导读:本文包含了痘苗病毒天坛株论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:CRISPR-Cas9技术,痘苗病毒载体,重组效率,Cre-LoxP系统
痘苗病毒天坛株论文文献综述
张迪[1]（2019）在《高效重组且无筛选标记痘苗病毒天坛株载体系统的建立》一文中研究指出痘病毒(Poxvirus)是一类基因组较大的有包膜的线性双链DNA病毒,包括天花病毒(Variola virus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)和牛痘病毒(Cowpox virus)等。其具有非必需基因多,对外源基因的容量大(<25kbp)及胞质复制等特点,因此痘苗病毒或者其它类型痘病毒能够以载体的形式用于抵抗流感病毒(Influenza virus)、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)等的疫苗构建;更重要的是,通过敲除痘苗病毒特定基因,使其具有肿瘤选择性和安全性,因此可以作为溶瘤病毒的载体成为肿瘤免疫治疗的新手段。以往的研究中获得重组痘苗病毒载体的主要方法包括传统同源重组、直接体外连接法、细菌人工染色体等。但是这些方法存在重组效率低,病毒纯化耗时长等弊端,严重阻碍了痘苗病毒载体在临床上的应用,因此,目前亟需高效重组痘苗病毒载体的技术方法。CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9 是一种gRNA引导Cas9蛋白对靶点切割的基因编辑技术,可以产生indel;同时也可以在提供携带病毒同源序列的重组质粒的基础上,产生同源重组,获得新的重组病毒,已成功用于哺乳动物细胞及多种病毒、细菌的基因编辑中。而痘苗病毒天坛株(Vaccinia virus Tiantan strain,VTT)是中国自主研发、世界卫生组织文献记载中成功用于预防天花的疫苗毒株,在消灭天花的过程中发挥了重要的作用,已作为中国防止天花再次出现的应急储备疫苗毒种。因此,本研究拟在痘苗病毒天坛株的基础上通过CRISPR-Cas9建立高效重组痘苗病毒载体系统。本研究首先对痘苗病毒基因组进行扫描分析,利用网站(http://www.e-crisp.o-rg/E-CRISP/)预测靶向痘苗病毒不同位点的多条gRNA,后续选择了 TK区进行高效重组技术方法的探索。为此,本研究通过瞬时转染gRNA-Cas9质粒或建立表达Cas9蛋白的稳定细胞系后,感染VTT并转入重组质粒pJ2R-EGFP,经过多轮病毒噬斑实验纯化、测序鉴定证明利用CRISPR-Cas9技术能够更高效率的获得重组病毒天坛株痘苗病毒载体。同时与传统的同源重组方法相比,此高效重组痘苗病毒载体系统的重组效率大大提高,据此本研究初步建立起高效重组痘苗病毒载体系统。在高效重组痘苗病毒载体系统的建立过程中,为便于筛选,引入了外源筛选标记基因。为了满足重组痘苗病毒实际应用的需要,需要删除重组病毒中的筛选标记。Cre-LoxP是一种利用Cre酶识别特异DNA序列(LoxP位点),使两个Loxp位点间发生多种形式基因重组的系统。据此,本实验构建带有LoxP位点的重组质粒,利用瞬时转染高效重组的方法获得带有LoxP位点的重组病毒,然后通过Cre酶删除重组病毒中的筛选标记,获得删除TK且无筛选标记EGFP的重组痘苗病毒载体。综上所述,本研究通过CRISPR-Cas9与Cre-LoxP技术建立起高效重组且无筛选标记的痘苗病毒天坛株载体系统,为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供参考价值。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2019-04-01）
