（1福建福州肺科医院肿瘤科350008；2福建医科大学临床教学医院呼吸内科350008）
摘要：目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）患者癌组织miR系列基因表达水平与手术疗效的相关性。方法分别收集2013年10月至2017年4月的同时收集25例NSCLC手术患者的癌组织和癌旁组织冰冻样本，以及手术前和手术后2周的血清样本。组织totalRNA抽提使用ThemirVanamiRNAIsolationKit（Ambion，Austin，Texas，USA）。血清的totalRNA使用microRNAsIsolationKit（AppliedBiosystems，ForsterCity，CA，USA）抽提。totalRNA溶于DEPC处理水中，零下80度保存。RNA浓度使用Nanodrop2100（NanoDrop，Wilmington，DE）测量。采用qRT-PCR方法检测NSLCLC患者手术前、后血清miR系列基因表达水平，判断血清miR系列基因表达水平与手术效果的关系。结果NSLCLC患者的组织中miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达与癌旁组织存在显著差异（P＜0.01）。NSLCLC患者手术后的血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达与手术前存在明显差异（P＜0.05）。结论miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达水平在NSCLC患者癌组织内明显升高，手术切除后血清基因表达明显下降。血清miR系列基因有可能成为预测NSCLC手术预后的分子标志物。
关键词：非小细胞肺癌；miR系列基因；手术；预后
TheCorrelationBetweenTheExpressionLevelsofmir-17-3p，mir-18a，mir-19a，mir-20a，mir-19b-1andmir-92-1inNSCLCPatientswithTheEfficacyofTheOperation
CHENqun，SHIqin.DepartmentofOncology，FuzhouPulmonaryHospital，TheTeachingHospitalofFujianMedicalUniversity，Fuzhou350008，China.
[Abstract]objective：TostudythecorrelationbetweencancertissuemiRgeneexpressionwithsurgicalefficacyinnon-smallcelllungcancer（NSCLC）.Methods：FromOct2013toApril2017，50NSCLCfrozentissueandserumsamples，Each25takedfromcancertissueandadjacenttissues.Serumsampleswerecollectedwithin2weeksbeforeandafteroperation.TotalRNAextractionusingThemirVanamiRNAIsolationKit（Ambion，Austin，Texas，USA）.TotalRNAofserumwasextractedusingmicroRNAsIsolationKit（AppliedBiosystems，ForsterCity，CA，USA）.TotalRNAissolubleinDEPCtreatmentwater，minus80degrees.RNAconcentrationwasmeasuredusingNanodrop2100（Nanodrop，Wilmington，DE）.Qrt-pcrwasusedtodetecttheexpressionlevelofserummir-seriesbeforeandafteroperationofNSLCLCpatients，andtodeterminetherelationshipbetweentheexpressionlevelofserummir-seriesgeneandthesurgicaleffect.Results：Theexpressionofmir-17-3p，mir-18a，mir-19a，mir-20a，mir-19b-1andmir-92-1inthecancertissuesofNSLCLCpatientsweresignificantlydifferentfromthatoftheadjacenttissues（P<0.01）.Serummir-17-3p，mir-18a，mir-19a，mir-20a，mir-19b-1andmir-92-1weresignificantlydifferencesafterandbeforesurgery（P<0.05）.Conclusion：theexpressionlevelofmir-17-3p，mir-18a，mir-19a，mir-20a，mir-19b-1andmir-92-1wassignificantlyincreasedinpatientswithNSCLC，andtheserumgeneexpressiondecreasedsignificantlyaftersurgicalresection.Theserummir-seriesgenemaybeamolecularmarkertopredicttheprognosisofNSCLCsurgery.
