（1沈阳医学院药理学教研室辽宁沈阳110034）
（2沈阳医学院生理学教研室辽宁沈阳110034）
(3沈阳医学院儿少卫生与妇幼保健学教研室辽宁沈阳110034）
【摘要】目的：研究血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）开放大鼠血肿瘤屏障的效应及其量效关系。方法：建立大鼠C6脑胶质瘤模型，通过伊文思蓝的渗出量来评价血管内皮生长因子对血肿瘤屏障通透性的影响，比较不同剂量血管内皮生长因子开放血肿瘤屏障的效应并找到其最适剂量。结果：分别给予不同剂量的血管内皮生长因子后，脑组织中伊文思蓝含量随剂量的增加而增加，当血管内皮生长因子的剂量为0.05ng/g时，伊文思蓝含量达到最大值，继续增加血管内皮生长因子的剂量而脑组织中伊文思蓝含量变化不显著。结论：给予0.05ng/g的血管内皮生长因子是开放C6脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障的最适剂量。
【关键词】血管内皮生长因子；血肿瘤屏障；量效关系
【中图分类号】R730【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）22-0272-03
血肿瘤屏障（blood-tumorbarrier，BTB）是脑肿瘤组织的毛细血管内皮细胞形成的屏障，虽然脑胶质瘤内血肿瘤屏障不完整，常常被部分破坏，导致血肿瘤屏障在组成上不同于正常血脑屏障（blood-brainbarrier，BBB），但它仍是限制抗肿瘤药物转运的主要因素。如何使血肿瘤屏障可逆性的开放，有效地增加肿瘤组织中化疗药物的浓度，是提高胶质瘤化疗疗效，防止复发的关键。本研究拟建立大鼠C6脑胶质瘤模型，通过立体定位仪向肿瘤局部注射不同剂量的血管内皮生长因子，应用伊文思蓝的渗出量评价血管内皮生长因子作用前后胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性的变化，并找到其开放血肿瘤屏障的最适剂量，为脑胶质瘤等中枢神经系统疾病的治疗提供新途径。
1.资料和方法
1.1建立大鼠C6胶质瘤动物模型
1.1.1C6胶质瘤细胞培养及悬液制备C6胶质瘤细胞在温度37℃，湿度100%，5%CO2条件下，培养在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，当显微镜下观察C6胶质瘤细胞处于对数生长期时，弃去旧培养液，加入不含胎牛血清的高糖DMEM培养液，制成浓度为1×106/10μl的细胞悬液。以800r/min低速离心后，弃去上清液，将制备好的细胞悬液置冰上备用。
1.1.2颅内接种C6胶质瘤细胞悬液采用腹腔注射10%水合氯醛（3.5ml/kg）的方式麻醉大鼠，将大鼠头部固定在大鼠脑立体定位仪上。消毒皮肤后在大鼠的内毗连线与头部正中矢状线交汇点向后纵向切开头皮长约lcm，分离暴露颅骨。用微量注射器向大鼠右侧脑尾状核内注入10μlC6胶质瘤细胞悬液，注射靶点为：前囟前1mm、矢状缝右侧旁开3mm、深4.5mm，注射速度1μl/min，注射完毕后留针约3～5min，使细胞充分沉积，之后缓慢拔针，并用牙托粉迅速封闭骨孔。用生理盐水冲洗手术野，缝合切口后重新消毒皮肤。大鼠C6胶质瘤细胞移植10～14天后备用。
1.2实验动物分组和血管内皮生长因子注射
1.2.1本实验采用180～200g的健康Wistar大鼠40只，按注射剂量随机分为8组，每组5只。
1.2.2血管内皮生长因子注射采用腹腔注射10%水合氯醛（3.5ml/kg）麻醉C6胶质瘤细胞移植大鼠，将大鼠头部固定在大鼠脑立体定位仪上，用微量注射器向大鼠右侧脑尾状核注入不同剂量血管内皮生长因子，注射速度为1μl/min；对照组大鼠给予注射等量生理盐水，注射完毕留针约3～5min后缓慢拔针，并用牙托粉迅速封闭骨孔。
1.3测定血肿瘤屏障的通透性
