导读:本文包含了深海噬菌体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:嗜热噬菌体,核酸内切酶,晶体结构,HNH结构域
深海噬菌体论文文献综述
黄彦超[1]（2018）在《深海嗜热噬菌体GVE2 HNH核酸内切酶生化性质及结构研究》一文中研究指出HNH(His-Asn-His)核酸内切酶广泛分布于细菌、古菌、真核生物、病毒或噬菌体中,具有切割核酸的活性。目前,对于常温微生物的HNH核酸内切酶已经有较广泛的研究,但是源自嗜热噬菌体HNH核酸内切酶生化功能及结构的研究却鲜有报道。GVE2(Geobacillus virus E2)噬菌体分离于东太平洋深海热液区,其宿主菌为嗜热细菌Geobacillius sp.E263,该菌最适生长温度为60℃。GVE2噬菌体基因组测序已经完成,其编码一种HNH核酸内切酶。本论文首先将GVE2 HNH核酸内切酶的基因克隆至表达载体pET-30a(+),然后进行蛋白的诱导表达以及纯化,获得了重组的酶蛋白。其次,本文对该酶的生化性质进行了探讨。研究发现,重组的GVE2HNH核酸内切酶在60℃下具有非特异性DNA切割活性,能够切割线性λ DNA和闭合环状双链DNA。进一步的研究发现,该酶切割DNA的最适温度为60～65℃。热稳定性实验结果表明,该酶在100℃℃处理30 min后仍具有切割DNA的活性,证明其是一种耐热HNH核酸内切酶。该酶能够在pH 5.5到pH 9.0的的范围内对DNA进行切割,其最适反应pH值为8.0～9.0。此外,该酶活性依赖于二价金属离子:在Cu~(2+)存在条件下,酶活性被抑制;在Mn~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Co~(2+)、Zn~(2+)或Ni~(2+)存在条件下,该酶均有不同的切割活性,其中Mn~(2+)存在时具有最佳的切割DNA活性。另外,我们发现高浓度的NaCl能够抑制该酶的活性。与中国科学院高能物理研究所龚勇教授课题组合作,本论文解析了 GVE2 HNH核酸内切酶的晶体结构,其晶体包含一个保守的ββα-metal结构域,叁个保守的氨基酸残基(H93、N109和H118)以及一个Zn原子结合位点。尽管GVE2 HNH核酸内切酶与Gme(Geobacter metallireducens)HNH核酸内切酶的晶体结构非常类似,但是两者存在不同。此外,我们还解析了 GVE2 HNH核酸内切酶分别与Mn~(2+)和Zn~(2+)形成复合物的晶体结构。结果表明,两者复合物的晶体类似,但也存在不同。为进一步阐明GVE2 HNH核酸内切酶的催化机理,本论文构建了 GVE2 HNH核酸内切酶H93A、N109A和H118A突变体,并纯化得到了这叁个突变体蛋白。圆二色光谱实验结果表明,H93A取代未引起GVE2HNH核酸内切酶二级结构的变化。但是,H118A取代明显地改变了该酶的二级结构,而N109A取代中度地改变了该酶的二级结构。与野生型蛋白相比,这叁个突变体蛋白热稳定性均降低,暗示着这叁个氨基酸残基的改变与该酶的耐热性相关。另外,我们分析了 GVE2HNH核酸内切酶H93A、N109A和H118A突变体切割DNA的效率。研究发现,与野生型GVE2 HNH核酸内切酶相比,H93A、N109A和H118A突变体的活性分别损失了96%、60%和83%。此外,我们探讨了不同浓度Mn~(2+)和Zn~(2+)对野生型及突变体GVE2 HNH核酸内切酶切割DNA活性的影响。研究发现,尽管Mn~(2+)或Zn~(2+)存在时,野生型酶蛋白均能够切割DNA,但是切割模式不同。Mn~(2+)存在时,H93 A突变体几乎不能切割DNA活性,而N109A和H118A突变体具有减弱的切割活性;存在Zn~(2+)时,H93A、N109A和H118A均不能切割DNA。此外,我们还发现,该酶结合Mn~(2+)的能力要强于结合Zn~(2+)的能力,从而为解释Mn~(2+)是该酶的最佳金属离子提供了依据。本论文首次揭示了深海嗜热噬菌体GVE2 HNH核酸内切酶的生化性质、结构特征和催化机理,为阐明该酶在噬菌体GVE2生命周期中发挥的作用提供了理论基础,也为分子生物学及生物技术领域提供了嗜热的HNH核酸内切酶。(本文来源于《扬州大学》期刊2018-05-01）
