一、Effects of hCD80-Adenovirus on B16-F10 Cells（论文文献综述）
林旋[1]（2020）在《口蹄疫疫苗抗原的稳定策略及新佐剂的设计》文中认为安全、有效和稳定的抗原和佐剂是疫苗研究的重点和难点。本课题面向灭活口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）抗原易发生裂解导致免疫活性降低的问题,对影响灭活病毒颗粒结构稳定性和免疫活性的因素和规律进行了深入分析,提出利用过渡金属离子和离子液体（Ionicliquids,ILs）增强病毒衣壳蛋白五聚体界面相互作用、避免颗粒解聚提高其稳定性的新策略;并将抗原的稳定策略和佐剂设计相结合,设计和制备了基于离子液体的新型O/IL纳米乳液,提升了 FMDV疫苗的稳定性和免疫应答,并将研究结果拓展应用于流感裂解疫苗佐剂的设计。主要研究结果和创新点如下:（1）发现过渡金属离子Ni2+和Cu2+与146S（即结构完整的FMDV）能发生特异性结合,且结合规律不同于非过渡金属离子Ca2+。通过等温滴定量热、微量热泳动分析、以及ICP-MS分析,发现Ni2+、Cu2+和Ca2+三种离子均能与FMDV发生焓驱动的自发性结合,即ΔG＜0,ΔH＜0、ΔS＜0。其中Cu2+与146S结合亲和力最大;Ni2+和Cu2+在146S上的结合数量为Ca2+的10倍以上。（2）利用过渡金属离子的结合提高146S的稳定性和免疫活性,并对其机理进行分析。发现Ni2+、Cu2+、Ca2+与146S的结合均能提高抗原的热稳定性,其中Cu2+稳定效果最显着;此外,Ni2+和Cu2+的结合还能提高146S的耐酸稳定性,而Ca2+的结合则不利于颗粒的耐酸稳定性。提出了过渡金属离子与146S五聚体界面相邻组氨酸间通过配位作用形成“过渡金属离子桥”而稳定146S结构的机理。采用结合了 Ni2+或Cu2+的146S对小鼠进行免疫,发现比单一的146S能产生更高的抗体滴度。通过146S与细胞表面受体整合素β6和硫酸乙酰肝素的亲和力实验,表明Cu2+的结合使抗原与两种受体的亲和力分别提高了 3倍和10倍。（3）采用胆碱型离子液体调节146S微环境的质子强度,提高抗原的稳定性。发现胆碱型离子液体[Cho][Cl]和[Cho][SO4]可将146S的颗粒热变性温度Tm1值提高4℃;而[Cho][H2PO4]则降低了 146S的热稳定性。通过分析不同离子液体对146S颗粒微环境pH值的影响,提出了[Cho][Cl]和[Cho][SO4]通过降低146S周围微环境的质子强度,而抑制146S颗粒五聚体交界处组氨酸的质子化从而稳定146S的机理。小鼠免疫实验表明添加[Cho][Cl]和[Cho][SO4]对146S的体内免疫活性无显着影响。（4）构建了基于离子液体的O/IL纳米乳液,并用于FMDV疫苗注射免疫佐剂,提高了机体的体液免疫应答。将胆碱型离子液体的阴离子替换为具有生物学活性的烟酸,构建了离子液体[Cho][nicotinic]（CANI）,并以该离子液体替代水相、以角鲨烯为油相、Tween80为表面活性剂制备出粒径约为160nm的均一、稳定的O/IL纳米乳液。与市售乳液佐剂ISA-206相比,O/IL乳液能显着提高146S的稳定性,用于FMDV疫苗注射免疫佐剂能显着增强机体的体液免疫应答,产生与使用ISA-206佐剂相当的IgG滴度。（5）将O/IL纳米乳液用于H1N1型流感裂解疫苗的注射和鼻黏膜免疫佐剂,均展现出很好的佐剂效应。将O/IL纳米乳液用于H1N1的注射免疫佐剂,产生的IgG滴度显着高于MF59佐剂;用于H1N1的鼻黏膜免疫佐剂,在增强的黏膜免疫应答的同时,还能提高体液和细胞免疫应答,产生的sIgA、IgG滴度和IFN-γ水平均显着高于使用MF59佐剂。O/IL乳液提高鼻黏膜免疫应答效果的作用机制包括:延长HA在鼻腔的停留时间,促进鼻黏膜相关淋巴组织中DC细胞和CD4+T细胞的增殖。
张斌[2]（2016）在《脐带MSC来源exosome在皮肤组织再生中的作用及机制》文中进行了进一步梳理目的：烧烫伤是日常生活常见的一种创伤,具有高发病率和死亡率；有报道证实脐带间质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSC）加速损伤皮肤的创面愈合,然而MSC的保存、运输及安全性等问题限制了其临床应用；外泌体（exosome）是hucMSC旁分泌的主要成分,hucMSC-exosome（hucMSC-Ex）在皮肤组织再生中的作用尚未报道。本研究旨在探明hucMSC-Ex促进深Ⅱ度烫伤的修复作用以及阐明exosome促进皮肤再生过程中信号转导的机制。方法：贴壁法分离培养hucMSC细胞,蔗糖密度梯度离心法分离hucMSC-Ex,通过Western blot分析hucMSC-Ex表面标记CD63>CD81和CD9的表达,透射电镜观察hucMSC-Ex形态和大小,Nanosight可视型纳米颗粒分析仪检测hucMSC-Ex的直径分布情况。80℃热水烫伤8s制作SD大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤模型并应用hucMSC-Ex治疗,通过创面大体、HE染色、PCNA和CK19的组织化学染色等方法分析其修复效果；Western blot检测Bcl-2、Bax表达和流式细胞术Annexin V/PI双染等技术分析细胞凋亡；细胞计数检测细胞增殖；划痕实验分析细胞的迁移；流式细胞术PI染色分析细胞周期；通过P13K的抑制剂LY294002证明AKT通路在hucMSC-Ex促进皮肤组织再生中的作用；通过β-catenin抑制剂ICG001证明Wnt/β-catenin信号的作用；应用慢病毒载体介导的shRNA干扰hucMSC-Ex及hucMSC中的Wnt4验证其在深度烫伤修复中作用。应用免疫组化和免疫荧光检测皮肤组织中CK15、CK19、Integrin a6、CD44、Oct4及Nanog的表达,以标记干细胞的数量；定量RT-PCR检测皮肤组织中胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达,Masson染色分析组织中胶原的沉积,皮肤组织和真皮细胞α-SMA的免疫荧光检测真皮成纤维细胞（DFL）向纤维母细胞的分化；免疫荧光和细胞核质蛋白分离检测分析β-catenin和YAP在细胞中定位；TopFlash检测β-catenin的转录活性,YAP-TEAD4荧光素酶报告基因系统检测YAP的转录活性；流式细胞术分析CD44在DFL细胞的表达情况；定量RT-PCR分析YAP的靶基因CTGF及Cy61的]mRNA表达；免疫组化检测p-YAP和YAP在皮肤组织中的表达和定位；将YAP的Ser127和LATS的Thr1079位点突变为丙氨酸,以证明此磷酸化位点的功能：液相质谱分析（LC/MS）分析hucMSC-Ex内14-3-3ζ等成分,shRNA敲减14-3-3ζ、α-catenin、YAP、LATS 1/2等分子,腺病毒过表达14-3-3ζ和YAP,以证明它们的功能；通过免疫共沉淀技术（IP）检测14-3-3ζ、YAP、p-LATS等蛋白间相互作用。结果：成功分离得到hucMSC-Ex,电镜观察其形态为球形,Nanosight分析其直径为100nm左右,表达CD63、CD81和CD9等标记；成功建立SD大鼠皮肤深ⅡI度烫伤模型,hucMSC-Ex加快深Ⅱ度烫伤皮肤创面愈合,促进皮肤组织细胞的增殖和表皮的再生化,同时促进皮肤组织胶原的合理分布；hucMSC-Ex逆转热激损伤引起的细胞凋亡,促进体外细胞扩增；对MAPK通路和AKT通路的筛检发现,hucMSC-Ex显着地的活化AKT信号通路,Luminex检测发现hucMSC-Ex中存在包括VEGF等多种可能活化AKT信号的细胞因子；P13K的抑制剂LY294002可以逆转hucMSC-Ex对细胞凋亡的降低作用,但没有改变hucMSC-Ex对皮肤细胞周期和细胞迁移的促进作用：进一步研究表明,hucMSC-Ex可以活化Wnt/β-catenin信号,并且β-catenin的抑制剂ICG001逆转hucMSC-Ex对皮肤损伤的修复作用；将hucMSC-Ex中的Wnt4敲减后（Wnt4-shRNA-Ex）,hucMSC-Ex促进皮肤细胞分裂、迁移和加速深Ⅱ度烫伤创面愈合的作用消失。