郑州市第七中学17届10班邮编：450000
【摘要】目的探讨线粒体DNA（mtDNA）拷贝数与卵母细胞受精结局的关系。方法收集未受精MII期卵母细胞及废弃胚胎，采用Real-timePCR方法定量检测，比较不同受精结局卵母细胞及废弃胚胎mtDNA拷贝数的差异。结果未受精卵母细胞mtDNA拷贝数平均为118466±60538；正常受精（2PN）胚胎mtDNA拷贝数为346743±171601；异常受精（1PN及多PN）胚胎mtDNA拷贝数为256000±78699，三组之间比较均有统计学差异(F=26.63，P<0.05)。结论mtDNA含量是评价卵母细胞质量的重要指标之一。卵母细胞中mtDNA拷贝数可能与受精结局息息相关，卵母细胞受精失败和异常受精可能均与mtDNA拷贝数减少有关。
【关键词】卵母细胞；线粒体DNA；受精；胚胎
RelationshipofmitochondrialDNAcopynumberinfertilitoutcomeZhangXinyuan*,MengYunxiang,WangTianzhen,GuoLiangjie.*TheSeventhMiddleSchool,Zhengzhou450000,China
【Abstract】ObjectiveTodetectmitochondrialDNA（mtDNA）copynumberinsinglehumanoocyteorembryo,andtoexploretherelationshipbetweenthemtDNAcopynumberandfertilizationoutcome.MethodsTocollectunfertilizedhumanoocytesandembryosunsuitabletotransferandisolatemtDNAthroughcelllyses.Singlecellreal-timePCRwasperformedtoquantifymtDNAcopynumber.ResultsThemeanmtDNAcopynumberforthefertilized(2PN)oocyteswas346743±17160fortheunfertilizedgroupitwas118466±60538,whereasforabnormalgroupitwas256000±78699.Thereweresignificantdifferencesforthethreegroups(F=26.63，P<0.05).ConclusionMitochondrialDNAcontentiscriticaltofertilizationoutcomeandservesasanimportantmarkerofoocytequality.TheabnormalcontentofmtDNAmayinvolveinthemechanismoffertilizationfailure.
【Keywords】Oocyte；DNA；Mitochondrial；Fertilization；Embryo
哺乳动物卵母细胞成熟以及早期胚胎发育，是一个复杂的生物学过程。线粒体是卵母细胞质中含量最为丰富的细胞器，为卵母细胞的受精和早期胚胎分裂提供能量，对胚胎发育至关重要。因此，线粒体在卵母细胞早期生命活动中作用的研究早已成为医学领域的热点。Blerkom等[1]的研究认为卵母细胞mtDNA拷贝数可作为评价卵母细胞质量的重要标志之一。本文通过研究未受精卵母细胞及废弃胚胎的mtDNA拷贝数，阐明mtDNA拷贝数与受精结局的关系。
1材料与方法
1.1卵母细胞及胚胎来源：本研究所有研究对象均签署《废弃卵母细胞及胚胎捐献知情同意书》。选择生殖医学科行IVF/ICSI-ET治疗的不孕症患者9例，排除染色体异常的患者。D2/D3天观察卵裂情况收集未受精卵母细胞和废弃胚胎测定mtDNA拷贝数。共收集未受精卵母细胞枚和废弃胚胎32枚。
1.2实验方法：
1.2.1废弃卵母细胞及胚胎mtDNA提取：将废弃卵母细胞及胚胎用Triode’s液（美国Sigma公司）吹吸去除透明带，PBS液洗涤3次，将单个卵母细胞及胚胎移入装有20μl双蒸水的1.5mlEP管中，-80℃低温冰箱保存待用。卵母细胞及胚胎总DNA采用QIAampDNAMicrokit（qiagen）试剂盒提取。