许冠鹏[2]（2017）在《深海耐压细菌Shewanella piezotolerans WP3丝状噬菌体SW1低温诱导调控机制及硫修饰生理学功能研究》一文中研究指出病毒(包括噬菌体)是深海环境中丰度最大和多样性最高的生物种类,它们直接或间接影响着细菌和古菌的生命活动,并且在这种营养匮乏的环境中起着关键的生态调节者的作用。目前深海噬菌体的研究主要集中在生态调查的阶段,由于模式噬菌体-宿主系统的缺乏,深海噬菌体的基因表达调控方式及其与宿主的相互作用关系等科学问题尚未阐明。有研究表明,丝杆状噬菌体是深海深部沉积物中活跃的优势类群。本实验室2007年从来源于西太平洋1914米沉积物的深海细菌Shewanella piezotolerans WP3中分离到目前唯一的一株低温诱导丝状噬菌体SW1。SW1的低温诱导不依赖于经典的SOS途径,但具体的分子调控机制尚未解析。在本研究中,我们首先鉴定了SW1自身编码的转录调节因子FpsR对噬菌体基因表达的调控作用。fpsR基因缺失会导致包括自身在内的噬菌体基因显着上调,进而导致在20℃下噬菌体也能被诱导,产生单链的噬菌体基因组DNA。FpsR以同源四聚体的形式发挥作用,蛋白N端为DNA结合结构域,蛋白C端的两股α螺旋负责稳定多聚体,C端的缺失会使得FpsR丧失调控功能。凝胶阻滞实验和DNase I Foot-printing实验证明FpsR只在SW1结构基因操纵子的启动子区域具有叁个结合位点,不能结合到自身的启动子区域,但是由于噬菌体SW1启动子反向交叉的排列方式使得FpsR可以实现对自身的反馈抑制。生物膜干涉实验结果显示FpsR能够与叁个结合位点独立结合,且低温下FpsR结合DNA的能力会下降。与对照菌株相比,低温(4℃)下fpsR缺失突变体中噬菌体SW1基因仍然显着上调,表明除了FpsR之外还有其他蛋白参与SW1的低温诱导调控。我们发现,H-NS是宿主Shewanella piezotolerans WP3中对噬菌体SW1基因表达调控的关键转录因子。hns基因缺失会导致噬菌体fpsA等结构基因表达上调,调控蛋白fpsR基因表达下调。体外实验表明,H-NS能够与fpsA、fpsR的启动子区域直接结合发挥调控作用,并且分别具有一个结合位点。低温会导致H-NS与噬菌体启动子区域的亲和能力显着下降。此外,H-NS在噬菌体复制过程中也发挥重要作用,hns基因缺失会导致噬菌体复制缺陷。在fpsR、hns缺失的双突变体中,SW1基因表达的低温诱导效应明显减弱,低温下SW1基因的转录强度只增加了10%。据此,我们构建了以FpsR和H-NS为核心调控因子的噬菌体SW1低温诱导调控分子模型。利用新解析的噬菌体SW1基因调控模型,系统研究了硫修饰对于噬菌体基因表达调控的影响。DNA磷硫酰化修饰是指在天然DNA骨架上发现的P-O键被P-S键替换的化学修饰,属于首例DNA骨架上的生理修饰,由DndA-E实现。DNA硫修饰在细菌界分布广泛,但是独立存在的硫修饰系统的生理学功能一直没有被阐明,特别是硫修饰是否能够参与基因表达调控没有定论。噬菌体SW1的基因表达调控区域具有8个潜在的硫修饰识别位点。经过硫修饰以后,SW1的结构蛋白基因fpsA、fpsB表达显着上调,调控蛋白基因fpsR表达显着下调,表明硫修饰对噬菌体SW1基因的抑制和促进调控都产生影响。在对调控区域的硫修饰位点进行突变后,SW1的基因表达在有/无硫修饰系统的菌株中不再具有显着性差异。在对主要抑制蛋白基因fpsR进行缺失后,硫修饰对噬菌体SW1抑制调控的影响表型消失,fpsA以及fpsB的表达在有/无硫修饰系统的菌株中不具有显着性差异,但是硫修饰对于fpsR促进调控的影响依然存在,fpsR的转录水平显着低于对照菌株。总之,硫修饰干扰了噬菌体SW1原有的基因表达调控,进而导致SW1在20℃也被诱导,ssDNA形式的噬菌体基因组在细胞中被检测到。凝胶阻滞实验以及ITC实验证明硫修饰能够降低FpsR与DNA的结合能力。除了噬菌体本身以外,我们还研究了硫修饰对宿主细胞的生理影响。在Shewanella piezotolerans WP3中导入硫修饰系统,能够明显提升其在紫外、X射线、低温、低盐、高压、重金属的环境胁迫下的生长,然而在高盐、酸、碱、过氧化氢以及抗生素胁迫条件下硫修饰菌株与对照菌株的生长没有显着性差异,在高温条件下硫修饰菌株表现出了明显的生长缺陷。在一株过氧化物酶系功能缺失的大肠杆菌突变株Hpx~—中导入硫修饰系统,能够明显提升微生物在紫外、X射线、过氧化氢、低温、高温、低盐、高盐、高压、酸、碱、重金属的环境胁迫下的生存和适应能力,只是在抗生素胁迫条件下硫修饰菌株没有明显的生长优势。在不同胁迫条件下硫修饰基因的表达量相对恒定,氧化监测探针结果及过氧化氢清除实验证明了硫修饰在胞内发挥抗氧化的作用。我们还证实,WP3硫修饰菌株高温胁迫下生长缺陷是由于硫修饰干扰了热激蛋白原有的诱导调控,使得其表达量显着不足,从而导致了菌株的生长缺陷。对硫修饰菌株16S rRNA基因的系统发育分析表明,只具有硫修饰的菌株比具有硫修饰限制修饰系统的菌株分布更广泛并处于起源更早的分支中,提示硫修饰最早作为一种抗氧化系统起源,后来在进化传播的过程中与一套限制系统偶联进而构成了一套全新限制修饰系统。(本文来源于《上海交通大学》期刊2017-11-01）
