（1广东省第二人民医院神经外科广东广州510317）
（2广东省妇幼保健院广东广州511400）
【摘要】目的：研究藤黄酸对胶质瘤细胞A172细胞活性及增殖的影响并探讨其作用机制。方法：体外培养胶质瘤细胞A172，使用四甲基偶氮噻唑蓝实验（MTT）实验法探讨藤黄酸对A172细胞的活性影响；Westernblot检测蛋白激酶B（Akt）、p53、Bcl-2及Caspase-3的蛋白水平。结果：MTT实验表明藤黄酸具有抑制胶质瘤A172细胞活性的作用（P<0.05），并与剂量、时间呈正关系；藤黄酸可抑制Akt、Bcl-2蛋白表达，且诱导Caspase-3、p53的活化，具有统计学差异（P<0.05）。结论：藤黄酸具有抑制A172细胞活性及增殖，并诱导凋亡的作用，藤黄酸对胶质瘤细胞A172的促凋亡作用，可能通过Akt途径的失活所介导的。
【关键词】胶质瘤；藤黄酸；凋亡
【中图分类号】R739.4【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）18-0170-03
神经胶质瘤是常见的中枢神经系统常见的原发性恶性肿瘤之一，其无控性增殖及抗凋亡所引起的“耐药效应”限制了综合手段根治的可能，目前临床疗效差。因此，寻找高效低毒性的抗癌药物以及辅助药物是当前胶质瘤研究的重要内容之一。藤黄具有抗肿瘤作用，在临床上用于治疗乳腺癌、淋巴肉瘤、皮肤癌均取得一定疗效[1]。研究证实藤黄抗癌的有效成分为藤黄酸（Gambogicacid，GA）。近年来人们对藤黄酸的抗肿瘤作用进行了较为广泛而深入的研究，表明藤黄酸不论在体外还是在体内均能有效抑制多种肿瘤的生长。然而藤黄酸在胶质瘤中的抗肿瘤作用研究仍处在初步探索阶段。本研究使用胶质瘤细胞A172为研究模型，探讨藤黄酸对胶质瘤的细胞活性和增殖抑制作用，为藤黄酸治疗胶质瘤开发、利用提供实验依据。
1.材料与方法
1.1主要材料
1.1.1细胞系人胶质瘤细胞株A172，购自中国科学院上海细胞库。
1.1.2试剂藤黄酸（生物专用分子式C38H44O8相对分子量628.75，白色至类白色粉末）购自阿拉丁公司，用DMSO（购自Sigma公司美国）溶解，母液浓度为100umol/L（4℃储存）。实验前用含8～10％FBS的培养液稀释成终浓度为1.0、2.0、4.0和8.0umol/L。HighGluDMEM培养液及胎牛血清购自美国Hyclone公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）、β-actin一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠/兔IgG(H+L)二抗、预染彩色蛋白质分子质量标准，购自上海碧云天公司；兔抗人Akt一抗、购自美国CellSignaling生物技术公司；兔抗人野生型p53、Cleaced-Caspase-3一抗购自美国CellSignalingTechnology公司；鼠抗人Bcl-2一抗购自美国SantaCruz生物技公司。
1.1.3仪器与设备恒温CO2培养箱；酶标仪；超净工作台等。
1.2方法
1.2.1细胞培养A172细胞采用含8～10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，常规培养于含5%CO2的37℃恒温细胞培养箱中，0.25%胰酶消化传代。
1.2.2四甲基偶氮噻唑蓝实验（MTT）常规培养A172细胞，选择处于对数生长期、状态良好的细胞使用胰酶消化，用含10%FBS高糖培养液稀释成浓度为0.6×104/ml的细胞液，混匀后接种于96孔板(每组设6个重复)，每孔100ul细胞液，12h后显微镜下观察细胞贴壁良好，吸去培养液，加入200ul含有终浓度分别为1.0、2.0、4.0和8.0mmol/L藤黄酸的培养液，对照组加入等量的新鲜培养液，设定空白对照组。分别培养24、48和72h后加入浓度为5g/LMTT溶液20ul（空白对照不加入MTT溶液），继续培养4h后，吸去培养液，各孔加入100ulDMSO，室温振荡10min，使用酶标仪上选择595nm波长测定各孔的光密度值OD，计算各组的平均OD值，根据公式：细胞生长抑制率(IR)%=[(对照组OD－加药组OD)/(对照组OD－空白组OD)]×100％