1.3.1绘制伊文思蓝的标准曲线Fluka公司购买的伊文思蓝0.1mg，用甲酰胺配至10ml，从中取出0.8ml，再用甲酰胺稀释至10ml（浓度为0.8μg/ml）；从中取出5ml，再用甲酰胺稀释至10ml（浓度为0.4μg/ml）；从中取出5ml，再用甲酰胺稀释至10ml（浓度为0.2μg/ml）；从中取出5ml，再用甲酰胺稀释至10ml（浓度为0.1μg/ml）；从中取出5ml，再用甲酰胺稀释至10ml（浓度为0.05μg/ml），从中取出5ml，再用甲酰胺稀释至10ml（浓度为0.025μg/ml）。将各浓度的伊文思蓝置于37℃水浴中48h后，以甲酰胺作空白对照比色管，采用UV-260型紫外分光光度计在波长620nm处测定各浓度伊文思蓝的OD值，绘制伊文氏兰标准曲线。
1.3.2测定各组大鼠脑组织中伊文思蓝的含量各组大鼠经股静脉注入2%的伊文思蓝（2ml/kg），75min后，按照1.2.2向实验组大鼠右侧脑尾状核注入不同剂量血管内皮生长因子，对照组注射等量生理盐水。血管内皮生长因子作用45min后，经心室灌注肝素化生理盐水，直至右心耳处流出无色液体为止。将大鼠断头后，沿矢状缝分离出两侧大脑半球并称重，按照1ml/100mg脑组织加入甲酰胺溶液，60℃水浴抽提24h，采用UV-260型紫外分光光度计在波长620nm处测定OD值。根据标准曲线计算脑组织中伊文思蓝的含量（μg/g）。
1.4统计学处理
采用SPSS16.0进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（x-±s）表示，多组间采用单因素方差分析和LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有非常显著的统计学意义。
2.结果
2.1伊文思蓝的标准曲线
根据测定的各浓度伊文思蓝的OD值，绘制出伊文氏兰标准曲线：y=13.158x-0.018，R2=0.99,66，如图1所示。
图1伊文思蓝的标准曲线
2.2各组大鼠脑组织中伊文思蓝的含量变化
各组大鼠分别给予不同剂量血管内皮生长因子作用45min后，检测血肿瘤屏障的通透性改变，发现C6脑胶质瘤大鼠的脑组织经过血管内皮生长因子处理后呈现蓝染，而对照组和VEGF0ng/g组则未见蓝染。脑组织中伊文思蓝的含量见表一。各组脑组织中伊文思蓝的含量随血管内皮生长因子剂量的增加而增加，在血管内皮生长因子0.05ng/g时达到最大值，继续增加血管内皮生长因子的剂量脑组织中伊文思蓝的含量变化不显著（见图2）。
3.讨论
脑胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤，其侵袭性强，生存期短，死亡率高。目前以手术切除、术后化疗和放疗为主要治疗方法。尽管血肿瘤屏障在结构上不同于血脑屏障，但它仍然是限制许多化疗药物进入肿瘤组织，导致化疗失败的关键。化疗药物通过血脑屏障或血肿瘤屏障一般有两种途径：细胞旁途径和跨细胞途径。根据药物的理化性质，亲水性药物常以细胞旁途径为主，而亲脂性药物常以跨细胞途径为主[1]。化疗的疗效不仅取决于肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，更取决于血肿瘤屏障对化疗药物的通透性。如果转运到肿瘤组织中的化疗药物浓度增加两倍，那么其杀伤肿瘤细胞的能力将增加十倍。因此，如何选择性开放血肿瘤屏障，同时尽量不开放或少开放血脑屏障，有效地增加肿瘤组织中化疗药物的浓度而不损伤正常脑组织，是提高化疗疗效的关键，从而真正达到脑胶质瘤的靶向治疗。