徐丹丹[3]（2017）在《深海嗜热噬菌体GVE2 HNH核酸内切酶结构与功能的研究》一文中研究指出大部分的HNH核酸内切酶都能切割3-5bp的双链DNA片段,具有DNA切割活性。大部分的HNH核酸内切酶具有相似的结构,包括两条反向平行的β折叠片和一条α螺旋及一个金属离子结合中心。深海嗜热噬菌体GVE2(deep-seathermophilic bacteriophage Geobacillus virus E2)HNH 核酸内切酶在噬菌体的生命周期中作为一个很重要的组装机器,对噬菌体的繁殖及侵染有很重大的意义。本实验通过X射线晶体学的方法解析了高分辨率的GVE2 HNHE-Mn2+和GVE2 HNHE-Zn2+的叁维结构。本实验通过结构和生化两方面深入的研究了深海嗜热噬菌体HNH核酸内切酶的作用机制。这是深海嗜热噬菌体内HNH核酸内切酶的首次研究报道。生物信息学分析表明GVE2 HNHE属于HNH核酸内切酶超家族的一员。本实验通过结构比较显示,除了含有额外的α-螺旋之外,GVE2 HNHE具有与来自其它噬菌体的HNH内切核酸酶类似的典型的ββα-金属折迭结构和Zn-指状基序,这表明在噬菌体中这些酶具有很高的保守性。生化实验研究表明,HNH结构域中的保守氨基酸H93,N109和H118的突变体H93A,N109A和H118A分别降低了90%、80%、60%的切割活性。通过圆二色谱实验分析,与野生型GVE2 HNHE相比突变体H93A的构象并未发生很大的变化,突变体N109A和H118A的整体构象发生了很大变化。除此之外,通过圆二色谱测定野生型GVE2 HNHE和突变体蛋白的热稳定性发现,突变体蛋白(H93A,N109A和H118A)的热稳定性与野生型相比下降了很多。Mn2+和Zn2+对GVE2 HNHE的切割活性的影响各不相同。然而高浓度的锰离子对突变体N109A和H118A对DNA的切割活性产生促进作用,锌离子会抑制二者的切割活性。通过与其它类型的HNH核酸内切酶的结构比较,发现GVE2 HNHE的构象与其它核酸酶的构象有很大不同,这也许是这种酶高温耐热的基本原因。本文通过结构生物学的实验方法解析了深海嗜热噬菌体GVE2 HNH核酸内切酶的两种高分辨率叁维结构,并通过后续的生化实验研究验证了核酸内切酶的生理生化特性,为HNH核酸内切酶在深海嗜热噬菌体生命周期内的作用提供了证据和线索。(本文来源于《安徽大学》期刊2017-05-01）
金敏[4]（2014）在《深海嗜热噬菌体GVE2裂解宿主菌的机制及GVE2感染相关代谢物的功能研究》一文中研究指出众所周知,海洋覆盖了地球70%多的地表,蕴育着丰富和独特的生物资源,相比于陆生生物资源,人们对于海洋生物资源的认识和开发还处于起步阶段。自从1977年美国阿尔文号深潜器在太平洋首次发现了深海热液口后,深海热液口的生态系统和生物资源便受到了人们极大的关注。在深海热液口生态系统中,一些化能合成细菌和古菌能够利用地热能和化能来合成有机物,它们是整个生态系统中食物链的基础。近年来的研究发现在这些细菌和古细菌中存在着大量的病毒,这些病毒能够通过裂解细菌和古菌来破坏食物链的基础,从而极大地影响热液口生态系统的群落结构。同时,这些嗜热病毒还能够通过裂解宿主菌释放出可溶性的有机物来参与地球化学物质循环。因此对嗜热病毒尤其是嗜热菌噬菌体裂解宿主菌分子机理的研究,不仅能让我们了解在高温条件下病毒是如何裂解宿主菌的,而且在我们理解嗜热病毒对深海热液口生物群落和地球化学物质循环的作用方面具有非常重要的意义。本试验研究了深海热液口高温噬菌体GVE2裂解其宿主嗜热细菌Geobacillus sp. E263的分子机理。我们的研究发现,作为双链DNA噬菌体,GVE2能通过编码两种蛋白endolysin和holin来参与宿主菌的裂解过程。endolysin蛋白是一种胞质蛋白具有多种肽聚糖水解酶活性,它能够特异性地识别和降解宿主菌的细胞壁。然而endolysin蛋白自身不能跨膜运输到细胞壁上,它需要另外一个蛋白holin的辅助。holin蛋白是噬菌体编码的一种膜蛋白,在特定的时间和条件下,它能够在细胞膜上聚合并形成孔洞复合物,帮助endolysin蛋白从胞质中释放到细胞壁上。为了研究holin和endolysin蛋白在裂解中的作用,首先我们研究了GVE2感染的宿主菌Geobacillus sp. E263的生长曲线,结果表明GVE2的感染能够导致宿主菌的裂解。接着,通过荧光显微镜观察到在GVE2感染后endolysin-GFP能够在宿主菌中聚集,表明endolysin蛋白在宿主菌裂解中发挥重要作用。