导读:本文包含了细胞因子分子佐剂论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:祛风舒筋丸,类风湿性关节炎,作用机制
细胞因子分子佐剂论文文献综述
张瑶,屠莹,胡占嵩,陈丽娟[1]（2019）在《祛风舒筋丸对佐剂关节炎大鼠免疫调节及血管内皮生长因子、细胞黏附分子-1表达的影响》一文中研究指出目的研究祛风舒筋丸对佐剂关节炎大鼠免疫调节作用以及对血管内皮生长因子(VEGF)与细胞黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法建立弗氏完全佐剂关节炎大鼠模型,检测体外诱导脾淋巴细胞增殖水平,血清细胞因子含量以及滑膜VEGF、ICAM-1的表达水平。结果祛风舒筋丸能显着抑制模型大鼠足趾肿胀,抑制体外诱导的T、B淋巴细胞增殖,抑制类风湿因子(RF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的生成,抑制VEGF、ICAM-1的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论祛风舒筋丸具有较强的抗类风湿关节炎作用,其作用机制可能与抑制体外诱导的T、B淋巴细胞增殖,抑制IL-1β、IL-6及TNF-α等细胞因子生成,抑制VEGF和ICAM-1的表达水平有关。(本文来源于《安徽医药》期刊2019年03期）
谢强[2]（2016）在《miR-223抑制佐剂性关节炎大鼠巨噬细胞NLRP3炎症小体介导炎症因子分泌的分子机制研究》一文中研究指出类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一个以关节滑膜炎症为特点的慢性自身免疫性疾病,它可以导致骨的侵蚀和关节的破坏,最后造成关节畸形,病因迄今仍未被阐明。RA的发病与炎症密切相关,异常的细胞免疫反应和体液免疫反应在疾病发病中起着重要作用。有学者研究表明巨噬细胞在RA发病中至关重要。固有免疫反应是机体防御病原体的第一道防线,炎症小体作为固有免疫的重要组成部分,主要通过模式识别受体(pattern recognization receptors, PRRs)来识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),从而产生免疫应答。PRRs包括位于细胞膜的Toll样受体(TLRs)、位于细胞质的NOD样受体(NLRs)、C型凝集素受体(CLRs)等。NLRP3炎症小体是迄今为止研究最为广泛的由NLR家族组成的炎症小体之一,参与炎症、肿瘤的发病,也在正常生理稳态维持过程中起到重要的作用。佐剂性关节炎(AA)大鼠模型是最为经典的RA动物模型之一,本课题在前期研究中发现,AA模型大鼠血清以及腹腔巨噬细胞体外培养的细胞上清液中IL-1β、 IL-18等炎症因子分泌明显增加(P<0.01)。使用免疫组织化学方法测得AA大鼠滑膜组织中NLRP3炎症小体的叁个组分NIrp3、ASC、caspase-1均明显提高(P<0.01)。提示NLRP3炎症小体可能参与AA大鼠的发病。与此同时,前期研究发现AA大鼠腹腔巨噬细胞中的NLRP3炎症小体组分表达增加的同时(P<0.01)而miR-223表达明显降低(P<0.01)。微小RNA(miRNA)是广泛存在于动植物中由21-25个核苷酸构成非编码RNA。有学者研究表明miRNA与许多病理生理过程密切相关,它可识别特定的目的RNA,使之降解或表达下调,参与基因转录后水平调控,从而影响目的基因的蛋白质合成,在细胞分化、凋亡等生理活动中发挥重要的调控作用。本课题组使用双荧光素酶鉴定NLRP3和miR-223存在靶向关系。鉴于AA模型中以及AA模型腹腔巨噬细胞中NLRP3炎症小体各组分以及下游调控的各种炎症因子分泌异常,miR-223表达下调,本课题联系叁者的密切相关性,提出科学假设：AA发病中miR-223是否通过调控NLRP3炎症小体的表达从而影响下游细胞因子的分泌?miR-223能否具有缓解AA发病的靶向药物的前景?本课题鉴于Nlrp3以及miR-223的表达在大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7、THP-1细胞上存在共性,因此,本课题利用RAW264.7巨噬细胞株为工具细胞开展课题研究。