1.2.3蛋白印迹检测实验（Westernblot）常规收集48h不同浓度的藤黄酸处理过的细胞，使用LysisBuffer细胞裂解液（含PMSF）裂解细胞，提取细胞总蛋白，用BCA试剂测定蛋白浓度，进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，260mA电流湿法转NC膜，5%脱脂牛奶封闭，加入一抗4℃孵育12h，抗体稀释浓度为Akt及p53(1:500）、Caspase-3（1:1000）、Bcl-2（1:1000）、β-actin（1:1000），加入对应二抗溶液，室温孵育1.5h，化学发光试剂盒显影，Bio-Rad凝胶成像系统扫描光密度值，根据分子量选择曝光时间，QuantityOne软件分析。
1.3统计分析
应用SPSS22.0统计软件进行相关性分析，计量资料数据以x-±s表示，两组间差异用t检验进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1藤黄酸抑制A172细胞的活性及增殖能力
采用不同浓度、不同作用时间的藤黄酸（实验组）与阴性对照组比较，两者OD值均降低，差异均有显著意义（P<0.05）；同一作用时间点，随着藤黄酸浓度的增高，OD值降低，呈剂量依赖关系。见表1
3.讨论
藤黄酸已被发现对多种肿瘤表现较强的抗肿瘤活性作用，且在有效剂量范围内，毒副作用反应相对小，对癌细胞的抑制作用具有选择性，能选择性杀死癌细胞，且对正常细胞影响甚小，具有较为广泛应用前景。
近年来的研究发现：PI3K/Akt通路对肿瘤的发生、发展至关重要；其发挥作用的主要方式是：影响肿瘤细胞能量代谢及生长、增殖能力，抑制凋亡发生，影响肿瘤细胞侵袭能力。PI3K/Akt信号转导通路参与调节细胞凋亡、增殖、分化和代谢等一系列生理活动[2]。研究表明，PI3K/Akt通路与肿瘤的发生、发展、转移和治疗耐药性密切相关，Akt蛋白的过度活化可使细胞发生恶性转化：Akt在卵巢癌、乳腺癌细胞中可引起细胞的运动、迁移、粘附、侵袭；PTEN的突变、失活可导致细胞内Akt/PI3K通路活化状态的改变，与恶性肿瘤的多种生物学行为相关，是继Rb、p53以来最有影响的抑癌基因。肿瘤细胞的浸润和转移是恶性肿瘤最普遍的本质特征，而胶质瘤容易发生早期转移，研究证实细胞浸润和转移抑制基因KAI1和KAI1-mRNA表达在GA处理的U251细胞中明显增加。GA不影响凋亡相关蛋白Bax和p72/73的表达，但影响CyclinD1的表达。然而，相关研究报道，表明GA对U251细胞的促凋亡作用是通过Akt途径的失活所介导的[1]，可能GA有效地抑制表皮生长因子受体EGFR的表达水平，并减少Akt(T308)和GSK3β(S9)的磷酸化，但这一结论仍需进一步探讨。
本研究通过MTT实验初步证实了，藤黄酸对胶质瘤细胞A172细胞活性及增殖具有抑制作用，并且与时间、剂量呈正相关关系。近年来国外研究表明，GA可以抑制人胶质瘤U251细胞的贴壁能力，抑制期生长，诱导U251细胞周期阻滞；通过Westernblot实验，观察到Bcl-2的蛋白表达量，随着藤黄酸的剂量递增而下降，而p53、Caspase3的蛋白表达则呈升高。提示藤黄酸诱导野生型p53、caspase-3的活化和抑制抗凋亡基因Bcl-2的过程中起了重要作用。这对胶质瘤疾病的基础研究和临床治疗都具有重要的参考意义，为藤黄酸的临床应用和进一步开发打下实验基础。
【参考文献】
[1]ChengH，SuJJ，PengJY，etal．GambogenicacidinhibitsproliferationofA549cellsthroughapoptosisinducingthroughup-regulationofthep38MAPKcascade[J].JAsianNatProdRes，2011，13(11):993-1002．
[2]EveraertBR,VanCE,HoymansVY,etal.Currentperspectiveofpathophysiologicalandinterwentionaleffectsonendothelialprogenitorcellbiology:FocusonPI3K/AKT/eNOSpathway.InternationalJournalofCardiology.2014,144(3):350-366.
基金项目：2014年度广东省医学科研基金立项课题（编号：A2014156）、2014年度广东省省级科技计划项目（编号：2014A020212405）及2015年度广东省自然科学基金项目（编号：2015A030313722）
作者简介：朱明华（1982年5月），男，汉族，广东化州，硕士研究生，主治医师，研究方向：神经肿瘤
通讯作者：张勇（1964年7月），男，汉族，湖南衡阳，博士研究生，主任医师，研究方向：神经肿瘤外科