随后,我们通过-Northern blot和Western blot研究GVE2感染后宿主菌内endolysin和holin的表达量,结果表明从GVE2感染开始到宿主菌的裂解,endolysin和holin蛋白在宿主菌内都表达。细菌双杂交试验表明,宿主ABC转运蛋白(ABC transporter)能与噬菌体编码的endolysin蛋白相互作用。ABC transporter蛋白是—种依赖于ATP的跨膜转运蛋白,ABC transporter与与endolysin蛋白的相互作用可能有助于endolysin从细胞质中的释放,进而促进宿主菌的裂解。在了解GVE2裂解宿主嗜热细菌Geobacillus sp. E263的分子机理后,我们研究了细菌骨架蛋白MreB在GVE2侵染中的作用。MreB是一种在大多数杆状细菌中都存在的骨架蛋白,它与真核生物细胞的肌动蛋白actin具有同源性,MreB在维持细菌形态以及引导细菌细胞壁肽聚糖合成过程中发挥着非常重要的作用。本试验通过相差显微镜观察发现,MreB的特异性抑制剂A22和MP265能够通过抑制细菌MreB的聚合来改变细菌的形态。荧光显微镜观察结果表明,MreB-GFP能够与GVE2病毒颗粒共定位,结果揭示宿主MreB的聚合影响GVE2的侵染。我们进一步探寻从深海热液口微生物中获得有益生物资源的可能性。在噬菌体感染宿主菌后,宿主菌抵御噬菌体侵染可体现在蛋白、代谢物等分子水平。尤其是宿主菌在代谢水平上的扰动可能会产生一些具有抗噬菌体活性的小分子化合物,这些活性化合物可能具有潜在的抗病毒和肿瘤的活性。为此在本试验中,我们通过GC-MS和LC-MS方法分析了GVE2感染和未感染条件下宿主菌Geobacillus sp. E263的次生代谢产物变化。通过分析发现,有27种代谢物含量发生了显着变化,对其中3种GVE2感染后上调的代谢物色醇、对羟基苯甲醇、腺嘌呤进行了进一步研究。荧光定量PCR试验表明,色醇能够显着地抑制GVE2的感染和复制,而腺嘌呤能够促进GVE2的感染和复制。进一步试验发现,色醇能够与宿主的Clp蛋白酶发生相互作用。Clp蛋白酶是细菌中的一种蛋白水解酶,它能够通过-水解细菌中的蛋白底物来帮助细菌在逆境中生存。同时,还有研究报道发现Clp蛋白酶在噬菌体感染大肠杆菌的过程中发挥着重要的作用。因此,在本研究中色醇可能是通过与Clp蛋白酶的相互作用来参与宿主菌对噬菌体侵染和裂解的抵御。另—方面,我们研究了GVE2感染相关代谢产物在抗肿瘤中的作用。研究结果表明,GVE2感染的Geobacillus sp. E263代谢粗提物能够特异性地抑制胃癌细胞系AGS的生长,而不影响胃正常上皮细胞系GES的生长。通过对Geobacillus sp.E263的代谢粗提物进行半制备型高效液相色谱分离,我们纯化得到一个能特异性抑制胃癌细胞系AGS生长的代谢物,气相色谱-质谱分析表明纯化到的活性物质可能是一种新的化合物。本论文围绕嗜热细菌(Geobacillus sp. E263与其嗜热噬菌体GVE2在蛋白和代谢物水平上的相互作用关系展开研究。首先通过研究噬菌体编码的endolysin蛋白和宿主菌的ABC transporter蛋白的相互作用关系,阐述了在高温条件下噬菌体裂解宿主菌的分子机制。其次,我们研究了细菌骨架MreB在GVE2侵染中的作用。最后,我们探寻了从深海热液口微生物中开发生物资源的可能性,我们通过代谢组学方法研究了Geobacillus sp. E263在GVE2感染和未感染条件下的代谢谱图,获得27个与GVE2感染关的代谢物。由于噬菌体能够通过裂解宿主菌来影响热液口生态系统,因此本文的研究结果对理解噬菌体在深海热液口生态系统中的作用方面具有重要的意义,本文在深海热液口生物资源研究方面的工作有助于今后对热液口生物资源的进—步研究与利用。(本文来源于《浙江大学》期刊2014-04-01）
李明源,季秀玲,魏云林[5]（2012）在《极地和深海环境中低温噬菌体研究进展》一文中研究指出极地和深海是地球上较为独特的生态系统,生活在其中的生物由于长期处于低温、寡营养和黑暗封闭的环境中,大多缺乏基本的光合作用,而被认为是研究生命进化和地球环境演化等问题的"活化石"。在这样的极端环境中,低温噬菌体的丰度却很高,越来越多的证据表明它们在维持这类环境的生态平衡和调控生物地球化学循环等方面扮演着非常重要的角色。对极地与深海中低温噬菌体的研究进行简要综述。(本文来源于《生命科学》期刊2012年02期）