张迪,许丰雯,熊梓辰,郭斐[2]（2019）在《高效重组痘苗病毒天坛株载体系统的建立》一文中研究指出以痘苗病毒为载体的溶瘤病毒作为癌症治疗的新方向效果显着。同时,痘苗病毒还可以作为疫苗载体抵抗HIV、H5N1等病毒感染。因技术限制,重组痘苗病毒主要通过同源重组的方法获得,但此方法获得重组病毒的效率较低。随着CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9技术成功应用于多种动物、组织和细胞的基因编辑中,本研究拟利用CRISPR-Cas9技术建立高效重组痘苗载体系统。本研究首先构建了叁个靶向痘苗病毒天坛株TK区的gRNA-Cas9的质粒以及重组质粒pJ2R-EGFP,通过瞬时转染gRNA-Cas9或建立gRNA-Cas9稳定细胞系后,导入重组质粒pJ2R-EGFP并感染VTT,获得表达EGFP的重组病毒。此高效重组痘苗病毒载体系统的重组效率比传统的同源重组方法大大提高。因此,本研究建立的高效痘苗病毒载体重组系统,为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供参考价值。(本文来源于《病毒学报》期刊2019年02期）
赵颖,黄盼盼,赵莉,任皎,张鹏[3]（2019）在《复制缺陷型痘苗病毒天坛株的细胞生物学特性及复制缺陷机制探究》一文中研究指出痘苗病毒减毒株作为基因表达载体,广泛应用于多种疾病的预防和治疗。复制缺陷型痘苗病毒天坛株(Non-replicating Tiantan vaccinia virus,NTV)作为一株高度减毒的痘苗病毒株,其生物学特性和复制缺陷机制还有待研究。探究NTV细胞生物学特性和复制缺陷机制。在不同种属和组织来源的细胞中测定NTV复制能力、细胞嗜性和毒力;Western Blot检测HeLa细胞中的NTV的A17/A27蛋白表达水平,Real-time PCR检测晚期蛋白A17/A27转录水平。NTV在BHK-21、CEF细胞中可有效复制和扩散,而在Vero细胞及人源细胞HeLa、2BS、Hep-2和143TK-中均不能有效复制;在HeLa细胞中,晚期蛋白A17和A27蛋白表达受阻,而转录水平基本不变。NTV是一株复制缺陷型痘苗病毒,在多种细胞中复制和扩散受限;NTV晚期蛋白A17和A27的表达受阻且与蛋白表达转录水平无关,初步判定蛋白表达受阻发生在蛋白翻译阶段。(本文来源于《病毒学报》期刊2019年01期）
彭泽旭,刘苏苏,王辰飞,谷文达,刘强[4]（2018）在《复制型天坛株痘苗病毒在免疫缺陷型大鼠体内的生物分布特点及其对组织病理变化的影响》一文中研究指出目的研究复制型天坛株痘苗病毒(r TV)在免疫缺陷型Rag2基因敲除(Rag2-/-)大鼠体内的生物分布特点及其对组织病理变化的影响,为复制型痘苗病毒载体疫苗的应用和安全性评价提供参考。方法 r TV分别以尾静脉注射途径感染免疫缺陷型Rag2-/-大鼠和野生型SD大鼠,以背部皮下注射途径感染免疫缺陷型Rag2-/-大鼠。利用Taq Man探针法实时荧光定量PCR检测痘苗病毒在大鼠体内的生物分布和病毒载量,比较分析两种模式动物Rag2-/-大鼠和SD大鼠感染r TV后的生物分布特点及r TV以不同途径感染Rag2-/-大鼠后的生物分布特点,并对感染过r TV的所有组织样本进行HE染色,比较分析不同分组大鼠感染r TV后的组织病理变化。结果与SD大鼠相比,r TV在免疫缺陷型Rag2-/-大鼠的生物分布范围更广;在免疫缺陷型Rag2-/-大鼠中,r TV尾静脉注射感染途径的效果要强于皮下注射的感染途径;r TV尾静脉注射途径感染Rag2-/-大鼠的心、睾丸和后爪的病毒载量显着高于尾静脉注射途径感染SD大鼠(P<0.001)和皮下注射途径感染Rag2-/-大鼠(P<0.001);与SD大鼠和皮下感染途径相比,通过尾静脉途径感染免疫缺陷型Rag2-/-大鼠的组织病理变化较明显,且均无由r TV引起的病理性损伤。结论复制型天坛株痘苗病毒在免疫缺陷型Rag2-/-大鼠体内表现出较广的组织分布、较高的表达水平及非特异性的组织病理变化,为其作为免疫缺陷类型患者的载体疫苗的应用的安全性提供了新的依据。(本文来源于《山西医科大学学报》期刊2018年07期）