研究内容主要包括以下四个部分：1.AA大鼠模型建立以及炎症因子检测从模型建立成功第12天开始,AA大鼠体重较Normal组明显减轻,继发性的足肿胀较Normal组明显增加,但从第28天开始,逐渐出现恢复迹象。病理组织学观察显示,AA大鼠与Normal组相比,滑膜明显增厚,由3-4层甚至更多层滑膜细胞组成,并向关节腔内伸展,骨组织及软骨组织有少量破坏,同时有大量炎性细胞浸润至关节组织,并有少量血管生成。ELISA结果显示,AA组与Normal组相比,血清中的IL-1β、IL-18、IL-22及IL-33的浓度明显升高。免疫细胞化学和免疫荧光检测发现,AA大鼠腹腔灌注提取的细胞呈CD68强阳性,表明提取的细胞为巨噬细胞。ELISA结果显示,AA组大鼠腹腔巨噬细胞上清液中IL-1β和IL-18的浓度明显高于Normal组；2. NLRP3炎症小体与miR-223在AA大鼠中的表达AA大鼠造模成功之后,取AA大鼠滑膜组织与Normal组滑膜组织用免疫组化方法检测,结果表明：AA大鼠滑膜组织中NIrp3、ASC、caspase-1阳性细胞数量明显高于Normal组,且差异具有统计学意义。real-time PCR和western bblot结果显示,AA大鼠腹腔巨噬细胞中NIrp3、ASC、caspase-1 mRNA和蛋白的水平明显高于Normal组,而miR-223表达则降低。提示NLRP3炎症小体与miR-223可能存在调节关联。3.巨噬细胞的筛选与NLRP3炎症小体在RAW264.7细胞株上调控炎症因子分泌本课题组使用LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞、THP-1细胞,ELISA结果显示,IL-1p和IL-18的含量明显高于正常组,real-time PCR结果提示,LPS诱导可以显着降低大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞、THP-1细胞中miR-223mRNA的水平,同时Nlrp3的mRNA和蛋白水平表达明显增加,其差异具有统计学意义。LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞、THP-1细胞在Nlrp3与miR-223表达上存在共性,因此本课题选用RAW264.7细胞作为工具细胞研究NLRP3炎症小体调控分泌下游炎症因子的分泌。本课题采用LPS、ATP、细胞外高K~+([High] K~+)刺激RAW264.7细胞后,ELISA结果显示,LPS、 ATP单独诱导即可增加细胞上清液中IL-1β、IL-18、IL-33的表达水平,LPS和ATP联合诱导后,IL-1β、 IL-18、IL-33的表达水平更高；而给以[High] K~+后,可明显减少细胞上清液中IL-1β、 IL-18、IL-33的表达；Western blot结果显示,单独给予LPS或ATP诱导以及同时给予LPS和ATP刺激,可显着增加细胞中Nlrp3、ASC、caspase-1蛋白的表达,而给以[High] K~+后,可以明显降低细胞中Nlrp3、ASC、caspase-1蛋白的表达。为了验证Nlrp3在炎症因子分泌过程中的关键作用,使用小RNA干扰技术,沉默nlrp3后,LPS、ATP刺激RAW264.7细胞,ELISA结果显示,沉默nlrp3后,可以明显减少细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达水平,但对IL-33的含量影响较小；real-time PCR和western blot结果显示,给予LPS、ATP诱导后,可显着升高Nlrp3、ASC、caspase-1 mRNA和蛋白的水平,其中以caspase-1增加尤为显着；沉默nlrp3后,NIrp3、ASC、caspase-1 mRNA和蛋白的表达水平降低。提示NLRP3炎症小体是调节炎症因子IL-1p和IL-18等分泌的重要因素。4.miR-223对NLRP3的调控作用为了验证miR-223和N h1rp3相互关系,我们使用双荧光素酶报告显示,miR-223和Nlrp3之间存在靶向关系。