周治东[6]（2011）在《深海热液区嗜热菌噬菌体的分离、噬菌体GVE2基因表达和功能研究及嗜热菌蛋白热适应性机理初探》一文中研究指出近年来,感染嗜热古菌、细菌的高温病毒(嗜热菌嗜菌体)引起了越来越多科研工作者的关注。因为,它们可以作为一种模式系统来研究热液区生物的生物化学及分子生物学特性,而且它们还影响着生物地球化学和生态系统进化过程,包括营养循环、生物种群结构、生物分类、遗传转换、生物进化等。噬菌体的基因组虽然很微小,但是却编码了自身复制所需的蛋白,如DNA包装蛋白、头尾连接蛋白、DNA复制相关蛋白、转录调控蛋白、裂解相关蛋白等。通过比较基因组学,可以得到大量的基因多样性数据,同时发现基因组之间存在着非常明显的序列相似性。嗜热微生物在高温条件下仍然能够不失活性并进行正常生长的特性在基因工程、发酵工业、废水废料的厌氧处理以及矿产资源的开发利用上有着很大的应用价值。所以了解嗜热微生物的热适应性机理,有着极为现实的重要意义。本论文实验把来自北纬14.7510西经44.9774深海热液区采集的泥样接入2216E培养基,设计了60℃、65℃、70℃、75℃四个温度梯度,并根据噬菌斑的有无对样品处理后电镜观察。发现了叁株烈性嗜热菌噬菌体,并选择其中一株长尾噬菌体进行研究。经过初步验证,其中一株可能是从未报道过的嗜热菌噬菌体。本实验根据嗜热菌噬菌体GVE2的全基因组测序结果中ORF7、ORF8、ORF9、ORF10、ORF11、ORF33、ORF34、ORF37、ORF38、ORF39的核苷酸序列及表达载体pGEX-4T-2上的的多克隆位点设计并合成含有酶切位点(BamH I和Xho I)的正反向引物,进行重组表达,测序正确后纯化到了目的蛋白,并制作了相应的蛋白抗体,从而进一步实验以验证其基因的功能,以期了解噬菌体与宿主的蛋白互作关系。本论文对高温噬菌体GVE2的ORF8(头尾连接蛋白)进行了功能鉴定。根据GVE2的全基因组测序结果中ORF8的核苷酸序列在NCBI上的比对,预测其功能为噬菌体头尾连接蛋白。纯化到ORF8所表达的目的蛋白后,制备抗体,并通过ELISA检验了其效价。Western blot实验结果显示该蛋白在晚期表达,而后通过免疫电镜实验标记了其在噬菌体上的位置。初步证明了此蛋白确实在噬菌体GVE2的头尾连接处起作用。为了探索嗜热菌的热适应性机理,本文以近海温泉分离获得的Thermus thermophilus WL为材料,采用蛋白质组学进行研究。利用本实验室构建的超氧化物岐化酶缺失突变株测定突变株的生长曲线。结果显示,突变株与野生型菌株相比,最适生长温度由70℃下降至65℃,最高生长温度也下降了5℃,从80℃下降到75℃。为了找出由于超氧化物岐化酶缺失突变而导致的表达发生变化的其他蛋白,从而找出并研究与嗜热菌蛋白质热适应性有关的蛋白,进行了萤光差异双向电泳分析实验。在成功找到若干差异点后,打质谱鉴定,初步确定与嗜热菌蛋白质热适应性有关的蛋白。(本文来源于《国家海洋局第叁海洋研究所》期刊2011-05-01）
周治东,金春英,吕华,王蔚[7]（2011）在《深海嗜热噬菌体GVE2头尾连接蛋白EV8的原核表达和功能分析》一文中研究指出为了解头尾连接蛋白在噬菌体感染和装配中起的作用,对高温噬菌体GVE2(virulent bacteriophage ofGeobacillus sp.E263)的头尾连接蛋白EV8进行了原核表达和功能鉴定.将EV8编码序列克隆入pGEX4T-2原核表达载体,并转染大肠埃希氏菌BL21.诱导表达后用SDS-PAGE进行鉴定,显示获得相对分子质量约36kD的谷胱甘肽硫转移酶(GST-EV8)融合蛋白.Western blot检测发现EV8在GVE2感染后2 h开始表达,说明该蛋白为噬菌体晚期表达蛋白.免疫电镜定位表明头尾连接蛋白位于噬菌体头尾的连接处,为进一步研究高温噬菌体的组装和表达调控奠定了基础.(本文来源于《生命科学研究》期刊2011年02期）
蹇华哗,王风平,肖湘[8]（2010）在《深海丝状噬菌体SW1低温诱导调控机制及其与宿主相互作用关系的研究》一文中研究指出SW1是希瓦氏菌属中分离到的第一株丝状噬菌体,来自深海细菌Shewanellapiezotolerans WP3。荧光定量PCR的结果显示SW1中几个关键基因的转录水平在低温下上调。为验证SW1是否也受经典的SOS途径调控,我们构建了该途径中关键的抑制蛋白LexA的缺失突变体,结果表明其突变造成了WP3中SOS途径的缺陷,但是SW1的诱导却并不受影响,同时,UV和MMC并不能诱导SW1基因的表达,纯化的LexA蛋白也不能结合到SW1的调控区上,从而证实了SW1(本文来源于《2010年第四届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集》期刊2010-09-18）
