0mmol·L-1硫酸镁组的耳蜗神经元存活数量与单纯谷氨酸组比较明显增多(P<0.01)。单独硫酸镁作用耳蜗,2.0mmol·L-1浓度以下未见明显毒性。谷氨酸作用前应用硫酸镁在0.5~4h时间段观察到神经元钙离子内流低于单纯谷氨酸作用组(P<0.01)。单独应用硫酸镁对细胞内钙无影响。结论:硫酸镁对培养耳蜗神经细胞谷氨酸兴奋毒性具有显着的保护作用,其机制可能与镁离子抑制细胞内钙累积有关。(本文来源于《吉林大学学报(医学版)》期刊2008年04期）
谷氨酸兴奋毒性论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究背景及目的胃轻瘫是指胃在无机械性梗阻时出现的一组延迟性胃排空症状的临床表现，主要包括早饱、恶心、呕吐、胃肠胀气及腹部不适等。其中，糖尿病是胃轻瘫最主要的致病因素，且由于糖尿病发病人数的急剧增多，由糖尿病引起的胃轻瘫也越来越受到重视。胃轻瘫虽然不会直接增加死亡率，但是其可以引起营养不良、电解质失衡、血糖控制差、频繁住院等，严重影响了患者的生活质量。正常的胃排空需要肠神经、肠外自主神经、卡哈尔间质细胞（ICC，interstitial cellsof Cajal）以及平滑肌细胞之间的相互作用，许多研究者在糖尿病胃轻瘫的动物模型及患者上观察到了肠神经、迷走神经、ICC以及平滑肌细胞的病理改变。在这些病变中，肠神经中含神经源性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）神经元表达的减少最引人注目，但是其确切的病变机制尚不清楚。谷氨酸是中枢神经系统中一种经典的兴奋性神经递质，既介导了兴奋性神经传递的生理作用，又在病理条件下介导了神经兴奋毒性作用，后者主要是通过过度激活表达在nNOS神经元上的NR2B受体继而导致钙离子过度内流，一氧化氮（nitricoxide，NO）产生过多最终诱发神经元凋亡。但如果给予NR2B受体拮抗剂，虽然可以保护神经元避免神经兴奋毒性反应，却阻断了正常的神经元细胞活动，产生了较大的副作用，增加了脑卒中患者的死亡率。因而，越来越多的研究者在寻找更特异的神经元兴奋毒性的阻断靶点。既往有报道谷氨酸及其受体亦可分布在肠神经系统，但未有报道其在糖尿病胃轻瘫及选择性nNOS神经元凋亡中的作用。在本课题中，我们将证明：1、谷氨酸系统存在于胃肌间神经丛中；2、谷氨酸兴奋毒性可以导致糖尿病胃轻瘫及选择性nNOS神经元减少；3、特异性阻断NMDAR-PSD-95-nNOS蛋白相互作用可以保护nNOS神经元及改善糖尿病胃轻瘫。实验方法1、利用Sprague-Dawley大鼠建立糖尿病胃轻瘫动物模型。1）链脲霉素（streptozotocin，STZ）（55mg/kg）腹腔注射，48h后尾静脉采血监测血糖及体重变化。2）6周后测量4小时胃固体排空率评估大鼠是否出现胃排空延迟。3）利用免疫荧光、Western blot技术确定nNOS、乙酰胆碱转移酶（Cholineacetyltransferase，ChAT）表达的变化。2、通过抑制谷氨酸重摄取来模拟谷氨酸兴奋毒性。谷氨酸被释放进入突触间隙后，依赖于再摄取作用来终止其神经递质作用，分布于胶质细胞的兴奋性氨基酸转运体2（excitatory amino acid transporter2，EAAT2）承担了90%以上的转运任务。小干扰RNA（small interfering RNA， siRNA）是一种小RNA分子，可与之互补的mRNA结合从而沉默后者的表达。1）利用免疫荧光技术确认谷氨酸系统的全部组成成分如vGLUT1、NR2B、PSD-95、GS、EAAT2等是否存在于胃肌间神经丛中。2）将针对EAAT2siRNA注射进入浆肌层，利用电穿孔技术将siRNA转入细胞内。3）利用qPCR以及Western blot技术确认siRNA是否有抑制目的基因EAAT2mRNA及蛋白的表达。4）5天后测量4小时胃固体排空率评估注射siRNA大鼠是否出现胃排空延迟。5）利用免疫荧光、Western blot技术确定nNOS、ChAT的表达变化。3、合成特异性干扰NMDAR-PSD-95-nNOS蛋白相互作用的肽段Tat-NR2B9c（Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg--Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val），并通过离体与在体的方法验证其对nNOS神经元及胃轻瘫的作用。