对exosome治疗深Ⅱ度烫伤模型长期观察可以发现,hucMSC-Ex对皮肤细胞增殖和β-catenin活化呈现先促进后抑制的现象,同时发现hucMSC-Ex在修复的后期限制皮肤干细胞的扩增、真皮细胞中α-SMA的表达和胶原ⅢⅢ1的沉积；体外研究发现,hucMSC-Ex对细胞增殖和β-catenin入核的抑制作用依赖于高细胞密度培养条件,hucMSC-Ex抑制在此培养条件下生长的DFL中a-SMA表达和胶原的沉积;进一步研究发现,hucMSC-Ex通过促进YAP的磷酸化而诱导YAP的胞质内滞留,hucMSC-Ex对β-catenin抑制作用依赖于YAP Ser127位点的磷酸化；对hucMSC-Ex的液相质谱分析（LC/MS）发现14-3-3ζ,此蛋白在Hippo通路中有调控作用,hucMSC-Ex中敲减14-3-3ξ的表达逆转了hucMSC-Ex对YAP Serl27位点磷酸化的促进作用和体外细胞增殖抑制作用,hucMSC-Ex中过表达14-3-3ζ得到相反结果；将细胞中LATS干扰后或者将LATSThr1079位点突变后,14-3-3ζ对YAP磷酸化的促进作用降低；14-3-3ζ、YAP、p-LATS三者可以形成复合物,YAP与其上游激酶p-LATS的结合依赖于14-3-3ζ蛋白；应用14-3-3ζ敲减的hucMSC-Ex（shl4-3-3ζ-Ex）治疗深度烫伤模型发现,sh14-3-3ζ-Ex比对照exosome表现出更强的促增殖能力,修复后皮肤组织表皮层异常增厚、附属结构较少、纤维母细胞的分化和胶原沉积增多。结论：HucMSC-Ex通过转运Wnt4活化皮肤的β-catenin信号促进皮肤深Ⅱ烫伤模型的修复；hucMSC-Ex中介导的14-3-3ζ通过加强Hippo-YAP通路协调自身Wnt4信号,预防损伤后皮肤组织过度增生和疤痕形成。
查兵兵[3]（2013）在《调节性淋巴细胞在Graves病发病中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分调节性B细胞在Graves病发病中的作用及机制研究（一）Graves病患者外周血调节性B细胞的表型鉴定及数量分析[目的]通过体外实验确定Graves病患者外周血调节性B细胞归属的亚群,比较Graves病患者和健康志愿者外周血调节性B细胞亚群数量的差异；[方法]本课题组自2011年2月至2011年11月在内分泌科门诊及病房入选Graves病初发患者15例、病情控制患者19例、健康志愿者36例。收集受试者外周血,分离外周血单个核细胞,加入CpG+PIB培养5小时,流式细胞仪检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD19-IL-10调节性B细胞的百分含量；流式细胞分选仪分选CD19+B淋巴细胞,Real-Time PCR检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+B淋巴细胞的IL-10mRNA表达水平的差异；比较IL-10+及IL-10-外周血单个核细胞各种分化抗原标志（CD19、CD24、CD38、IgM、IgD、CD5、CD10、 CD27、CD1d）银光强度的差异,确定Graves病患者外周血调节性B细胞归属的亚群,并用流式细胞仪检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血调节性B细胞亚群百分含量的差异；[结果]Graves病初发患者外周血CD19-IL-10+调节性B细胞百分含量及IL-10mRNA表达水平比病情控制患者和健康人明显减少（P<0.05）；Graves病患者外周血CD19+CD24+CD27-B细胞亚群属于调节性B细胞,Graves病初发患者外周血CD19-CD24biCD27+B细胞百分含量比病情控制患者和健康人明显减少（P<0.05）。[结论]Graves病患者外周血CD19-IL-10调节性B细胞和ICD19-CD2biCD27-B细胞亚群的百分含量较病情控制患者和健康人明显减少,这表明调节性B细胞在Graves病的发病中可能起到了一定作用。（二）Graves病患者外周血调节性B细胞的功能分析及机制研究[目的]比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞对CD4+T细胞免疫抑制功能的差异,并探讨其发挥免疫抑制作用的途径；[方法]本课题组自2011年7月至2011年12月在内分泌科门诊及病房入选初发患者6例、病情控制患者6例、健康自愿者6例。收集受试者外周血,分离纯化的外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞及CD4+T细胞共培养,培养液中加入CpG.CD40L和抗-CD3共培养5天,最后6小时加入PIB, BrdU ELISA方法检测Graves病患者和健康志愿者外周血CD4+T细胞增殖水平,流式细胞仪检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD4+IFN-γ-和CD4+TNF-α‘百分含量的差异；在共培养体系中加入IL-10抗体,探讨IL-10在CD19+CD24hiCD27’B细胞发挥免疫抑制功能中所起的作用；流式细胞仪检测共培养体系中CD4+CD25hiCD127loFoxp3+调节性T细胞含量,探讨调节性T细胞在CD19+CD24hiCD27+B细胞发挥免疫抑制功能中所起的作用；[结果]与健康志愿者比较,Graves病初发和病情控制患者CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌IL-10明显减少（P<0.05）,Graves病初发和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群对CD4*T细胞增生和分泌IFN-γ、TNF-α的抑制作用明显减弱（P<0.05）。外周血中CD19+CD24hiCD27+B细胞通过IL-10抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ,但不通过IL-10抑制CD4+T细胞增生和CD4+T细胞分泌TNF-α;和健康志愿者比较,Graves病初发和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群诱导产生CD4+CD25hiCD127loFoxD3+调节性T细胞的数量减少导致其免疫抑制功能下降。[结论]Graves病初发和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞免疫抑制功能较健康人明显减少,这表明调节性B细胞在Graves病的发生、发展过程中可能起到了一定作用。病情控制的患者CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群的免疫抑制功能仍明显低于正常人,这说明目前临床常用的药物能使Graves病患者本身的免疫缺陷部分改善,但不能得以完全恢复。第二部分调节性T细胞在Graves病发病中的作用[目的]通过对不同阶段Graves病患者外周血中淋巴细胞亚群数量以及CD4+CD25+调节性T细胞功能的测定,研究调节性T细胞在Graves病发病中的作用。[方法]采集初发、病情控制的Graves病患者组以及健康人组等3组人群的外周血。流式细胞仪检测各淋巴细胞亚群的百分率,Real-Time PCR检测外周血单个核细胞的Foxp3mRNA;免疫磁珠体外分离CD4+CD25+调节性T细胞,应用MTT法检测其对CD4+CD25-T细胞的免疫抑制功能。[结果]和健康人相比,Graves病初发患者外周血中的CD3+CD4+T和CD3-CD19+B细胞均显着增加（P<0.05）；CD3-CD16+CD56+NK细胞则显着减少（P<0.05）；而病情控制患者各淋巴细胞亚群无明显变化。Graves病初发和病情控制患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数量及Foxp3mRNA表达水平和健康人之间虽无明显变化,但他们的免疫抑制功能明显下降,其中初发患者调节性T细胞的免疫抑制功能比病情控制患者明显下降（P<0.05）。[结论]Graves病患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞免疫抑制功能的减弱导致CD4+T淋巴细胞增殖的失控可能是Graves病的发病原因；经药物治愈患者调节性T细胞的免疫抑制功能难以完全恢复正常可能与Graves病容易复发有关。