叶婷[9]（2009）在《深海嗜热微生物噬菌体GVE2裂解相关蛋白的性质研究》一文中研究指出深海热液口微生物作为地球生物系统的重要组成部分,对于生态、资源、环境等方面具有重要性,在新药物开发等工业方面也存在巨大的潜在应用价值。过去普遍认为微生物是决定生物群落的关键,但是在极端与相对原始的深海环境下发现了噬菌体的存在,证明噬菌体实际上起到更基础的作用。对热液口嗜热菌噬菌体的研究,不仅有助于了解噬菌体在控制热液口生物群落中所起的作用,而且对探索生命起源也具有重要的意义。噬菌体裂解导致细菌死亡,从而影响细菌的繁殖,进而影响食物链,故研究其具有重大意义。本文以本实验室分离获得的深海热液区嗜热菌噬菌体GVE2为材料,研究与裂解相关的细胞壁水解酶和膜孔形成蛋白这两个蛋白的性质。许多发现表明细胞壁水解酶的作用范围比噬菌体的宿主范围要广,但也局限于同属细菌,且发现amidases具有较广的裂解范围。因为N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸键广泛存在细菌的细胞壁上。噬菌体裂解酶对细菌的高特异性,不影响无害或有益的人体寄生菌,裂解酶作为新型抗菌药物具有一定的优势,噬菌体作为有价值的酶的来源也就越来越引起人们的重视。大部分细胞壁水解酶来自常温噬菌体,只有小部分来自嗜热细菌噬菌体。本试验从海洋嗜热细菌噬菌体GVE2中鉴定的GVE2细胞壁水解酶是一种酰酶。本论文中,重组的细胞壁水解酶最适温度是60℃,该酶从40到80℃都具有活性。它的最适pH是6.0,并且从pH4.0到10.0较广的耐受。重组酶在pH5.0—10.0耐受1小时后仍保持50%的活性,说明GVE2细胞壁水解酶有较好的弱酸耐受性。对于去污剂和抑制剂(用chaps,EDTA,PMSF,Tween-20,TritonX-100,SDS),结果表明Tween-20和TritonX-100对酶的影响不大,但是SDS和EDTA对酶的活性具有强抑制作用。金属离子方面的研究结果显示,K~+、Li~+、Na~+对酶的活性有促进作用,Mn~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)对酶的活力有负面影响。在双链DNA噬菌体中,细胞壁水解酶本身没有信号肽,需要通过膜孔形成蛋白介导到达细胞壁,从而裂解宿主。通过Far-Western研究,结果显示GVE2细胞壁水解酶和膜孔形成蛋白存在互作,进一步采用细菌双杂交进行试验,结果表明膜孔形成蛋白全长与细胞壁水解酶81-233aa区域存在互作。本文通过GST pull down、免疫共沉淀研究,发现宿主的ABC运输蛋白、乙醇脱氢酶锌指结合蛋白和EF-Tu蛋白与GVE2细胞壁水解酶存在蛋白互作,克隆了ABC运输蛋白和EF-Tu基因,细菌双杂交试验显示细胞壁水解酶可能与复合体中的乙醇脱氢酶锌指结合蛋白或/和ABC运输蛋白存在互作。(本文来源于《国家海洋局第叁海洋研究所》期刊2009-06-01）
王怡倩[10]（2009）在《深海热液区嗜热菌噬菌体D6E的分子特征及GVE2与宿主的蛋白质互作研究》一文中研究指出海洋占整个地球表面积的71％，多样性的生态环境蕴藏着丰富的生物资源。深海热液口是地球上一个极其恶劣的生存环境-高温、高压、缺氧、含有大量有毒的化学物质，但是其中及其周围却存在着一个完整的生态系统。噬菌体被认为是地球上最丰富的生命体，几乎可以在地球上的每个生态环境中找到，同样也暗示着它们在微生物多样性和生态平衡上发挥着重要作用。嗜热菌作为深海热液口生态群落的初级生产者，是推动营养和能量循环的主要动力。噬菌体是一类特殊群体，它们寄生在细菌体内，根据环境变化发生溶原或者裂解，从而引起宿主菌在整个生态群落中的分布。由于深海热液口在地理分布上具有一定的独立性，所以噬菌体与宿主的关系直接影响着整个热液口生态群落的存在和结构。随着基因组测序技术的发展，越来越多的噬菌体基因组信息添加到基因组数据库中，这为噬菌体生物信息学研究提供了大量的数据，不仅包括噬菌体序列之间的分析，还有利于研究噬菌体群体之间的结构组成。噬菌体的基因组虽然很小，但是却编码了自身复制所需的蛋白，如DNA包装蛋白、头尾结构蛋白、DNA复制相关蛋白、转录调控蛋白、裂解相关蛋白等。通过比较基因组学，可以得到大量的基因多样性数据，同时发现基因组之间存在着非常明显的序列相似性。这些序列可以通过同源或者点特异性重组促进噬菌体基因模块发生互换；或者，通过非定向的遍及整个基因组发生非同源重组。在本论文中，通过各种筛选培养基对深海热液区样品中的嗜热菌和高温噬菌体进行了分离、纯化，并得到了4株高温噬菌体，对其中的高温噬菌体D6E进行了进一步研究。结果表明，高温噬菌体D6E为肌尾科病毒，有二十面体的头部，长长的尾巴和尾丝。经测序，D6E基因组有49335 bp，为双链环状DNA，可以编码49个预测有功能的蛋白。和其它噬菌体一样，D6E的基因排列也是成簇分布的，按功能可以分为四个部分：DNA包装和头部装配、尾部组成、溶原与裂解、DNA复制和转录。