1）给予自带荧光基团5-FAM的100uM的Tat-NR2B9c，在胃全层（去除胃黏膜层及黏膜下层，保留固有肌层及其中的肠神经，whole mount）离体培养1小时后，利用免疫荧光评估其能否进入神经元细胞。2）在胃全层离体培养中，利用酶联免疫法测定cGMP的含量，评估预先1小时给予50nM Tat-NR2B9c能否抑制由100uM NMDA诱导产生的cGMP。3）在胃全层离体培养中，利用免疫荧光，评估预先1小时给予50nM Tat-NR2B9c能否抑制nNOS神经元的凋亡。4）siRNA注射及电穿孔后，在D0、2、4天给予大鼠Tat-NR2B9c（2.6mg/kg）腹腔注射，在D5天评估其EAAT2、nNOS、ChAT的表达以及胃固体排空率。5）STZ诱导大鼠糖尿病模型成功后，从第四周持续每天给予Tat-NR2B9c（2.6mg/kg）腹腔注射至第六周，在第六周评估其nNOS、ChAT的表达以及胃固体排空率。实验结果1、STZ可以成功诱导糖尿病胃轻瘫大鼠模型1）STZ（55mg/kg）腹腔注射后可以使STZ大鼠血糖上升（波动于300~450mg/dl之间），对照组则稳定在70~110mg/dl之间。2）STZ诱导糖尿病大鼠出现胃固体排空率下降，46.8+3.3%VS对照组71.7+4.4%。3）STZ诱导糖尿病大鼠nNOS表达量下降，为对照组的54.1±3.55%；但ChAT的表达量与对照组相比无明显差异。2、注射针对EAAT2的siRNA可以使大鼠出现胃排空延迟及nNOS表达下降。1）免疫荧光显示vGLUT1、NR2B、PSD-95、GS、EAAT2存在于胃肌间神经丛中。2）给予胃浆肌层注射针对EAAT2的siRNA组大鼠，EAAT2mRNA的表达量下降至对照组的54.03±3.54%；EAAT2蛋白的表达量下降至对照组的67.47±2.92%。3）siRNA组大鼠nNOS表达量下降，为对照组的40.9±2.73%；但ChAT的表达量与对照组相比无明显差异。4）siRNA组大鼠出现胃固体排空率下降，43.4±4.04%VS对照组72.6±2.93%。3、Tat-NR2B9c在离体及在体实验中可保护nNOS神经元及改善胃排空率。1）在胃全层体外培养中，免疫荧光显示Tat-NR2B9c可以进入神经元。2）NMDA可以引起胃全层cGMP的升高，50nM Tat-NR2B9c可以使100uMNMDA产生的cGMP下降26.8±3.12%。3）在胃全层体外培养中，100uM NMDA刺激可以使nNOS神经元的Caspase-3表达上升（59.17±3.43%VS对照组0）；给予50nM Tat-NR2B9c可以减少nNOS神经元的Caspase-3的表达（24.58±3.14%VS59.17±3.43%）。4）在胃whole mount体外培养中，100uM NMDA刺激可以使每个神经节nNOS神经元数目下降（4.0±0.40个/神经节VS对照组7.0±0.40个/神经节）；给予50nMTat-NR2B9c可以减少每个神经节nNOS神经元数目的下降（6.25±0.63个/神经节VS4.0±0.40个/神经节）。5）给予胃浆肌层注射针对EAAT2siRNA的大鼠，给予Tat-NR2B9c，nNOS的表达上升（78.4±4.36%VS40.9±2.73%），nNOS阳性神经元的数目也上升（14.8±1.15%VS24.4±2.25%）；同时，大鼠胃固体排空率也上升（65.9±5.38%VS43.4±4.04%）。6）STZ诱发糖尿病大鼠，给予Tat-NR2B9c，nNOS的表达上升（77.8±3.38%VS54.1±3.55%），nNOS阳性神经元的数目也上升（26.3±0.95%VS16.8±0.85%）；同时，大鼠胃固体排空率也上升（64.6±2.61%VS46.8+3.3%）。实验结论1、STZ腹腔注射可以模拟出糖尿病胃轻瘫大鼠模型，并出现选择性nNOS表达下降。2、谷氨酸系统存在于胃肌间神经丛中，针对EAAT2的siRNA于胃浆肌层中注射，可以诱发谷氨酸兴奋毒性，引起模型组大鼠选择性nNOS表达下降，并出现胃轻瘫。3、Tat-NR2B9c不仅可以进入神经元细胞，还可以通过抑制nNOS的活性来降低cGMP的产量。4、Tat-NR2B9c既可以在离体中保护nNOS神经元避免谷氨酸兴奋毒性，又可以在体在siRNA模型组及STZ诱导糖尿病组大鼠中保护nNOS神经元的凋亡和改善胃固体排空率。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
谷氨酸兴奋毒性论文参考文献
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