使用RAW264.7细胞为工具细胞,LPS诱导可降低正常细胞的miR-223的表达但增加Nlrp3的表达,瞬时转染miR-223 mimics(过表达组)后,可显着提升RAW264.7细胞中miR-223但降低Nlrp3的表达,与NC组相比,mimics组Nlrp3的]mRNA和蛋白水平明显降低；ELISA结果显示,LPS可显着增加RAW264.7细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达水平,转染miR-223 mimics后显着降低IL-1β和IL-18的水平,与NC组相比,mimics组IL-1β和IL-18的表达水平显着降低。LPS诱导可降低正常细胞的miR-223的表达但增加Nlrp3的表达,瞬时转染miR-223 inhibitor(低表达组)后,可显着降低RAW264.7细胞中miR-223但升高Nlrp3的表达,与NC组相比,miR-223 inhibitor组N1rp3的mRNA和蛋白水平明显升高；ELISA结果提示,LPS可明显提高RAW264.7细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达,转染miR-223 inhibitor后IL-1p和IL-18的水平显着升高,与NC组相比,inhibit组亦可显着增加IL-1β和IL-18的表达。为了验证miR-223靶向抑制NLRP3来调节下游炎症因子分泌,课题组瞬时转染mimics且同时沉默Nhp3后,可显着提升RAW264.7细胞中的miR-223但降低Nlrp3的表达；ELISA结果显示,LPS诱导可明显增加RAW264.7细胞上清液中IL-1p和IL-18的水平,转染miR-223 mimics并沉默nlrp3后,可显着降低IL-1p和IL-18的水平,与NC组相比,亦可显着降低IL-1β和IL-18的表达。提示miR-223可能通过调控NIrp3蛋白表达从而影响下游炎症因子分泌,可能是AA大鼠关节炎发病的一个重要环节之一。结论1.AA模型大鼠中miR-223及NLRP3表达异常。2. NLRP3炎症小体可能参与AA的发病过程,调控巨噬细胞炎症因子IL-1p和IL-18的分泌。3.miR-223可抑制NLRP3炎症小体,影响炎症因子IL-1p和IL-18的分泌,可能是AA发病的重要环节之一。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2016-03-01）
张小飞,杨倩[3]（2009）在《几种黏膜免疫佐剂对小肠树突状细胞、MHCⅡ类分子及核转录因子NF-kB的影响》一文中研究指出目的研究黏膜免疫佐剂在小肠局部的抗原递呈方式和信号转导途径。方法应用大鼠肠道原位结扎灌注模型观察大豆黄酮、CpGDNA和乳酸杆菌3种黏膜免疫佐剂对树突状细胞、MHCⅡ类分子和核转录因子NF-κB的影响。结果1)CpGDNA和乳酸杆菌能够显着增加小肠树突状细胞的面积,促进局部疫苗抗原的递呈;2)大豆黄酮、CpGDNA和乳酸杆菌能在24h内促进大鼠空肠MHCⅡ类分子的显着表达。提示黏膜免疫佐剂可能通过增强黏膜局部抗原递呈细胞的活性和MHCⅡ类分子的含量促进局部特异性免疫反应;3)CpGDNA可以在24h内显着增加细胞内NF-κB蛋白的含量,在0.25h作用最明显;乳酸杆菌在6h内可极显着增加NF-κB蛋白的表达;而大豆黄酮对细胞内NF-κB蛋白的含量作用不明显。结论提示细菌类佐剂CpGDNA和乳酸杆菌是通过活化NF-κB途径激发免疫活性细胞,大豆黄酮可能不通过该途径。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2009年05期）
张小飞,杨倩[4]（2008）在《几种黏膜免疫佐剂对小肠树突状细胞、MHC Ⅱ类分子及核转录因子NF-kB的影响》一文中研究指出为研究黏膜免疫佐剂在小肠局部的抗原递呈方式和信号转导途径,应用大鼠肠道原位结扎灌注模型观察大豆黄酮、CpG DNA和乳酸杆菌叁种黏膜免疫佐剂对树突状细胞、MHCⅡ类分子和核转录因子NF-κB的影响。结果发现:(1)CpG DNA和乳酸杆菌能够显着增加小肠树突状细胞的数量,促进局部疫苗抗原的递呈。(2)大豆黄酮、CpG DNA和乳酸杆菌能在24小时内促进大鼠空肠MHCⅡ类分子的显着表达。提示黏膜免疫佐剂可能通过增强强黏膜局部抗原递呈细胞的活性和MHCⅡ类分子的含量促进局部特异性免疫反应。(3)CpG DNA可以在24小时内显着增加细胞内NF-κB蛋白的含量,在0.25小时作用最明显;乳酸杆菌在6小时内可极显着增加NF-κB蛋白的表达;而大豆黄酮对细胞内NF-κB蛋白的含量作用不明显。提示细菌类佐剂CpG DNA和乳酸杆菌是通过活化NF-κB途径激发免疫活性细胞,大豆黄酮可能不通过该途径。(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十五次学术研讨会论文集》期刊2008-08-01）