顾建友[4]（2009）在《禽白细胞介素2功能域鉴定及与其受体的相互作用研究》文中提出白细胞介素2（IL-2）是一种重要的免疫调节细胞因子,在淋巴细胞的生长与分化等方面起着重要的作用。本研究中,利用原核表达的重组鸡IL-2（cIL-2）单体蛋白作为抗原制备了一组抗cIL-2的单克隆抗体（mAb）,对具有抑制cIL-2依赖的T淋巴母细胞增殖作用的mAbs进行了表位重叠合成肽扫描和噬菌体表面展示技术分析,结果显示：抗cIL-2单抗所识别的表位均为构象表位,它们的模拟表位分别为KIELPSL、EHLDXNDSLYL、NHLXGXY、WHLPPSL、EFKASXL、TENPFPE、SGLYL、AHGYWEL和HHGYWEL。利用Clustal W序列比对和合成肽竞争ELISA鉴定了其相应的天然表位组成,并据此将其天然表位划分为三个功能域：N26K27I28H29L30E31L32P35Q43Q44T45L46Q47C48Y49L50（功能域Ⅰ）、E68E69F70K79K82S83L84T85G86L87（功能域Ⅱ）和N88H89G91K104F105P106D107E111L112Y118L119（功能域Ⅲ）。淋巴细胞增殖试验显示三个功能域的多肽在体外具有促进活化T淋巴母细胞增殖的作用。通过同源建模方法构建了cIL-2蛋白的三维模拟结构,将其功能域Ⅰ定位于A-B环（包括部分的beta折叠A）和螺旋B的N端部分；功能域Ⅱ主要定位于螺旋C；功能域Ⅲ定位于C-D环（包括部分的beta折叠B）和螺旋D中。利用噬菌体展示技术和合成肽竞争ELISA方法,鉴定了4株具有抑制鸭IL-2（dIL-2）依赖的T淋巴母细胞增殖作用的抗dIL-2 mAbs的结合表位。这些mAbs所识别的表位均为构象表位,其模拟表位分别为LVXGSMPS、KPHKHHXHHSHM、HVPNERYPLR和WXXXKAKP。Clustal W序列比对分析获得了其相应的天然表位组成,分别为L13I14K15G21S23M24P34S41T33P34T37K38E39C40S41W42Q43T44Y48L49、Y32T33p34N35E58R74F103P104L114R115和W42Q43D67E68K69V70K82P88。对这些天然表位进行序列分析,可以发现一个共同的关键功能区域：Y32T33P34N35D36T37K38E39C40S41W42Q43T44（功能域Ⅰ）。通过同源建模方法构建了dIL-2蛋白的三维模拟结构,将其功能域Ⅰ定位于A-B环和螺旋B的N端部分。利用噬菌体展示技术和合成肽竞争ELISA方法,鉴定了5株具有抑制鹅IL-2（gIL-2）依赖的T淋巴母细胞增殖作用的抗gIL-2 mAbs的结合表位。这些mAbs所识别的表位均为构象表位,其模拟表位分别为HHDPWDXLP、ESLSRXXMXXLXP、SHHLPTSXL、HPDPWDAPLSS和HEPWQLXL。Clustal W序列比对分析获得了其相应的天然表位组成,分别为I14K15D16P34W42Q43T44L45Q46、D8T9L10T11K19L20S23M24K25E30L31Y32P34、T11E18K19L20G21T22S23M24L29、T33P34E36S41W42D61P88P89L115R116S117和Y32T33P34W42Q43L45Q46L49。对这些天然表位进行序列分析,可以发现一个共同的关键功能区域：T11I14K15D16E18K19L20G21T22S23M24K25L29E30L31Y32T33P34E36S41W42Q43T44L45Q46（功能域Ⅰ）。通过同源建模方法构建了gIL-2蛋白的三维模拟结构,将其功能域Ⅰ定位于螺旋A、A-B环和螺旋B的N端部分。比较鸡、鸭、鹅IL-2的功能域组成及位置,发现在其分子的N端区域均存在一个关键的功能域,而其中的第28位到第46位序列均为最关键的功能位点,表明禽类IL-2分子的功能域分布具有相似性。利用体外抑制cIL-2依赖的T淋巴母细胞增殖活性方法,分析了3株识别真核细胞表达的鸡IL-2Rα链（cCD25）的mAbs的生物学活性,发现其中的2株具有显着的抑制功能。流式细胞计分析表明cCD25表达在脾单个核细胞的表面。利用噬菌体表面展示技术和合成肽竞争ELISA方法,鉴定了2株抗cCD25功能性mAbs的结合表位。该单抗的噬菌体模拟位基序为PVDRPRD和SLGKXTPVDEPXY。利用Clustal W序列比对和合成肽竞争ELISA鉴定了其相应的天然表位组成,并据此将其天然表位划分为一个功能域：K152W153T154P155V156D157R158P159C160T161（功能域Ⅰ）。通过同源建模方法构建了cCD25蛋白胞外域的三维模拟结构,将其功能域Ⅰ定位于D2结构域的近C末端部分。利用体外抑制cIL-2依赖的T淋巴细胞增殖活性方法,分析了5株识别真核细胞表达的鸡IL-2Rγ链（cCD132）的mAbs的生物学活性,发现其中1株mAb具有显着的抑制功能。流式细胞计分析表明cCD132表达在脾单个核细胞的表面。利用噬菌体表面展示技术和合成肽竞争ELISA方法,鉴定了mAb C10的结合表位。该单抗的噬菌体模拟位基序为QEHQNL,其相应的天然表位组成为Q84E94L95Q96N97L98。与人CD132序列的比对分析显示,Q96可能是个关键的功能位点,随后发现定点突变Q96A的表位多肽完全丧失了结合（?）mAb C10的能力,证明了Q96是个关键的功能氨基酸。通过同源建模方法构建了cCD132蛋白胞外域的三维模拟结构,将其功能域定位于N结构域和C结构域间的肘关节样的连接区。利用噬菌体展示技术,分别分析了鸡白介素2受体α、γ的cIL-2结合模拟表位和鸡白介素2的受体α、γ结合模拟表位,并对这些结合表位及前期鉴定的功能性表位进行了功能鉴定和结构定位,提出了cIL-2和其受体α、γ相互作用的基本模型。cIL-2中的K27～C41直接与其受体α、γ发生强相互作用,提示了cIL-2R的α、γ亚基间存在互相接触的界面,完全不同于人IL-2Ra亚基游离于β和γ亚基组成的聚合物而单独在相反的侧面与IL-2发生相互作用。cCD25中的α99-112主要负责与cIL-227-41作用。cCD132中的γ119-137主要负责与cIL-227-41、cIL-279-96作用,而γ82-101则是第二个特异性与cIL-279-96发生相互作用的位点。cIL-2Rα、γ间的相互作用分析表明cIL-2R的两个亚基间存在着互相作用,该相互作用界面主要由cCD2599-112/cCD132119-137构成,该界面同时也是主要参与cIL.227-41相互作用的结构。cIL-227-41/cCD2599-112/cCD132119-137构成了三聚体复合物的相互作用中心。上述研究结果为阐述cIL-2和cIL-2Rα、γ间的基本相互作用提供了实验证据和结构模型。