1.2.2引物设计：应用Primer生物软件结合生物信息学方法，设计并检验本实验所需要的引物。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下，5-CGAAAGGACAAGAGAAATAAGG-3，5-CTGTAAAGTTTTAAGTTTTATGCG-3，可扩增出158bpmtDNA特异性产物。
1.2.3卵母细胞及胚胎中mtDNA存在的PCR定性检测：25μl的PCR反应体系中加入模板5μl，混合引物（10μM）0.2μl，2×ExTaqPCRMix（Takara，中国）12.5μl。反应条件为:94℃预变性1min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共40个循环；72℃充分延伸10min。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4mtDNA拷贝数定量标准品的制备：按照MineluteGelExtractionKit（Qiagen）说明书对mtDNA的PCR产物进行分离和纯化；利用紫外分光光度计测定分离纯化的DNA浓度后，按1ng的PCR产物（158bp）含5.8×109双链DNA分子计算出分离纯化的DNA样品即标准品的拷贝数；将标品按照1∶10的比例进行倍比稀释，形成标准品梯度浓度。
1.2.5实时荧光定量PCR检测卵母细胞中mtDNA拷贝数：使用SYBTPremixExTaqTM试剂盒（Takara），采用Roche480实时荧光定量PCR扩增仪检测mtDNA拷贝数。PCR反应体系20μl：5μl模板，10μlSYBRPremixExTaqTM，0.4μlROXReferenceDye，混合引物1μl。反应条件为：95℃预变性10s，95℃变性5s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；设定溶解曲线，检测实时荧光定量PCR反应特异性。每次反应的标准曲线通过已知拷贝数的标准品确定；每个样品的起始mtDNA拷贝数通过此标准曲线来确定。每个样本做3个复孔，每组实验重复一次（见图1）。
3讨论
3.1mtDNA拷贝数与卵母细胞受精结局的关系：随着体外受精一胚胎移植技术的广泛使用，如何避免受精失败是生殖医学面临的挑战之一。线粒体是卵母细胞中最为重要的细胞器，Blerkom等[3]的研究指出，其对卵母细胞及早期胚胎发育具有重要作用。近年来国内外等[4,5,6]报道均认为，高龄患者卵母细胞发育潜能降低，受精率下降，卵母细胞退化等，可能与mtDNA拷贝数下降有关。推测mtDNA拷贝数与卵母细胞的受精结局关系密切。之前Santos等[6]通过对废弃卵母细胞及胚胎的研究认为，未受精卵母细胞mtDNA拷贝数为163698，正常受精组为333833，异常受精组为306000，三者间差异有统计学意义。本研究认为未受精和异常受精卵母细胞mtDNA拷贝数明显低于受精组。这与之前研究的结论相似。但是，本研究中mtDNA拷贝数与之前的研究不全相同，这可能与人群中mtDNA含量差异较大有关；所选患者卵巢功能和实验方法均可能影响mtDNA拷贝数。因此，推测mtDNA拷贝数可以反应卵母细胞受精结局。mtDNA拷贝数下降可能与卵母细胞受精失败以及异常受精有关。
3.2mtDNA拷贝数影响卵母细胞质量的可能机制：mtDNA拷贝数的减少可能通过影响呼吸链功能从而干扰卵母细胞的正常成熟和受精结局。卵子成熟过程中，线粒体分布于纺锤体四周，为微管活动提供能量，线粒体数量的异常可能导致减数分裂异常，引起卵子非整倍体的增加。mtDNA拷贝数下降可能导致ATP产量随之下降，从而影响卵母细胞成熟和随后的胚胎发育。Zeng等[7]报道，正常受精卵母细胞ATP含量为1.97±0.38pmol/L,未受精卵母细胞中ATP含量明显下降。目前已有实验证实[8]，通过补充线粒体营养物质—辅酶Q10，可以提高卵母细胞线粒体活性，增加ATP产量，从而提高老龄小鼠卵母细胞质量，降低非整倍体发生率，改善卵母细胞发育潜能。
综上所述，mtDNA拷贝数对卵母细胞生命活动具有重要作用，卵母细胞受精结局与mtDNA拷贝数有关，mtDNA拷贝数可能可以作为评价卵母细胞受精结局的指标。
参考文献
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