陈锦锐[5]（2007）在《分子佐剂CpG、细胞因子对猪圆环病毒DNA疫苗的佐剂效应研究》一文中研究指出本研究用一段人工合成的CpG序列与猪圆环病毒PCVwhn株编码CAP蛋白的基因(ORF2)共同构建一种含CpG寡核苷酸的新型猪圆环病毒Ⅱ型基因疫苗(pcDNA-PCV-ORF2-CpG)。将5种猪细胞因子IL-2，IL-4，IL-6，IL-6/4，IFN-γ及含CpG寡核苷酸的真核表达质粒作为分子免疫佐剂，与本实验室保存的pcDNA-PCV-ORF2基因疫苗共同免疫仔猪，采用间接ELISA试验和流式细胞仪(FACS)分别对仔猪特异性抗PCV2抗体IgG和外周血T淋巴细胞亚类CD~3+、CD~4+、CD~8+的动态变化进行检测。以本试验室申请的大规模提取质粒的专利方法进行基因疫苗和分子佐剂的制备，并以壳聚糖进行包裹。将基因疫苗pcDNA-PCV-ORF2和6种分子佐剂pcDNA-PCV-ORF2-CpG，IL-2，IL-4，IL-6，IL-6/4，IFN-γ，按照1:1的比例以250μg和500μg两种剂量肌注免疫仔猪，检测仔猪的外周血中CD~3+、CD~4+、CD~8+T淋巴细胞数和仔猪血清中特异性PCV2血清抗体IgG动态变化。结果表明，pcDNA-PCV2-ORF2基因疫苗免疫仔猪后，特异性抗体和T淋巴细胞数显着升高，与对照组差异显着(P＜0.05)。pcDNA-PCV-ORF2-CpG组免疫仔猪后，外周血T淋巴细胞有明显的反应性，CD~3+T淋巴细胞数实验组高于对照组，差异极显着(P＜0.01)或显着(P＜0.05)。但是各佐剂试验组之间差异不显着(P＞0.05)。pcDNA-PCV-ORF2-CpG基因疫苗免疫仔猪后诱导仔猪产生了PCV2特异性抗体，与空载体及空白对照组相比，差异极显着(P＜0.01)；各佐剂试验组之间差异不显着(P＞0.05)。pcDNA-PCV-ORF2-CpG抗体水平高于pcDNA-PCV2-ORF2组，且持续时间长，大剂量组优于小剂量组。猪细胞因子佐剂组免疫仔猪后，细胞和体液水平都高于未加佐剂组和对照组，差异极显着(P＜0.01)或显着(P＜0.05)。细胞免疫方面IL-2，IFN-γ佐剂组的抗体水平要明显高于其他佐剂组，差异显著(P＜0.05)，IL-2和IFN-γ佐剂组的CD~3+T淋巴细胞数在免疫仔猪后第35d达到最高。而IL-4，IL-6，IL-6/4佐剂组在体液免疫方面表现出明显的佐剂效应，与空载体组和对照组差异显着(P＜0.05)。其中IL-6佐剂组的抗体水平升高快，持续的时间长(90d)。pcDNA-PCV2-ORF2基因疫苗和猪细胞因子共同免疫仔猪后诱导仔猪产生了良好的体液和细胞免疫应答。结果表明PCV2 DNA疫苗与以上佐剂的配合均能够诱导仔猪产生良好的体液和细胞免疫应答，以CpG和IL-6的免疫增强作用最佳，IL-6/4，IL-2，IL-4和IFN-γ次之，并且呈剂量相关性。本研究应用猪圆环病毒DNA疫苗和CpG及5种细胞因子为佐剂，以壳聚糖纳米载体包裹后，按不同剂量肌肉免疫仔猪，探讨了其体液和细胞免疫应答，旨在为PCV2基因疫苗的临床应用提供科学依据。应用CpG和5种细胞因子对PCV2的佐剂效应研究在国内外尚属首次报道。(本文来源于《四川农业大学》期刊2007-06-01）
贺晓菊,李大金,姚晓英,袁敏敏[6]（2007）在《分子佐剂C3d3通过促进脾脏B细胞高表达趋化因子受体CXCR4增强hCGβ基因疫苗体液免疫效应》一文中研究指出目的:探讨分子佐剂 C3d3与 hCGβ融合在基因免疫中增强抗 hCGβ体液免疫效应的机制。方法:分别用质粒 pCMV4-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ和 pCMV4免疫 BALB/c小鼠,间接 ELISA 法检测免疫小鼠外周血 IgG/IgA 类抗 hCG 抗体水平;ELISPOT 分析免疫鼠脾脏组织 ASCs IgG/IgA 抗体分泌水平;RT-PCR 筛查免疫鼠脾脏 B 细胞趋化因子受体表达,RT-PCR 和 FCM 分析 CXCR4 的表达水平;RT-PCR 和 ELISA 检测脾脏组织 CXCL12的表达水平。