刘兵[5]（2007）在《编码人CD20的Ad载体诱发抗小鼠淋巴瘤特异性免疫的研究》文中认为免疫治疗在淋巴瘤的治疗中占有显着的地位。利普昔单抗（Rituximab，美罗华）在临床上的应用显着地改善了CD20+的B细胞淋巴瘤患者的预后。但美罗华单抗在体内产生的是被动免疫，而在抗肿瘤免疫中，主要还是应以主动性的细胞免疫为主。另有研究表明，用同源异种的肿瘤相关抗原能有效地打破自身肿瘤抗原诱导的免疫耐受。因此，用同源异种的肿瘤抗原修饰树突状细胞（Dendritic cells，DC），诱导机体产生抗肿瘤免疫，从而达到治疗肿瘤的目的将是肿瘤治疗的一种有效策略。本研究旨在探讨编码人CD20（hCD20）基因的腺病毒载体感染DC作为疫苗免疫小鼠，对CD20+淋巴瘤小鼠的保护作用。采用RT-PCR的方法将hCD20基因从人外周血中克隆出来并将该基因cDNA片段插入腺病毒穿梭质粒中，采用Ad MaxTM腺病毒载体包装体系，构建Ad5／35 hCD20。同时构建稳定表达小鼠CD20（mCD20）的B16.F10细胞，模拟CD20阳性的淋巴瘤细胞。用Ad5／35 hCD20感染C57BL／6小鼠骨髓来源的DC，感染剂量为100 pfu／DC，以每只小鼠5×105 DC皮下注射免疫同基因小鼠，每周一次，连续两次，并以dl 70-3感染的DCs作为对照，以相同方式免疫小鼠。免疫结束后一周，以mCD20+B16.F10细胞作为靶细胞，免疫后小鼠的脾细胞作为效应细胞，用乳酸脱氢酶释放法进行体外细胞毒性实验检测抗原特异性细胞免疫反应；以同样的方式两次DC免疫后一周，皮下接种mCD20+B16.F10细胞（2×105细胞／小鼠）建立小鼠淋巴瘤荷瘤模型，观察Ad5／35 hCD20免疫小鼠后的免疫保护作用。体外细胞毒实验结果显示：Ad5／35 hCD20免疫小鼠能诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的产生，其CTL杀伤率与效靶比有关，在效靶比为100：1、50：1和25：1情况下，实验组的杀伤率分别为73.9％±7.6％、57.7％±8.8％和26.7％±3.1％，对照组的杀伤率分别为17.4％±0.8％、12.8％±2.9％和91％±1.0％。荷瘤实验显示，对照组小鼠在接种mCD20+B16.F10细胞后两周左右全部成瘤，而实验组小鼠观察4周其成瘤率为30％；且实验组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组。继续观察至2个月，实验组剩余的小鼠仍无肿瘤生长，提示Ad5／35hCD20能产生抗小鼠淋巴瘤的特异性免疫，对CD20+的淋巴瘤小鼠有保护作用。本研究证实，用腺病毒载体介导的同源异种CD20（人CD20）能有效地打破肿瘤免疫耐受，产生明显的抗小鼠CD20+淋巴瘤的特异性免疫反应，为临床免疫治疗CD20+淋巴瘤提供一条新的思路和实验依据。
王家清[6]（2005）在《腺病毒介导的小鼠Flt3-L基因治疗G422胶质母细胞瘤的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:研究Flt3-L基因对G422胶质母细胞瘤的治疗作用。 方法:本研究采用重组腺病毒介导的小鼠Flt3-L基因治疗小鼠G422胶质母细胞瘤。通过腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因（Ad-GFP）转染G422细胞观察腺病毒转染效果。重组腺病毒携带的Flt3-L基因通过RT-PCR、Western-blot检测Flt3-L蛋白的表达。携有Flt3-L基因的重组腺病毒体外转染G422细胞,通过四唑盐比色试验（MTT法）测量转染后G422细胞的增殖情况。 结果:当重复感染度（MOI）=100时,重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因（Ad-GFP）在转染G422细胞36小时后,绝大多数细胞呈现绿色荧光,转染效率达到90%以上。转染后的细胞裂解后做RT-PCR试验,结果显示Ad-Flt3-L组在700bp与600bp标准DNA之间出现一条高亮度的约620bp左右的条带,而对照组没有。Ad-Flt3-L转染G422细胞后,在培养细胞的上清液中用Western-blot法检测到了高水平的Flt3-L蛋白的表达。MTT法测量G422细胞在Ad-Flt3-L处理后的增殖情况,结果在Ad-Flt3-L转染后G422细胞生长正常。 结论:腺病毒携带的Flt3-L基因对G422细胞的正常分化和增殖没有明确的影响。
隋刚[7]（2004）在《腺病毒介导内皮抑素基因治疗小鼠肺癌的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景 血管生成是肿瘤发展、转移的重要条件，也是所有肿瘤的共性。实体瘤形成之初尚无血管生成，此时肿瘤细胞的营养主要通过弥散获得，当细胞距离毛细血管200um以上时，氧气将无法通过弥散作用抵达肿瘤细胞，此时如再无新生血管的生成，肿瘤组织将发生退化，而若有新生血管长入肿瘤组织，肿瘤将迅速生长，并且其浸润和转移能力也大大增强。研究证实通过抑制肿瘤血管内皮细胞的生长，可达到抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的目的。抗血管生成治疗以其广谱、低毒、无抗药性受到了广泛关注，特别是内源性血管抑制药物的发现，掀起了抗血管生成研究的高潮。内皮抑素是新近发现的一种内源性抗血管生成药物，蛋白治疗可完全抑制动物肿瘤生长和抑制肿瘤转移，是现今发现的抗血管生成作用最强大的药物之一。由于其需要长期应用，体外不稳定，大量生产困难等因素限制了其更广泛的应用。基因治疗提供了一种替代途径可解决上述问题，而腺病毒是目前应用最广泛的载体之一。如能将两者结合起来，构建一种高效表达内皮抑素的腺病毒载体，必将能产生较好的治疗效果。 研究目的： 一．构建含全长小鼠内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒表达载体。 二．观测腺病毒载体介导的内皮抑素的体外表达及检测其生物学活性，并进一步探讨其作用机理。 三．观测内皮抑素腺病毒载体体内表达及其对小鼠皮下种植肺肿瘤的治疗作用和治疗后对肿瘤血管密度的影响。 研究内容和方法： 一．内皮抑素腺病毒表达载体的构建：用细胞内同源重组的方法产生带全长内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒载体，在其5’端引入成瘤蛋白信号肽以产生分泌型内皮抑素蛋白。在293细胞内扩增病毒，CsCl密度梯度浓缩及50％组织培养布二二门阵医，号学俘创匕攀七比论文中文按要脚护乞外料学专习匕 感染剂量法测定病毒滴度。二.荧光显微镜观察腺病毒载体细胞转染效率，用Rl’- PCR法检测体外腺病毒载体 转染肿瘤细胞和内皮细胞后在mRNA水平的表达，用W七stem Blot法检测腺病 毒载体转染肿瘤细胞和内皮细胞后体外培养上清中蛋白的表达并进一步用 EUSA法测定其表达水平。三.用MT’T法检测转染内皮抑素腺病毒载体后对细胞增殖率变化，用流式细胞术 检测内皮抑素腺病毒表达载体对细胞周期影响和凋亡变化，并进一步用 AnnexinV一FITC法检测早期凋亡变化。四.2xl护个Lewis肿瘤细胞小鼠背部皮下注射建立肺癌异位种植瘤模型。内皮抑 素腺病毒载体瘤内注射治疗，免疫组化检测内皮抑素蛋白肿瘤内原位表达， Westem Blot观测注射后蛋白表达持续时间，ELISA法检测血循环中内皮抑素 蛋白表达水平。五.观察内皮抑素腺病毒载体注射后对小鼠肿瘤生长和转移的影响，生存率变化。 应用CD31和CD105两种抗原标记免疫组化作肿瘤血管密度计数，观察治疗后 肿瘤血管密度变化，电镜观察肿瘤细胞凋亡情况并分析内皮抑素抗肿瘤的机 理。研究借果:一成功构建了含全长内皮抑素基因的腺病毒表达载体Ad一mEnd。，病毒扩增 后cscl密度梯度浓缩后滴度达9.2 xlo’‘。二.腺病毒载体可有效转染肿瘤和内皮细胞。Ad一mEndo转染Lewis肿瘤细胞 和ECV304内皮细胞后应用Rl’- PCR法均检测到了内皮抑素mRNA表达，转 染后的培养液上清中W七stem Blot法检测到了内皮抑素蛋白表达，EUSA法 测定Ad一mEnd。转染Lewis肿瘤细胞后培养上清中内皮抑素蛋白浓度可达 3275士505ng/ml。三.内皮抑素可明显抑制ECV304内皮细胞的增殖（P<0.05），对Lewis肿瘤细胞 影响不大（P>0.05）。内皮抑素可阻断vEGF;65对ECv304细胞的生长促进作 用。内皮抑素可使ECV304细胞G:期阻滞并能诱导内皮细胞凋亡。四.应用小鼠背部皮下注射成功建立肺癌异位种植瘤模型，成瘤率100%。内皮甫二二军医大学俘创匕掌位论文中文摘要脚护乞外料学专业抑素腺病毒载体瘤内注射后可明显抑制肿瘤生长和转移、延长小鼠生存期。内皮抑素腺病毒载体注射后免疫组化示肿瘤组织内内皮抑素强阳性表达，对照组阴性或痕量表达。内皮抑素表达可持续一个月，第二周血循环浓度可达1 540士56on留ml。免疫组化显示治疗组肿瘤组织内皮抑素蛋白强阳性表达，对照组阴性或痕量表达。ELISA检测治疗组血清内皮抑素浓度，第二周可达1540士56on岁ml，一月后降至对照水平。治疗组肿瘤体积，生存率与空载体对照及阴性对照组相比有显着性差异（P<0.05），CD105标记的肿瘤内新生血管密度在治疗组、空载体对照组和阴性对照组分别为10.5士3.2，39.7士5.6，42.4士4.8个/200倍视野，前者与后两者相比有非常显着差异（P<0.01）。电镜示治疗后的肿瘤组织内凋亡肿瘤细胞多见。实脸诺论:一构建的内皮抑素腺病毒载体可在体内外高效表达分泌型的内皮抑素蛋白。二.内皮抑素腺病毒载体转染可抑制内皮细胞增殖并阻断VEGF;65对内皮细胞 的生长促进作用，作用为正性量效关系，并对内皮细胞特异，对肿瘤细胞无 影响。三.内皮抑素可使ECV304内皮细胞Gl期阻滞并诱导其凋亡。四.内皮抑素腺病毒