Keywords：nonsmallcelllungcancer；miRseriesgene；Operation；prognosis
非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌总数的80%，手术是治疗早期非小细胞肺癌的主要手段之一，但临床缺少较为准确地评价手术后效果的手段。当前除了常规指标，miR系列基因也被广泛用作评价NSCLC的临床疗效指标。大部分学者关于miR系列基因与NSCLC预后的研究涉及其中的1-2个指标，准确性很有限。本研究涉及6个指标miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1，因此可以提供更准确的判断。
1资料与方法
1.1临床资料
分别收集2013年10月至2017年4月的同时收集25例NSCLC手术患者的癌组织和癌旁组织冰冻样本，以及手术前和手术后2周的血清样本，并按期整理临床治疗资料。
1.2方法
1.2.1RNA分离提取
按照试剂说明书，组织totalRNA抽提使用ThemirVanamiRNAIsolationKit（Ambion，Austin，Texas，USA）。血清的totalRNA使用microRNAsIsolationKit（AppliedBiosystems，ForsterCity，CA，USA）抽提。totalRNA溶于DEPC处理水中，零下80度保存。RNA浓度使用Nanodrop2100（NanoDrop，Wilmington，DE）测量。
1.2.2qRT-PCR分析
差异表达使用Two-stepqRT-PCR分析。第一步cDNA的反转录，第二步是real-timequantitativePCR。miRNA的反转录相关操作严格按试剂盒OneStepPrimeScript®；microRNAcDNASynthesisKit（Takara，Tokyo，Japan）操作说明进行，反转录的反应体系为[3-4]：2×microRNAReactionBufferMix10μμ1，0.1％BSA2μ1，microRNAPrimsScript®；RTEnzymeMix2μ1，TotalRNA1μ1，RNaseFreeddH2O5μ1。反转录反应条件：37℃60min，85℃变性5s。microRNA的qRT-PCR严格按照试剂盒SYBR®；PremixEXTaqTMⅡ（Takara，Tokyo，Japan）操作说明进行，qRT-PCR的反应体系为SYBR®；PremixEXTaqTMⅡ12.5μ1，PCRForwardPrimer1μ1，Uni-miRqPCRPrimer1μ1，模板2μ1，ddH2O8.5μ1。qRT-PCR反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火和延伸30s，共40个循环。定量PCR使用ABI7900的FastrealtimePCRsystem（AppliedBiosystems，Carlsbad，CA）执行，每个样本平行重复3次，采用U6snRNA做参考基因，2-△△Ctmethod用于计算基因表达倍数变化。
1.3统计学方法
数据分析使用SPSS21.0统计学软件，所有数据均符合正态分布，计量数据以均数±标准差（?x±s）表示，进行t检验，统计数据P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1癌组织与癌旁组织的miR系列基因表达水平
具体结果见表1，由表1可知NSLCLC患者的组织中miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达与癌旁组织存在明显差异（P＜0.05）。
3讨论
miR系列基因在多种肿瘤细胞中表达异常[1-4]。林铿强和王欢等[5，6]的研究结果显示NSCLC患者癌组织中miR系列基因的表达显著高于癌旁组织，此外，Gallardo等[7]分析了70例NSCLC患着的肿瘤组织，发现miR-34家族在肿瘤组织中表达下调且与术后复发率高有关，同时存在p53突变和miR-34表达下调的患者术后复发率最高，多因素分析显示miR-34a是NSCLC术后复发的独立预测因素。因此，在肿瘤的诊断及治疗中可以通过监测患者的miR系列基因的变化可以判断NSCLC患者的发病情况、化疗后患者的康复情况，也可以作为判断NSCLC患者预后的重要指标。
本课题同时利用组织和血清样本检测miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1表达水平，先确定了靶病灶组织中与切除前血清中miR系列基因表达的相关性，再检测靶病灶手术切除后的血清样本中miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1表达的变化，有助于提高准确性和可靠性。结果显示手术前NSCLC患者癌组织和血清miR系列基因的高表达存在高度的一致性，说明miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1的表达与肿瘤的发生、发展具有密切关系。但如果通过检测靶病灶组织miR系列基因表达水平，作为NSCLC患者手术疗效的观察指标，缺乏可行性。
外周血miR系列基因的稳定性比较强，不受外界环境及自身的生理状态的影响，可以准确的反应人体自身的生理变化[8]，那么外周血miR系列基因能否应用于NSCLC手术后疗效预后的评价？本研究结果显示手术后患者的血清miR系列基因表达较术前明显降低，说明了miR系列基因可以用作评价NSCLC手术疗效预后观察。
综上所述，miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达水平在NSCLC患者癌组织内和手术前患者血清中高表达，手术切除后血清基因表达明显下降。血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因有可能成为预测NSCLC手术疗效的分子标志物。
参考文献
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注：基金项目：福建省科技自然基金资助项目（No：2014J01387）
个人简介：陈群，男，1965年9月，本科，籍贯：福建福州，现任职称：主任医师，研究方向：胸部肿瘤诊断治疗
通讯作者：石琴，女，1976年1月，本科，籍贯：福建福州，现任职称：副主任医师，研究方向：胸部肿瘤诊断治疗。