结果:pCMV4-hCGβ-C3d3免疫组外周血 IgG 类抗 hCG 抗体水平明显高于 pCMV4-hCGβ免疫组(P<0.05);而 IgA 类抗 hCG 抗体水平在两组间无明显差异。pCMV4-hCGβ-C3d3免疫组脾脏组织 ASCs 分泌 IgG 类抗体水平明显高于 pCMV4-hCGβ免疫组(P<0.05);两组间 ASCs 分泌 IgA 类抗体无明显差异.经 pCMV4-hCGβ、 pCMV4-hCGβ-C3d3免疫鼠脾脏 B 细胞 CXCR4表达明显高于对照组;且 pCMV4-hCGβ-C3d3免疫组明显高于 pCMV4-hCGβ免疫组(P<0.05).pCMV4-hCGβ-C3d3和 pCMV4-hCGβ组脾脏组织 CXCL12 表达均显着高于对照组。结论:分子佐剂 C3d3与 hCGβ基因融合,通过基因免疫小鼠后能够显着升调节脾脏 B 细胞 CXCR4表达水平,从而增强抗 hCGβ基因疫苗的体液免疫效应.(本文来源于《第一届中华医学会生殖医学分会、中国动物学会生殖生物学分会联合年会论文汇编》期刊2007-04-01）
贺晓菊,贺银燕,李大金,姚晓英,袁敏敏[7]（2006）在《分子佐剂C3d3通过促进脾脏B细胞高表达趋化因子受体CXCR4增强hCGβ基因疫苗体液免疫效应》一文中研究指出目的:探讨分子佐剂C3d3与hCGβ融合在基因免疫中增强抗hCGβ体液免疫效应的机制。本实验室既往构建了DNA避孕疫苗pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ,分别免疫BALB／c小鼠,能够在外周产生高效价抗hCG抗体,并且证实C3d3能够显着增强hCGβ基因疫苗特异性的体液免疫效应。(本文来源于《中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要》期刊2006-11-01）
殷中琼,贾仁勇,刘世贵[8]（2002）在《细胞因子作为分子佐剂在基因免疫中的作用》一文中研究指出细胞因子是体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一组具有广泛生物学活性的异质性肽类调节因子,在体内能激活和调节免疫活性细胞,对免疫应答的产生和调节具有重要作用,目前应用细胞因子作为免疫佐剂在基因治疗中的研究已有许多报道,本文将IL-2、IL-12和GM-CSF作为分子佐剂在基因免疫中的作用作一综述。(本文来源于《畜禽业》期刊2002年07期）
叶巍[9]（1999）在《以细胞因子为分子佐剂调节人类免疫缺陷病毒1型和猴免疫缺陷病毒DNA疫苗诱导的免疫应答》一文中研究指出已知DNA或核酸免疫能在体内诱导抗原特异性的体液和细胞免疫,而且应用分子佐剂如共刺激分子、细胞因子等可增强和调节这种免疫反应。本实验旨在进一步研究分子佐剂在机体免疫应答中的作用。为此,作者构建了表达人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和猴免疫缺陷病毒(SIV)gag/pol蛋白的DNA疫苗,并分别将编码Th1细胞因子IL-2、IL-12,Th-2细胞因子IL-4、IL-10和GM-CSF基因克隆到pcDNA3表达载体中,体外转染证实上述细胞因子可正常表达。然而,将(本文来源于《国外医学(微生物学分册)》期刊1999年06期）
细胞因子分子佐剂论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一个以关节滑膜炎症为特点的慢性自身免疫性疾病,它可以导致骨的侵蚀和关节的破坏,最后造成关节畸形,病因迄今仍未被阐明。RA的发病与炎症密切相关,异常的细胞免疫反应和体液免疫反应在疾病发病中起着重要作用。有学者研究表明巨噬细胞在RA发病中至关重要。固有免疫反应是机体防御病原体的第一道防线,炎症小体作为固有免疫的重要组成部分,主要通过模式识别受体(pattern recognization receptors, PRRs)来识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),从而产生免疫应答。