田长富,李殿俊,刘旭,任丽君[8]（2002）在《腺病毒CD-80基因转导B16-F10细胞的体外生物学特征（英文）》文中研究说明目的 探讨含hB7 1基因的重组腺病毒hCD80rAd对B16 F10肿瘤细胞体外生物学特性的影响。方法 以腺病毒为载体 ,将CD80基因导入B16 F10肿瘤细胞后 ,以PCR方法检测基因导入 ,以电镜、FACS等方法观察对其体外生物学特性的影响。结果 重组腺病毒的滴度可达 10 1 0 PFU mL ,2 0MOIsrAd可使 95 %以上的B16 F10细胞被感染。转染CD80基因后 ,B16 F10细胞的生长能力、克隆形成能力等均无变化 ,电镜下 ,细胞表面结构及胞内超微结构有轻微变化。结论 重组腺病毒hCD80rAd可以有效地将hCD80基因导入肿瘤细胞而不会引起明显的生物学特性改变 ,制备肿瘤疫苗是可行的
二、Effects of hCD80-Adenovirus on B16-F10 Cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Effects of hCD80-Adenovirus on B16-F10 Cells（论文提纲范文）
（1）口蹄疫疫苗抗原的稳定策略及新佐剂的设计（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 口蹄疫疫苗抗原的结构及稳定策略 |
| 1.1.1 口蹄疫病毒的结构特点 |
| 1.1.2 影响口蹄疫病毒稳定性的因素 |
| 1.1.3 口蹄疫病毒颗粒的稳定策略 |
| 1.1.4 金属离子对病毒及病毒样颗粒的作用 |
| 1.2 FMDV疫苗的佐剂 |
| 1.2.1 乳液佐剂 |
| 1.2.2 颗粒佐剂 |
| 1.2.3 免疫刺激复合物 |
| 1.3 离子液体 |
| 1.3.1 离子液体在蛋白质药物研究中的应用 |
| 1.3.2 离子液体在药学研究中的应用 |
| 1.4 立题依据和研究目标 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究策略和目标 |
| 第2章 灭活口蹄疫病毒颗粒与过渡金属离子的相互作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验材料及药品 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 灭活口蹄疫病毒颗粒的分离纯化及检测 |
| 2.2.4 口蹄疫病毒的结构和氨基酸序列分析 |
| 2.2.5 等温滴定量热 |
| 2.2.6 微量热泳动 |
| 2.2.7 电感耦合等离子体质谱法 |
| 2.2.8 结合不同数量金属离子的146S颗粒的制备 |
| 2.2.9 透射电镜观察颗粒形态 |
| 2.2.10 HPSEC-MALLS |
| 2.2.11 荧光光谱和圆二色光谱 |
| 2.2.12 SD-test |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 纯化后病毒颗粒的纯度和颗粒形态 |
| 2.3.2 口蹄疫病毒的结构分析 |
| 2.3.3 金属离子和灭活口蹄疫病毒颗粒相互作用过程的热力学 |
| 2.3.4 金属离子和灭活口蹄疫病毒颗粒结合过程的化学计量分析 |
| 2.3.5 灭活口蹄疫病毒颗粒结合金属离子后的结构变化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 过渡金属离子结合对灭活口蹄疫病毒颗粒稳定性和免疫活性的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验材料及药品 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 结合金属离子的146S的制备 |
| 3.2.4 热稳定性研究 |
| 3.2.5 耐酸稳定性 |
| 3.2.6 免疫小鼠 |
| 3.2.7 特异性IgG抗体滴度测定 |
| 3.2.8 动物实验伦理说明 |
| 3.2.9 灭活口蹄疫病毒颗粒与受体亲和力测定 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 结合金属离子对灭活口蹄疫病毒颗粒热稳定性的影响 |
| 3.3.2 结合金属离子对灭活口蹄疫病毒颗粒耐酸稳定性的影响 |
| 3.3.3 结合金属离子对灭活口蹄疫病毒颗粒免疫活性的影响 |
| 3.3.4 结合金属离子对灭活口蹄疫病毒颗粒和受体亲和力的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 离子液体对灭活口蹄疫病毒颗粒的稳定性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验材料及药品 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 灭活口蹄疫病毒颗粒的分离纯化及检测 |
| 4.2.4 离子液体的细胞毒性 |
| 4.2.5 差示扫描荧光(DSF) |
| 4.2.6 长期放置稳定性 |
| 4.2.7 圆二色光谱和透射电镜 |
| 4.2.8 加速稳定性研究 |
| 4.2.9 免疫小鼠及抗体滴度测定 |
| 4.2.10 动物实验伦理说明 |
| 4.2.11 146S微环境pH测定 |
| 4.2.12 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 离子液体的细胞毒性 |
| 4.3.2 离子液体对灭活口蹄疫病毒颗粒热稳定性的影响 |
| 4.3.3 离子液体对灭活口蹄疫病毒颗粒长期放置稳定性的影响 |
| 4.3.4 与其它常见稳定剂的稳定作用对比 |
| 4.3.5 离子液体对灭活口蹄疫病毒颗粒免疫活性的影响 |
| 4.3.6 胆碱型离子液体稳定灭活口蹄疫病毒颗粒的机制 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 离子液体乳液构建及用于口蹄疫疫苗佐剂的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实验材料及药品 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 细胞毒性 |
| 5.2.4 热稳定性 |
| 5.2.5 耐酸稳定性 |
| 5.2.6 O/IL乳液的制备 |
| 5.2.7 O/W乳液的制备 |
| 5.2.8 乳液粒径和稳定性测定 |
| 5.2.9 含灭活口蹄疫病毒颗粒乳液的制备 |
| 5.2.10 加速稳定性 |
| 5.2.11 乳液破乳 |
| 5.2.12 动物实验伦理说明 |
| 5.2.13 免疫小鼠及取血 |
| 5.2.14 抗体滴度测定 |
| 5.2.15 脾细胞的提取及培养 |
| 5.2.16 细胞因子测定 |
| 5.2.17 B细胞、T细胞活化和T细胞记忆的测定 |
| 5.2.18 统计学分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 CANI的细胞毒性 |
| 5.3.2 CANI对灭活口蹄疫病毒颗粒稳定性的影响 |
| 5.3.3 O/IL乳液的制备与优化 |
| 5.3.4 O/IL乳液的稳定性 |
| 5.3.5 灭活口蹄疫病毒颗粒在乳液中的稳定性 |
| 5.3.6 O/IL乳液用于口蹄疫疫苗佐剂 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 O/IL乳液用于流感裂解疫苗佐剂的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 实验材料及药品 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 O/IL及O/W乳液的制备 |