李一权,李霄,金宁一[5]（2017）在《基因缺失型减毒天坛株痘苗病毒的构建及筛选》一文中研究指出引言痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)具有基因组庞大、宿主范围广,且只在胞浆内复制等特点。因而,作为疫苗载体广泛应用于各种传染病、心血管疾病、免疫缺陷病和肿瘤疾病的治疗领域。虽然,传统的痘苗病毒,如我国的天坛株痘苗病毒,作为疫苗在消灭天花过程中发挥了重要作用,但也常引起程度不等的副作用,如全身乏力、发热、皮疹、脑炎和眼部牛痘感染,尤其对免疫抑制患(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集》期刊2017-08-20）
郭丽娇[6]（2017）在《天坛株痘苗病毒TC/TK基因缺失株的筛选与鉴定》一文中研究指出目的:本研究致力于构建一株减毒且免疫原性高的痘苗病毒载体。方法:通过同源重组技术删除痘苗病毒天坛株的TK2L-TC7L基因,利用EGFP和Cre/Lox P重组系统筛选基因缺失痘苗病毒TK/TC VTT。体外实验中,痘苗病毒TK/TC VTT和VTT通过结晶紫染色和MTS检测分析扩散能力和细胞毒性。体内实验中,通过鼻腔和颅内注射对比小鼠体重变化和死亡率分析基因缺失病毒TK/TC VTT的体内毒力;以及特异性抗体水平和T细胞增殖分析TK/TC VTT的免疫原性。结果:成功构建了基因缺失痘苗病毒TK/TC VTT,TK2L-TC7L基因缺失不影响病毒的正常复制且遗传稳定性好,而且显着减弱了病毒毒力并有效诱导机体的免疫应答。结论:本研究为未来医学领域提供了一种减毒、高效的痘苗病毒载体疫苗。(本文来源于《长春中医药大学》期刊2017-04-01）
李一权[7]（2016）在《基因缺失型天坛株痘苗病毒构建及实验免疫研究》一文中研究指出痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)具有基因组庞大、宿主范围广,且只在胞浆内复制等特点。因而,作为疫苗载体广泛应用于各种传染病、心血管疾病、免疫缺陷病和肿瘤疾病的治疗领域。虽然,传统的痘苗病毒,如我国的天坛株痘苗病毒,作为疫苗在消灭天花过程中发挥了重要作用,但也常引起程度不等的副作用,如全身乏力、发热、皮疹、脑炎和眼部牛痘感染,尤其对免疫抑制患者、慢性皮肤病患者和心脏病患者尤为严重。目前已开发了多种以痘苗病毒为载体的基因工程活载体疫苗。除了作为表达载体已取得令人瞩目的成绩外,痘苗病毒载体还具有一定的问题,如载体构建程序复杂、外源筛选标记插入困难和重组病毒筛选困难等问题。因此,进一步提高载体疫苗效率、载体的安全性、简化制备程序,仍成为痘苗病毒载体的研究热点。本研究通过同源重组技术、Cre/loxp系统逐步敲除天坛株痘苗病毒上的TC7L~TK2L(包括C7L、C6L、C5L、C4L、C3L、C2L、C1L、N1L、N2L、M1L、M2L、K1L和K2L)、TE3L、TA35R、TB13R及TA66R等基因片段,以达到减弱病毒毒力和缩小病毒宿主范围等目的。随后本研究通过体内外不同实验分析了缺失型痘苗病毒的毒力。首先通过结晶紫染色实验和MTT检测实验分析了缺失型痘苗病毒的细胞内扩散能力和细胞毒性。其次,通过鼻腔接种和颅内接种途径感染小鼠后,观察体重变化和生存率,分析了缺失型痘苗病毒的毒力水平;通过皮内接种途径感染家兔后,观察痘斑大小,分析了缺失型痘苗病毒对皮肤的损伤作用。进而,通过免疫小鼠,分析了缺失型痘苗病毒的免疫原性。包括,T淋巴细胞增殖实验、细胞因子检测实验、特异性抗体检测实验及中和抗体检测实验来进一步分析验证了缺失型痘苗病毒的免疫原性。结果表明,成功构建了缺失TC7L~TK2L、TE3L、TA35R、TB13R及TA66R基因的缺失型痘苗病毒MVTTEAB,遗传稳定性良好。5段基因的缺失不影响缺失型痘苗病毒的形态发生和正常复制。细胞水平检测病毒毒力结果表明,MVTTEAB在细胞中的扩散能力及细胞毒性显着减弱。痘苗病毒在家兔皮肤和小鼠体内的毒力检测表明,5段基因的缺失显着减弱了痘苗病毒在动物体内的毒力,提高了安全性。BALB/c小鼠免疫MVTTEAB后的免疫原性实验结果表明,基因缺失型痘苗病毒可诱导机体产生有效的体液及细胞免疫应答,并保持了其作为疫苗的免疫原性。总之,TC7L~TK2L、TE3L、TA35R、TB13R及TA66R基因的缺失在不影响免疫原性的基础上减弱了病毒毒力,且减小了宿主范围。该病毒载体为重组载体疫苗的研究奠定了基础。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2016-05-01）