PRRs包括位于细胞膜的Toll样受体(TLRs)、位于细胞质的NOD样受体(NLRs)、C型凝集素受体(CLRs)等。NLRP3炎症小体是迄今为止研究最为广泛的由NLR家族组成的炎症小体之一,参与炎症、肿瘤的发病,也在正常生理稳态维持过程中起到重要的作用。佐剂性关节炎(AA)大鼠模型是最为经典的RA动物模型之一,本课题在前期研究中发现,AA模型大鼠血清以及腹腔巨噬细胞体外培养的细胞上清液中IL-1β、 IL-18等炎症因子分泌明显增加(P<0.01)。使用免疫组织化学方法测得AA大鼠滑膜组织中NLRP3炎症小体的叁个组分NIrp3、ASC、caspase-1均明显提高(P<0.01)。提示NLRP3炎症小体可能参与AA大鼠的发病。与此同时,前期研究发现AA大鼠腹腔巨噬细胞中的NLRP3炎症小体组分表达增加的同时(P<0.01)而miR-223表达明显降低(P<0.01)。微小RNA(miRNA)是广泛存在于动植物中由21-25个核苷酸构成非编码RNA。有学者研究表明miRNA与许多病理生理过程密切相关,它可识别特定的目的RNA,使之降解或表达下调,参与基因转录后水平调控,从而影响目的基因的蛋白质合成,在细胞分化、凋亡等生理活动中发挥重要的调控作用。本课题组使用双荧光素酶鉴定NLRP3和miR-223存在靶向关系。鉴于AA模型中以及AA模型腹腔巨噬细胞中NLRP3炎症小体各组分以及下游调控的各种炎症因子分泌异常,miR-223表达下调,本课题联系叁者的密切相关性,提出科学假设：AA发病中miR-223是否通过调控NLRP3炎症小体的表达从而影响下游细胞因子的分泌?miR-223能否具有缓解AA发病的靶向药物的前景?本课题鉴于Nlrp3以及miR-223的表达在大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7、THP-1细胞上存在共性,因此,本课题利用RAW264.7巨噬细胞株为工具细胞开展课题研究。研究内容主要包括以下四个部分：1.AA大鼠模型建立以及炎症因子检测从模型建立成功第12天开始,AA大鼠体重较Normal组明显减轻,继发性的足肿胀较Normal组明显增加,但从第28天开始,逐渐出现恢复迹象。病理组织学观察显示,AA大鼠与Normal组相比,滑膜明显增厚,由3-4层甚至更多层滑膜细胞组成,并向关节腔内伸展,骨组织及软骨组织有少量破坏,同时有大量炎性细胞浸润至关节组织,并有少量血管生成。ELISA结果显示,AA组与Normal组相比,血清中的IL-1β、IL-18、IL-22及IL-33的浓度明显升高。免疫细胞化学和免疫荧光检测发现,AA大鼠腹腔灌注提取的细胞呈CD68强阳性,表明提取的细胞为巨噬细胞。ELISA结果显示,AA组大鼠腹腔巨噬细胞上清液中IL-1β和IL-18的浓度明显高于Normal组；2. NLRP3炎症小体与miR-223在AA大鼠中的表达AA大鼠造模成功之后,取AA大鼠滑膜组织与Normal组滑膜组织用免疫组化方法检测,结果表明：AA大鼠滑膜组织中NIrp3、ASC、caspase-1阳性细胞数量明显高于Normal组,且差异具有统计学意义。real-time PCR和western bblot结果显示,AA大鼠腹腔巨噬细胞中NIrp3、ASC、caspase-1 mRNA和蛋白的水平明显高于Normal组,而miR-223表达则降低。提示NLRP3炎症小体与miR-223可能存在调节关联。3.巨噬细胞的筛选与NLRP3炎症小体在RAW264.7细胞株上调控炎症因子分泌本课题组使用LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞、THP-1细胞,ELISA结果显示,IL-1p和IL-18的含量明显高于正常组,real-time PCR结果提示,LPS诱导可以显着降低大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞、THP-1细胞中miR-223mRNA的水平,同时Nlrp3的mRNA和蛋白水平表达明显增加,其差异具有统计学意义。LPS诱导大鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞、THP-1细胞在Nlrp3与miR-223表达上存在共性,因此本课题选用RAW264.7细胞作为工具细胞研究NLRP3炎症小体调控分泌下游炎症因子的分泌。