| 6.2.4 含流感裂解疫苗抗原的O/L和O/W乳液制备 |
| 6.2.5 含抗原的IL/O乳液制备 |
| 6.2.6 免疫小鼠及取血 |
| 6.2.7 鼻洗液收集 |
| 6.2.8 IgG和IgA抗体滴度测定 |
| 6.2.9 血凝抑制滴度(HAI) |
| 6.2.10 脾细胞的提取及培养 |
| 6.2.11 鼻黏膜相关淋巴组织(NALT)的提取及培养 |
| 6.2.12 细胞因子测定 |
| 6.2.13 脾细胞中B细胞、T细胞活化和T细胞记忆的测定 |
| 6.2.14 NALT中B细胞、DC细胞增殖和分化 |
| 6.2.15 抗原在鼻腔停留时间测定 |
| 6.2.16 动物实验伦理说明 |
| 6.2.17 统计学分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 流感裂解疫苗注射免疫 |
| 6.3.2 流感裂解疫苗鼻黏膜免疫 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）脐带MSC来源exosome在皮肤组织再生中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 间质干细胞及其来源的EXOSOME |
| 1.1.1 间质干细胞的概述 |
| 1.1.2 Exosome概述 |
| 1.1.3 Exosome转运信号分子在细胞间信号转导中的作用 |
| 1.2 间质干细胞及其来源的EXOSOME在再生医学中作用 |
| 1.2.1 MSC在再生医学中的作用 |
| 1.2.2 MSC-exosome在组织再生中的应用 |
| 1.3 MSC及其来源的EXOSOME在皮肤组织再生中作用 |
| 1.3.1 皮肤损伤后组织修复的基本过程 |
| 1.3.2 MSC治疗皮肤损伤的临床前研究 |
| 1.3.3 MSC修复皮肤损伤的临床试验 |
| 1.3.4 MSC修复皮肤损伤的临床试验验证 |
| 1.3.5 MSC来源的exosome在皮肤组织再生中的作用及其临床应用前景 |
| 1.4 MSC及EXOSOME在皮肤组织再生中所涉及的信号通路 |
| 1.4.1 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.4.2 Hippo信号通路 |
| 1.5 科学问题的提出 |
| 第二章 研究目的、实验方案及意义 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.1.1 确定hucMSC-Ex对皮肤深Ⅱ度烫伤治疗的有效性并探讨机制 |
| 2.1.2 分析hucMSC-Ex治疗皮肤深Ⅱ度烫伤的安全性并研究其机制 |
| 2.2 实验方案设计 |
| 2.3 研究意义 |
| 第三章 HUCMSC-EXOSOME转运WNT4活化B-CATENIN促进皮肤深Ⅱ度烫伤组织再生 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 实验所用细胞 |
| 3.1.2 实验所用动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HucMSC-exosome分离及鉴定 |
| 3.2.2 SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型的建立 |
| 3.2.3 HucMSC-Ex对SD大鼠体内深Ⅱ度烫伤的治疗 |
| 3.2.4 HucMSC-Ex对体外热激损伤皮肤细胞的修复作用 |
| 3.2.5 皮肤组织病理切片的制作及HE染色 |
| 3.2.6 病理切片的HE染色 |
| 3.2.7 免疫组织化学染色 |
| 3.2.8 组织免疫荧光染色(IF) |
| 3.2.9 细胞免疫荧光染色(IF) |
| 3.2.10 组织和细胞Western blot |
| 3.2.11 组织细胞凋亡检测(TUNEL法) |
| 3.2.12 流式细胞术检测细胞周期 |
| 3.2.13 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.2.15 β-catenin转录活性的检测(Wnt信号luciferase报告系统) |
| 3.2.16 慢病毒介导的Wnt4-shRNA干扰 |
| 3.2.17 细胞计数 |
| 3.2.18 划痕实验 |
| 3.2.19 Luminex分析 |
| 3.2.20 内皮细胞的小管形成实验 |
| 3.2.21 细胞核质分离蛋白提取 |
| 3.2.22 统计分析 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 HucMSC-exosome(hucMSC-Ex)及HFL1-exosome(HFL1-Ex)的鉴定 |
| 3.3.2 皮肤深Ⅱ度烫伤模型的建立 |
| 3.3.3 HucMSC-Ex促进深Ⅱ度烫伤的创面愈合 |
| 3.3.4 HucMSC-Ex加速损伤后皮肤组织的再生 |
| 3.3.5 HucMSC-Ex促进损伤后皮肤组织新生血管再生 |
| 3.3.6 皮肤细胞体外热激损伤模型的建立 |
| 3.3.7 HucMSC-Ex抑制热激引起的皮肤细胞凋亡并促进其增殖 |
| 3.3.8 HucMSC-Ex不影响皮肤细胞MAPK信号通路的活化 |
| 3.3.9 HucMSC-Ex活化皮肤细胞的AKT信号 |
| 3.3.10 HucMSC-Ex通过活化AKT信号通路抑制热损伤引起的细胞凋亡 |
| 3.3.11 HucMSC-Ex中可能活化AKT信号通路细胞因子的检测 |
| 3.3.12 AKT信号通路的活化不能完全解释hucMSC-Ex对皮肤细胞增殖和迁移的作用 |
| 3.3.13 HucMSC-Ex促进皮肤细胞β-catenin的核转位和转录活性 |
| 3.3.14 HucMSC-Ex通过Wnt/β-catenin信号通路促进SD大鼠深Ⅱ烫伤的修复 |
| 3.3.15 HucMSC-Ex通过转运Wnt4信号分子活化Wnt/β-catenin通路促进损伤皮肤组织再生 |
| 3.3.16 HucMSC-Ex介导的Wnt4促进新生皮肤的血管生成 |
| 3.3.17 AKT通路和Wnt信号在hucMSC-Ex作用皮肤细胞体系中的调控关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 HucMSC-Ex介导的14-3-3z通过HIPPO-YAP通路协调其自身WNT4信号,控制损伤后皮肤干细胞扩增 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 实验所用细胞 |
| 4.1.2 实验所用动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 HucMSC-exosome分离及鉴定 |
| 4.2.2 SD大鼠深Ⅱ度烫伤模型的建立 |
| 4.2.3 HucMSC-Ex对SD大鼠体内深Ⅱ度烫伤的治疗 |
| 4.2.4 皮肤组织病理切片的制作及HE染色 |
| 4.2.5 病理切片的HE染色 |
| 4.2.6 免疫组织化学染色 |
| 4.2.7 组织免疫荧光染色(IF) |
| 4.2.8 组织和细胞Western blot |
| 4.2.9 实时荧光定量(qRT-PCR) |
| 4.2.10 β-catenin转录活性的检测(Wnt信号luciferase报告系统) |
| 4.2.11 慢病毒转染shRNA介导的基因干扰 |
| 4.2.12 细胞计数 |
| 4.2.13 细胞核质分离蛋白提取 |
| 4.2.14 高/低细胞生长密度的界定 |
| 4.2.15 HucMSC-Ex的质谱分析 |
| 4.2.16 免疫共沉淀(IP) |
| 4.2.17 腺病毒介导的基因过表达 |
| 4.2.18 流式分析CD44的表达 |