牛燕,张良艳,李恒彬,邢丽,石辛甫[8]（2015）在《MIP-1a细胞因子与痘苗病毒天坛株终身免疫保护性的相关性》一文中研究指出目的分析MIP-1a细胞因子与痘苗病毒天坛株(vaccinia virus Tian Tan strain,VTT)终身免疫保护性的相关性。方法将VTT分别经肌肉注射免疫C57/BL6小鼠和MIP-1a的KO小鼠模型B6.129P2-Ccl3,每只剂量2×107PFU/ml,每组10只,30和180 d后,再次用相同剂量的VTT进行激发,激发3 d后,处死小鼠,取脾淋巴细胞,采用流式细胞术分析CD44+CD62L-CD4+的外周效应记忆性T细胞(effector memory T cell,Tem)在两种小鼠体内的差异;同时用四聚体(tetramer)对荷载痘苗病毒特异性的CD8+T细胞表位(VACV-B8R20-27 Kb)进行染色,分析MIP-1a的缺失对长效免疫记忆的影响。结果获取的CD4+的记忆性T细胞的表型以CD4+CD44+CD62L-为主,即以Tem为主;获取的CD8+的记忆性T细胞也以Tem(CD44+CD62L-)为主,数量很少。B6.129P2-Ccl3小鼠受到再次激发后,体内VTT特异性CD8+T细胞在30和180 d的比例均明显少于C57/BL6小鼠;在30 d激发时,tetramer+CD8+T细胞的比例明显高于180 d激发。结论 MIP-1a细胞因子与痘苗病毒产生长效免疫记忆相关,本实验为延长疫苗的免疫记忆提供了参考。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2015年03期）
李一权,阚式绂,胡宁宁,姜爽,陈智飞[9]（2014）在《缺失TC7L-TK2L基因减毒天坛株痘苗病毒构建及筛选》一文中研究指出目的通过敲除天坛株痘苗病毒(Vaccinia virus Tiantan strain,VTT)的复制非必需基因TC7L-TK2L,并结合双标记筛选及外源筛选标记敲除技术构建TC7L-TK2L基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TC7L--TK2L-。方法人工合成含有痘病毒早晚期复合强启动子pE/L和外源筛选标记增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的重组臂,构建穿梭质粒pTC7L-TK2L-EGFP,再与VTT共转染BHK-21细胞,通过连续筛选10次,获得含有筛选标记的重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L--EGFP+;利用Cre/loxp系统敲除EGFP,连续筛选10次,获得无筛选标记的重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L-,用PCR方法对rVTT-TC7L--TK2L-进行鉴定和遗传稳定性检测,用电镜观察病毒形态变化,并通过绘制生长曲线观察病毒在细胞内的复制情况。结果 PCR结果表明,成功构建了重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L-,且具有良好的遗传稳定性;电镜观察痘苗病毒缺失TC7L-TK2L基因未影响病毒形态;生长曲线显示敲除TC7L-TK2L基因后病毒毒力显着下降,但不影响病毒的正常复制。结论成功构建了痘苗病毒减毒株rVTT-TC7L--TK2L-,该重组痘苗具有良好的遗传稳定性且毒力减弱。(本文来源于《中国病原生物学杂志》期刊2014年11期）