通过在NCBI数据库中进行比对分析发现，D6E的大部分结构相关蛋白与已知噬菌体蛋白的同源性非常低，但是溶原和裂解相关基因以及DNA复制和转录相关基因的核苷酸序列与本实验室另外一株已测序的高温噬菌体GVE2不管在基因排列、还是这些基因编码的氨基酸序列上都具有非常高的相似性。采用蛋白质组学技术，对D6E病毒粒子的蛋白质组进行了分析，结果得到了10个与结构相关的蛋白，包括核衣壳蛋白、入口蛋白、支架蛋白等，其中质谱匹配率非常高的两个未知蛋白ORF3(第3条带)和ORF16(第9条带)的功能有待进一步研究。根据本实验室分离获得的深海嗜热菌噬菌体GVE2基因组测序结果和预测阅读框分析，重组表达并纯化了20个GVE2蛋白，制备相应的多克隆抗体，采用Western Blot对噬菌体的基因表达进行了分析。通过免疫共沉淀(Co-IP)和GST下拉(GST pull-down)试验寻找在感染过程中GVE2与宿主可能发生相互作用的蛋白。通过实验，得到了两种蛋白复合体：与GVE2 ORF5(核衣壳蛋白，VP371蛋白)相互作用的分子伴侣蛋白；与GV2 ORF36相互作用的未知蛋白。本实验室前期工作中发现宿主的天冬氨酸转氨酶和分子伴侣蛋白参与了噬菌体的感染过程，因此，本试验进一步研究噬菌体GVE2 VP371蛋白与宿主天冬氨酸转氨酶和分子伴侣形成的蛋白复合体在噬菌体感染中的作用。Western blot和细菌双杂交试验结果显示，VP371蛋白和分子伴侣蛋白之间、分子伴侣蛋白和天冬氨酸转氨酶之间存在相互作用，而VP371蛋白和天冬氨酸转氨酶之间没有相互作用，复合体中3个蛋白呈串联结构结合在一起。在噬菌体感染实验中我们发现，随着感染时间的增加，VP371的转录表达量逐渐增大，同时分子伴侣蛋白和天冬氨酸转氨酶都比未感染时有了明显上调表达。因此，在噬菌体感染过程中，GVE2核衣壳蛋白VP371和宿主的分子伴侣蛋白发生相互作用，并依次递进促进了分子伴侣蛋白和天冬氨酸转氨酶的上调表达，从而进一步调控了宿主细胞的代谢活动。本论文对对高温噬菌体GVE2的ORF3(入口蛋白)和ORF56(胸腺嘧啶合成酶)进行了功能鉴定。ORF3预测为噬菌体入口蛋白，虽然在氨基酸序列上它与其他噬菌体具有很低的同源性，但与SPP1、HK97的入口蛋白都具有相似的螺旋／折迭排列结构，属于HK97入口蛋白家族，在DNA包装过程中发挥着相同的功能。预测二级结构分析发现，GVE2同SPP1和Phi29都具有非常保守的α-Helices，可能是在基因组包装过程中保留下来的一种古老结构域。通过免疫电镜定位，结果表明入口蛋白位于头尾的连接处。Orf56编码原核型的胸腺嘧啶合成酶，与已知的不同物种的胸腺嘧啶合成酶有很高的相似性。ORF56中可以找到符合胸腺嘧啶合成酶的活性中心的保守序列，还具有五个非常保守的motif，包括叶酸结合位点、催化活性中心、dUMP-结合位点、质子转运位点和功能待定区域。通过体外结合试验，结果发现ORF56编码的蛋白可以与其自身mRNA结合。(本文来源于《厦门大学》期刊2009-04-01）
深海噬菌体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
病毒(包括噬菌体)是深海环境中丰度最大和多样性最高的生物种类,它们直接或间接影响着细菌和古菌的生命活动,并且在这种营养匮乏的环境中起着关键的生态调节者的作用。目前深海噬菌体的研究主要集中在生态调查的阶段,由于模式噬菌体-宿主系统的缺乏,深海噬菌体的基因表达调控方式及其与宿主的相互作用关系等科学问题尚未阐明。有研究表明,丝杆状噬菌体是深海深部沉积物中活跃的优势类群。本实验室2007年从来源于西太平洋1914米沉积物的深海细菌Shewanella piezotolerans WP3中分离到目前唯一的一株低温诱导丝状噬菌体SW1。SW1的低温诱导不依赖于经典的SOS途径,但具体的分子调控机制尚未解析。在本研究中,我们首先鉴定了SW1自身编码的转录调节因子FpsR对噬菌体基因表达的调控作用。fpsR基因缺失会导致包括自身在内的噬菌体基因显着上调,进而导致在20℃下噬菌体也能被诱导,产生单链的噬菌体基因组DNA。FpsR以同源四聚体的形式发挥作用,蛋白N端为DNA结合结构域,蛋白C端的两股α螺旋负责稳定多聚体,C端的缺失会使得FpsR丧失调控功能。凝胶阻滞实验和DNase I Foot-printing实验证明FpsR只在SW1结构基因操纵子的启动子区域具有叁个结合位点,不能结合到自身的启动子区域,但是由于噬菌体SW1启动子反向交叉的排列方式使得FpsR可以实现对自身的反馈抑制。生物膜干涉实验结果显示FpsR能够与叁个结合位点独立结合,且低温下FpsR结合DNA的能力会下降。与对照菌株相比,低温(4℃)下fpsR缺失突变体中噬菌体SW1基因仍然显着上调,表明除了FpsR之外还有其他蛋白参与SW1的低温诱导调控。