| 4.2.19 PCR法构建YAP Ser127和LATS Thr1079位点的突变质粒 |
| 4.2.20 YAP转录活性的检测 |
| 4.2.21 统计分析 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 细胞增殖和β-catenin的活化在hucMSC-Ex介导的皮肤组织再生过程中呈动态变化 |
| 4.3.2 HucMSC-Ex对皮肤干细胞的扩增呈现先促进后抑制的趋势 |
| 4.3.3 HucMSC-Ex对皮肤细胞增殖的抑制是依赖于“高细胞密度”的生长条件 |
| 4.3.4 靶细胞的高密度生长逆转hucMSC-Ex对β-catenin的活化 |
| 4.3.5 HucMSC-Ex促进YAP Ser127的磷酸化和胞质内滞留 |
| 4.3.6 HucMSC-Ex对Wnt4/β-catenin信号的抑制作用依赖于YAP Ser127的磷酸化 |
| 4.3.7 HucMSC-Ex通过转运14-3-3ζ蛋白促进YAP的磷酸化和胞质内滞留 |
| 4.3.8 14-3-3ζ促进YAP磷酸化的过程依赖于p-LATS激酶 |
| 4.3.9 p-LATS激酶与其底物YAP结合依赖于14-3-3ζ蛋白 |
| 4.3.10 HucMSC-Ex转运的14-3-3ξ限制损伤后皮肤干细胞的扩增和抑制胶原沉积 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间取得的科研成果 |
（3）调节性淋巴细胞在Graves病发病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 调节性B细胞在Graves病发病中的作用及机制研究 |
| (一) Graves病患者外周血调节性B细胞的表型鉴定及数量分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| (二) Graves病患者外周血调节性B细胞的功能分析及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 调节性T细胞在Graves病发病中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文 |
| 在校期间参加学术会议及获奖情况 |
| 在校期间获基金资助情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）禽白细胞介素2功能域鉴定及与其受体的相互作用研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 研究意义 |
| 技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 IL-2的体内生物学 |
| 1 IL-2 |
| 2 IL-2R |
| 3 IL-2和IL-2R的体内表达 |
| 4 IL-2与自身免疫的遗传基础 |
| 5 IL-2与Treg细胞发育 |
| 6 IL-2与Treg细胞动态平衡 |
| 7 IL-2与诱导型Treg细胞 |
| 8 IL-2与Treg细胞程序 |
| 9 IL-2与初级免疫应答 |
| 10 IL-2与记忆T细胞 |
| 11 IL-2靶向的免疫治疗 |
| 第二章 IL-2与其受体a、β、γc的四元体结构研究 |
| 1 整体结构 |
| 2 IL-2/IL-2Rα |
| 3 IL-2/IL-2Rβ |
| 4 IL-2/γc |
| 5 IL-2Rβ/γc |
| 6 γc识别细胞因子功能的退化 |
| 第三章 噬菌体展示技术研究进展 |
| 1 噬菌体展示技术的原理 |
| 2 噬菌体展示系统 |
| 2.1 单链丝状噬菌体展示系统 |
| 2.2 λ噬菌体展示系统 |
| 2.3 T4噬菌体展示系统 |
| 2.4 T7噬菌体展示系统 |
| 3 噬菌体展示技术的优势和局限性 |
| 3.1 优势 |
| 3.2 局限性 |
| 4 噬菌体展示技术的应用 |
| 4.1 开发新型疫苗 |
| 4.2 在疾病发生机理和治疗中的应用 |
| 4.3 在抗体工程中的应用 |
| 4.4 模拟表位的筛选 |
| 4.5 DNA结合蛋白研究 |
| 4.6 蛋白质组学的研究 |
| 5 结语 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 鸡白细胞介素2功能域的鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组原核表达质粒的构建及序列测定 |
| 2.2 可溶性rcIL-2的原核表达和单体分离 |
| 2.2.1 诱导表达 |
| 2.2.2 SDS-PAGE和Western blot鉴定 |
| 2.2.3 天然纯化 |
| 2.2.4 凝胶过滤纯化单体 |
| 2.2.5 天然可溶性单体氧化复性策略 |
| 2.2.6 天然电泳分析 |
| 2.3 单克隆抗体的制备 |
| 2.3.1 动物免疫 |
| 2.3.2 杂交瘤细胞株的建立、筛选及克隆化 |
| 2.3.3 腹水的制备与纯化 |
| 2.4 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.4.1 ELISA |
| 2.4.2 Western blot |
| 2.4.3 单克隆抗体Ig类别、亚类测定 |
| 2.4.4 单克隆抗体的真核表位识别鉴定 |
| 2.5 单克隆抗体的生物学功能鉴定 |
| 2.6 重叠合成肽扫描技术分析单克隆抗体的识别表位 |
| 2.7 功能性单克隆抗体的模拟表位淘选 |
| 2.7.1 淘选程序 |
| 2.7.2 噬菌体滴度测定 |
| 2.7.3 噬菌体测序模板提取 |
| 2.7.4 Phage ELISA |
| 2.7.5 多肽竞争ELISA |
| 2.8 表位多肽的生物学活性鉴定 |
| 2.9 cIL-2的三维结构模型构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒pET28a(+)-cIL-2的构建及鉴定 |
| 3.2 可溶性表达蛋白的SDS-PAGE和Western-blotting鉴定 |
| 3.3 功能性单克隆抗体的制备 |
| 3.4 cIL-2重叠多肽与单克隆抗体的反应性鉴定 |
| 3.5 单克隆抗体噬菌体模拟位的淘选及鉴定 |
| 3.6 表位多肽的生物活性分析 |
| 3.7 构象型功能域在cIL-2三维结构中的定位 |
| 4 讨论 |
| 第二章 鸭白细胞介素2功能域的鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 单克隆抗体的腹水制备和纯化 |
| 2.2 单克隆抗体的模拟表位淘选 |
| 2.3 Phage ELISA |
| 2.4 多肽竞争ELISA |
| 2.5 dIL-2的三维结构模型构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 单克隆抗体噬菌体模拟位的淘选及鉴定 |
| 3.2 功能域在dIL-2三维结构中的定位 |
| 4 讨论 |
| 第三章 鹅白细胞介素2功能域的鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 单克隆抗体的腹水制备和纯化 |
| 2.2 单克隆抗体的生物学功能鉴定 |
| 2.3 单克隆抗体的模拟表位淘选 |
| 2.4 Phage ELISA |
| 2.5 多肽竞争ELISA |
| 2.6 gIL-2的三维结构模型构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 单克隆抗体的纯化 |
| 3.2 单克隆抗体的中和活性分析 |
| 3.3 单克隆抗体噬菌体模拟位的淘选及鉴定 |
| 3.4 功能域在gIL-2三维结构中的定位 |
| 4 讨论 |
| 第四章 cIL-2Rα功能域的鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 单克隆抗体的腹水制备和纯化 |
| 2.2 单克隆抗体的生物学功能鉴定 |