姜爽,阚式绂,胡宁宁,陈智飞,李一权[10]（2014）在《缺失TA35R基因减毒天坛株痘苗病毒的构建及筛选》一文中研究指出通过敲除痘苗病毒天坛株(vaccinia virus tiantan strain,VTT)复制非必需基因TA35R,结合双筛选标记及同源重组技术,构建TA35R基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TA35R-。人工合成含有TA35R重组臂、同向loxp序列、早晚期启动子PE/L、EGFP及酶切位点的穿梭质粒pTA35R-EGFP。pTA35R-EGFP和野生型VTT共转染BHK-21细胞,通过绿色荧光蚀斑筛选,构建缺失TA35R基因且含FGFP基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R--EGFP+。采用Cre/Loxp系统敲除外源筛选标记EGFP,获得缺失TA35R基因的重组痘苗病毒rVTT-TA35R-,利用PCR方法和电子显微镜对其进行鉴定,通过MTT法检测细胞噬性以评价其减毒效果。结果表明,所构建的痘苗病毒弱毒株rVTT-TA35R-完全缺失了TA35R基因和外源筛选标记EGFP,且细胞毒性减弱。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2014年12期）
痘苗病毒天坛株论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
以痘苗病毒为载体的溶瘤病毒作为癌症治疗的新方向效果显着。同时,痘苗病毒还可以作为疫苗载体抵抗HIV、H5N1等病毒感染。因技术限制,重组痘苗病毒主要通过同源重组的方法获得,但此方法获得重组病毒的效率较低。随着CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9技术成功应用于多种动物、组织和细胞的基因编辑中,本研究拟利用CRISPR-Cas9技术建立高效重组痘苗载体系统。本研究首先构建了叁个靶向痘苗病毒天坛株TK区的gRNA-Cas9的质粒以及重组质粒pJ2R-EGFP,通过瞬时转染gRNA-Cas9或建立gRNA-Cas9稳定细胞系后,导入重组质粒pJ2R-EGFP并感染VTT,获得表达EGFP的重组病毒。此高效重组痘苗病毒载体系统的重组效率比传统的同源重组方法大大提高。因此,本研究建立的高效痘苗病毒载体重组系统,为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供参考价值。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
痘苗病毒天坛株论文参考文献
[1].张迪.高效重组且无筛选标记痘苗病毒天坛株载体系统的建立[D].北京协和医学院.2019
[2].张迪,许丰雯,熊梓辰,郭斐.高效重组痘苗病毒天坛株载体系统的建立[J].病毒学报.2019
[3].赵颖,黄盼盼,赵莉,任皎,张鹏.复制缺陷型痘苗病毒天坛株的细胞生物学特性及复制缺陷机制探究[J].病毒学报.2019
[4].彭泽旭,刘苏苏,王辰飞,谷文达,刘强.复制型天坛株痘苗病毒在免疫缺陷型大鼠体内的生物分布特点及其对组织病理变化的影响[J].山西医科大学学报.2018
[5].李一权,李霄,金宁一.基因缺失型减毒天坛株痘苗病毒的构建及筛选[C].中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集.2017
[6].郭丽娇.天坛株痘苗病毒TC/TK基因缺失株的筛选与鉴定[D].长春中医药大学.2017
[7].李一权.基因缺失型天坛株痘苗病毒构建及实验免疫研究[D].吉林农业大学.2016
[8].牛燕,张良艳,李恒彬,邢丽,石辛甫.MIP-1a细胞因子与痘苗病毒天坛株终身免疫保护性的相关性[J].中国生物制品学杂志.2015
[9].李一权,阚式绂,胡宁宁,姜爽,陈智飞.缺失TC7L-TK2L基因减毒天坛株痘苗病毒构建及筛选[J].中国病原生物学杂志.2014
[10].姜爽,阚式绂,胡宁宁,陈智飞,李一权.缺失TA35R基因减毒天坛株痘苗病毒的构建及筛选[J].中国兽医学报.2014
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