我们发现,H-NS是宿主Shewanella piezotolerans WP3中对噬菌体SW1基因表达调控的关键转录因子。hns基因缺失会导致噬菌体fpsA等结构基因表达上调,调控蛋白fpsR基因表达下调。体外实验表明,H-NS能够与fpsA、fpsR的启动子区域直接结合发挥调控作用,并且分别具有一个结合位点。低温会导致H-NS与噬菌体启动子区域的亲和能力显着下降。此外,H-NS在噬菌体复制过程中也发挥重要作用,hns基因缺失会导致噬菌体复制缺陷。在fpsR、hns缺失的双突变体中,SW1基因表达的低温诱导效应明显减弱,低温下SW1基因的转录强度只增加了10%。据此,我们构建了以FpsR和H-NS为核心调控因子的噬菌体SW1低温诱导调控分子模型。利用新解析的噬菌体SW1基因调控模型,系统研究了硫修饰对于噬菌体基因表达调控的影响。DNA磷硫酰化修饰是指在天然DNA骨架上发现的P-O键被P-S键替换的化学修饰,属于首例DNA骨架上的生理修饰,由DndA-E实现。DNA硫修饰在细菌界分布广泛,但是独立存在的硫修饰系统的生理学功能一直没有被阐明,特别是硫修饰是否能够参与基因表达调控没有定论。噬菌体SW1的基因表达调控区域具有8个潜在的硫修饰识别位点。经过硫修饰以后,SW1的结构蛋白基因fpsA、fpsB表达显着上调,调控蛋白基因fpsR表达显着下调,表明硫修饰对噬菌体SW1基因的抑制和促进调控都产生影响。在对调控区域的硫修饰位点进行突变后,SW1的基因表达在有/无硫修饰系统的菌株中不再具有显着性差异。在对主要抑制蛋白基因fpsR进行缺失后,硫修饰对噬菌体SW1抑制调控的影响表型消失,fpsA以及fpsB的表达在有/无硫修饰系统的菌株中不具有显着性差异,但是硫修饰对于fpsR促进调控的影响依然存在,fpsR的转录水平显着低于对照菌株。总之,硫修饰干扰了噬菌体SW1原有的基因表达调控,进而导致SW1在20℃也被诱导,ssDNA形式的噬菌体基因组在细胞中被检测到。凝胶阻滞实验以及ITC实验证明硫修饰能够降低FpsR与DNA的结合能力。除了噬菌体本身以外,我们还研究了硫修饰对宿主细胞的生理影响。在Shewanella piezotolerans WP3中导入硫修饰系统,能够明显提升其在紫外、X射线、低温、低盐、高压、重金属的环境胁迫下的生长,然而在高盐、酸、碱、过氧化氢以及抗生素胁迫条件下硫修饰菌株与对照菌株的生长没有显着性差异,在高温条件下硫修饰菌株表现出了明显的生长缺陷。在一株过氧化物酶系功能缺失的大肠杆菌突变株Hpx~—中导入硫修饰系统,能够明显提升微生物在紫外、X射线、过氧化氢、低温、高温、低盐、高盐、高压、酸、碱、重金属的环境胁迫下的生存和适应能力,只是在抗生素胁迫条件下硫修饰菌株没有明显的生长优势。在不同胁迫条件下硫修饰基因的表达量相对恒定,氧化监测探针结果及过氧化氢清除实验证明了硫修饰在胞内发挥抗氧化的作用。我们还证实,WP3硫修饰菌株高温胁迫下生长缺陷是由于硫修饰干扰了热激蛋白原有的诱导调控,使得其表达量显着不足,从而导致了菌株的生长缺陷。对硫修饰菌株16S rRNA基因的系统发育分析表明,只具有硫修饰的菌株比具有硫修饰限制修饰系统的菌株分布更广泛并处于起源更早的分支中,提示硫修饰最早作为一种抗氧化系统起源,后来在进化传播的过程中与一套限制系统偶联进而构成了一套全新限制修饰系统。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
深海噬菌体论文参考文献
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[3].徐丹丹.深海嗜热噬菌体GVE2HNH核酸内切酶结构与功能的研究[D].安徽大学.2017
[4].金敏.深海嗜热噬菌体GVE2裂解宿主菌的机制及GVE2感染相关代谢物的功能研究[D].浙江大学.2014
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[7].周治东,金春英,吕华,王蔚.深海嗜热噬菌体GVE2头尾连接蛋白EV8的原核表达和功能分析[J].生命科学研究.2011
[8].蹇华哗,王风平,肖湘.深海丝状噬菌体SW1低温诱导调控机制及其与宿主相互作用关系的研究[C].2010年第四届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集.2010
[9].叶婷.深海嗜热微生物噬菌体GVE2裂解相关蛋白的性质研究[D].国家海洋局第叁海洋研究所.2009
[10].王怡倩.深海热液区嗜热菌噬菌体D6E的分子特征及GVE2与宿主的蛋白质互作研究[D].厦门大学.2009