| 2.3 ConA活化的SMCs表达cCD25的动力学分析 |
| 2.4 单克隆抗体的模拟表位淘选 |
| 2.5 Phage ELISA |
| 2.6 多肽竞争ELISA |
| 2.7 cCD25胞外域三维结构模型构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 单克隆抗体的中和活性分析 |
| 3.2 ConA刺激下SMCs表达cCD25的动力学分析 |
| 3.3 单克隆抗体噬菌体模拟位的淘选及鉴定 |
| 3.4 功能域在cCD25胞外域三维结构中的定位 |
| 4 讨论 |
| 第五章 cIL-2Rγ功能域的鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 单克隆抗体的腹水制备和纯化 |
| 2.2 单克隆抗体的生物学功能鉴定 |
| 2.3 ConA活化的SMCs表达cCD132的动力学分析 |
| 2.4 单克隆抗体的模拟表位淘选 |
| 2.5 Phage ELISA |
| 2.6 多肽竞争ELISA |
| 2.7 cCD132胞外域三维结构模型构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 单克隆抗体的中和活性分析 |
| 3.2 ConA刺激下SMCs表达cCD132的动力学分析 |
| 3.3 单克隆抗体噬菌体模拟位的淘选及鉴定 |
| 3.4 功能域在cCD132胞外域三维结构中的定位 |
| 4 讨论 |
| 第六章 cIL-2与cIL-2Rα、γ的相互作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡白介素2受体α、γ的cIL-2结合模拟表位淘选 |
| 2.2 鸡白介素2的受体结合模拟表位淘选 |
| 2.3 Phage ELISA |
| 2.4 cIL-2与cCD25的相互作用分析 |
| 2.5 cIL-2与cCD132的相互作用分析 |
| 2.6 cIL-2R间的相互作用分析 |
| 2.7 cIL-2表位多肽的生物活性分析 |
| 2.8 cIL-2表位多肽与cIL-2R表位多肽相互作用的生物活性分析 |
| 2.9 cIL-2和其受体α、γ作用位点的三维结构定位 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸡白介素2受体α、γ的cIL-2结合表位的淘选及鉴定 |
| 3.2 鸡白介素2的cIL-2R结合表位的淘选及鉴定 |
| 3.3 cIL-2与cCD25的相互作用 |
| 3.4 cIL-2与cCD132的相互作用 |
| 3.5 cIL-2R间的相互作用 |
| 3.6 cIL-2表位多肽与其受体表位多肽相互作用的生物学功能验证 |
| 3.7 cIL-2和其受体作用位点的三维结构定位 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 附录 |
| 附录A 全文缩略语 |
| 附录B 常用试剂及仪器 |
| 附录C 常用缓冲液及培养基配方 |
| 附录D 攻博期间发表或录用的学术论文 |
| 致谢 |
（5）编码人CD20的Ad载体诱发抗小鼠淋巴瘤特异性免疫的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分:克隆人类CD20基因及获得含人类CD20的腺病毒载体 |
| 实验设计 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分:体外细胞毒性T淋巴细胞杀伤实验及体内荷瘤实验 |
| 实验设计 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
（6）腺病毒介导的小鼠Flt3-L基因治疗G422胶质母细胞瘤的实验研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一章 Ad-Flt3-L和Ad-GFP的扩增、纯化、浓缩和病毒滴度测定 |
| 第二章 G422小鼠胶质母细胞瘤细胞的分离、培养和冻存 |
| 第三章 腺病毒对G422细胞的体外转染效率 |
| 第四章 Rt-PCR检测Ad-Flt3-L转染G422细胞后mRNA表达 |
| 第五章 Western blot试验检测G422细胞Flt3-L的蛋白质表达 |
| 第六章 ELISA检测G422细胞Flt3-L蛋白质的表达量 |
| 第七章 转染Ad-Flt3-L后对G422细胞增殖的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明 |
（7）腺病毒介导内皮抑素基因治疗小鼠肺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 绪论 |
| 第二部分 内皮抑素腺病毒表达载体的构建与扩增 |
| 第三部分 Ad-mEndo的体外表达与生物学活性 |
| 第四部分 腺病毒介导内皮抑素基因治疗小鼠肺癌的试验研究 |
| 第五部分 结语与展望 |
| 综述 内皮抑素与肿瘤治疗 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（8）腺病毒CD-80基因转导B16-F10细胞的体外生物学特征（英文）（论文提纲范文）
| 1 MATERIALS AND METHODS |
| 1.1 Virus and cells |
| 1.2 Propagation of hCD80rAd |
| 1.3 Titer of hCD80rAd |
| 1.4 Infection rate of hCD80rAd |
| 1.5 Detection of CD80 gene by PCR |
| 1.6 Growth curve of hCD80rAd-infected B16-F10 cells |
| 1.7 Cloning efficiency assay |
| 1.8 Cell proliferation cycle assay |
| 1.9 Observation of hCD80rAd-infected B16-F10 cells through electron microscope |
| 2 RESULTS |
| 2.1 Propagation and titer of hCD80rAd |
| 2.2 Infection rate of B16-F10 cells with hCD80rAd |
| 2.3 Detection of PCR products |
| 2.4 Growth viability |
| 2.5 Cloning efficiency |
| 2.6 Cell proliferation cycle |
| 2.7 Morphology observation |
| 3 DISCUSSION |
四、Effects of hCD80-Adenovirus on B16-F10 Cells（论文参考文献）
- [1]口蹄疫疫苗抗原的稳定策略及新佐剂的设计[D]. 林旋. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2020(01)
- [2]脐带MSC来源exosome在皮肤组织再生中的作用及机制[D]. 张斌. 江苏大学, 2016(11)
- [3]调节性淋巴细胞在Graves病发病中的作用及机制研究[D]. 查兵兵. 复旦大学, 2013(03)
- [4]禽白细胞介素2功能域鉴定及与其受体的相互作用研究[D]. 顾建友. 浙江大学, 2009(05)
- [5]编码人CD20的Ad载体诱发抗小鼠淋巴瘤特异性免疫的研究[D]. 刘兵. 中国人民解放军军事医学科学院, 2007(04)
- [6]腺病毒介导的小鼠Flt3-L基因治疗G422胶质母细胞瘤的实验研究[D]. 王家清. 青岛大学, 2005(07)
- [7]腺病毒介导内皮抑素基因治疗小鼠肺癌的实验研究[D]. 隋刚. 第二军医大学, 2004(01)
- [8]腺病毒CD-80基因转导B16-F10细胞的体外生物学特征（英文）[J]. 田长富,李殿俊,刘旭,任丽君. 哈尔滨医科大学学报, 2002(04)