本课题采用LPS、ATP、细胞外高K~+([High] K~+)刺激RAW264.7细胞后,ELISA结果显示,LPS、 ATP单独诱导即可增加细胞上清液中IL-1β、IL-18、IL-33的表达水平,LPS和ATP联合诱导后,IL-1β、 IL-18、IL-33的表达水平更高；而给以[High] K~+后,可明显减少细胞上清液中IL-1β、 IL-18、IL-33的表达；Western blot结果显示,单独给予LPS或ATP诱导以及同时给予LPS和ATP刺激,可显着增加细胞中Nlrp3、ASC、caspase-1蛋白的表达,而给以[High] K~+后,可以明显降低细胞中Nlrp3、ASC、caspase-1蛋白的表达。为了验证Nlrp3在炎症因子分泌过程中的关键作用,使用小RNA干扰技术,沉默nlrp3后,LPS、ATP刺激RAW264.7细胞,ELISA结果显示,沉默nlrp3后,可以明显减少细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达水平,但对IL-33的含量影响较小；real-time PCR和western blot结果显示,给予LPS、ATP诱导后,可显着升高Nlrp3、ASC、caspase-1 mRNA和蛋白的水平,其中以caspase-1增加尤为显着；沉默nlrp3后,NIrp3、ASC、caspase-1 mRNA和蛋白的表达水平降低。提示NLRP3炎症小体是调节炎症因子IL-1p和IL-18等分泌的重要因素。4.miR-223对NLRP3的调控作用为了验证miR-223和N h1rp3相互关系,我们使用双荧光素酶报告显示,miR-223和Nlrp3之间存在靶向关系。使用RAW264.7细胞为工具细胞,LPS诱导可降低正常细胞的miR-223的表达但增加Nlrp3的表达,瞬时转染miR-223 mimics(过表达组)后,可显着提升RAW264.7细胞中miR-223但降低Nlrp3的表达,与NC组相比,mimics组Nlrp3的]mRNA和蛋白水平明显降低；ELISA结果显示,LPS可显着增加RAW264.7细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达水平,转染miR-223 mimics后显着降低IL-1β和IL-18的水平,与NC组相比,mimics组IL-1β和IL-18的表达水平显着降低。LPS诱导可降低正常细胞的miR-223的表达但增加Nlrp3的表达,瞬时转染miR-223 inhibitor(低表达组)后,可显着降低RAW264.7细胞中miR-223但升高Nlrp3的表达,与NC组相比,miR-223 inhibitor组N1rp3的mRNA和蛋白水平明显升高；ELISA结果提示,LPS可明显提高RAW264.7细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达,转染miR-223 inhibitor后IL-1p和IL-18的水平显着升高,与NC组相比,inhibit组亦可显着增加IL-1β和IL-18的表达。为了验证miR-223靶向抑制NLRP3来调节下游炎症因子分泌,课题组瞬时转染mimics且同时沉默Nhp3后,可显着提升RAW264.7细胞中的miR-223但降低Nlrp3的表达；ELISA结果显示,LPS诱导可明显增加RAW264.7细胞上清液中IL-1p和IL-18的水平,转染miR-223 mimics并沉默nlrp3后,可显着降低IL-1p和IL-18的水平,与NC组相比,亦可显着降低IL-1β和IL-18的表达。提示miR-223可能通过调控NIrp3蛋白表达从而影响下游炎症因子分泌,可能是AA大鼠关节炎发病的一个重要环节之一。结论1.AA模型大鼠中miR-223及NLRP3表达异常。2. NLRP3炎症小体可能参与AA的发病过程,调控巨噬细胞炎症因子IL-1p和IL-18的分泌。3.miR-223可抑制NLRP3炎症小体,影响炎症因子IL-1p和IL-18的分泌,可能是AA发病的重要环节之一。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
细胞因子分子佐剂论文参考文献
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