1898年Ferara等人从牛垂体滤泡星状细胞的体外培养液中分离纯化出一种生长因子，该生长因子作用于血管内皮细胞，故被命名为血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），又称为血管渗透因子（vascularpermeabilityfactor，VPF）。目前研究表明，人VEGF基因位于染色体的6p21，由8个外显子和7个内含子构成，基因全长28kb。该基因不同的剪接方式形成VEGF的不同异构体：即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206。血管内皮生长因子有三个高亲和力受体：即Flt-1，Flk-1/KDR和Flt-4，它们主要分布于血管内皮细胞表面，均是跨膜受体，含有7个免疫球蛋白样结构的细胞外区、膜区及酪氨酸激酶区，在内皮细胞的生长和分化中起重要作用[2]。
许多研究表明适当剂量的血管内皮生长因子能够有效地增加大鼠血脑屏障的通透性。Rite等人用立体定位方式向大鼠黑质内注射不同剂量的血管内皮生长因子，结果发现单次注入1μg血管内皮生长因子后可见荧光素标记的白蛋白从血管渗漏进入脑实质内，充分表明血管内皮生长因子可以破坏血脑屏障[4]。Mayhan向脑组织局部注射0.1nM血管内皮生长因子后，血脑屏障对FITC标记的10KD葡聚糖的通透性持续增加，在血管内皮生长因子作用40min时达峰值[5]。我们应用伊文思蓝的渗透方法评估血肿瘤屏障通透性变化时发现，脑组织中伊文思蓝的含量随血管内皮生长因子剂量的增加而增加，在血管内皮生长因子0.05ng/g时达到最大值，继续增加血管内皮生长因子的剂量脑组织中伊文思蓝的含量变化不显著。这表明血管内皮生长因子增加C6脑胶质瘤模型大鼠血肿瘤屏障的通透性，0.05ng/g是血管内皮生长因子开放C6脑胶质瘤模型大鼠血肿瘤屏障的最适剂量。其他研究者也在小鼠脑内得到相似的研究结果，Dobrogowska等应用立体定位仪向小鼠肿瘤局部注入40ng血管内皮生长因子，作用10min后发现33%的血管漏出白蛋白；作用30min后有92%的血管漏出白蛋白[6]。因此，将血管内皮生长因子与传统化疗药物联合应用，可能选择性地开放血肿瘤屏障，有效地增加肿瘤组织中化疗药物的浓度，进一步提高化疗的疗效，为胶质瘤的治疗开辟新的途径。
4.结论
综上所述，血管内皮生长因子增加C6脑胶质瘤模型大鼠血肿瘤屏障的通透性，0.05ng/g是血管内皮生长因子开放C6脑胶质瘤模型大鼠血肿瘤屏障的最适剂量，可以为脑胶质瘤的药物治疗提供新的途径。然而血管内皮生长因子开放血肿瘤屏障的分子机制有待进一步研究。
【参考文献】
[1]沈大伟,陈磊,胡韶山.脑胶质瘤血肿瘤屏障特点的研究[J].脑与神经疾病杂志,2013,1:73-75.
[2]FerraraN,GerberHP,LeCouterJ.ThebiologyofVEGFanditsreceptors.NutureMedicine.2003;9(6):669-676.
[3]马莉.VEGF及其受体的生物学特性及在肿瘤血管生成中的作用[J].中国优生与遗传杂志,2016;5:146-148.
[4]RiteI,MachadoA,CanoJ,etal.Blood–brainbarrierdisruptioninducesinvivodegenerationofnigraldopaminergicneurons.JNeurochem.2007;101(6):1567-1582.
[5]MayhanWG.VEGFincreasespermeabilityoftheblood-brainbarrierviaanitricoxidesynthase/cGMP-dependentpathway.AmJPhysiol.1999;276(5pt1):1148-1153.
[6]DobrogwskaDH,LossinskyAS,TarnawskiM,etal.Increasedblood-brainbarrierpermeabilityandendothelialabnormalitiesinducedbyvascularendothelialgrowthfactor.JournalofNeurocytology.1998;27(3):163-173.
基金项目：辽宁省教育厅科学技术一般项目（L2014420）