一、CLONING AND SEQUENCING OF MATURE FRAGMENT OF HUMAN BMP4 GENE（论文文献综述）
张明[1]（2021）在《DNA甲基化和H3K4me2拮抗调节BMP4促进鸡PGCs形成的机制研究和潜在应用》文中提出原始生殖细胞（Primordial Germ Cells,PGCs）是配子的前体,精子和卵子的祖细胞,负责代与代之间传递遗传和表观遗传信息,确保物种的延续和生存,并且在发育生物学研究、物种保护以及养殖生产领域有着极其重要的意义。鸟类的PGCs因为其独特的发育特点使其成为保护濒危动物和种质资源恢复的有力工具,然而由于体内分离的PGCs数量有限,诱导体系不成熟使其难以大量获取,限制了其应用。其中的关键问题在于影响PGCs发生具体因素仍不明朗,因此科学家迫切需要剖析和阐明PGCs形成过程中的分子调控机制。近年来,研究者们已经发现了 PGCs发生过程中的众多参与调控的基因、细胞因子、信号通路和表观遗传修饰等因素,本课题组前期研究中已经确定BMP4是鸡PGCs形成中的关键基因,并且全基因组存在DNA和H3K4me2的动态变化,但是其中的具体分子调控机制尚不清楚。而随着基因组学的深入研究,人们愈发认识到基因表达模式中存在多种表观遗传现象同时相互作用从而和其他调控元件构成复杂而有序的遗传分子图谱。所以深入探索DNA和H3K4me2这两种不同表观遗传因素对鸡PGCs形成中的关键基因BMP4的影响和理清这些因素与基因的调控元件互作的模式机制有利于人们更加系统全面地认识鸡PGCs的形成机理。为此,本研究根据鸡生殖细胞上的DNA和组蛋白甲基化的动态变化推测表观遗传因素能够调控关键基因参与PGCs的形成,故首先验证DNA甲基化对PGCs形成的影响并且基于课题组前期在鸡胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）、和PGCs上H3K4me2的ChIP-seq以及DNA甲基化测序MBD-seq结果筛选确定PGCs形成中的关键基因—BMP4,利用dCas9系统验证DNA甲基化对BMP4的靶向调控作用,进而探索DNA甲基化、H3K4me2和转录因子如何共同调控BMP4转录参与PGCs形成的机制。该研究为阐明PGCs发生过程的表观遗传通路,完善优化PGCs诱导形成体系,推广PGCs的研究应用提供思路和依据。研究结果如下:（1）DNA甲基化调控PGCs的形成通过前期ESCs和PGCs中转录组数据分析DNA甲基化修饰酶的表达变化,确定Dnmt3A和Tet1是影响DNA甲基化的关键修饰酶;分别构建了Dnmt3A和Tet1的Dnmt3A-shRNA1、Dnmt3A-shRNA2和Dnmt3A-shRNA3,以及Tet1-shRNA1、Tet1-shRNA2 和Tet1-shRNA3 干扰载体,转染 DF1 细胞qRT-PCR分析Dnmt3A-shRNA1和Tet1-shRNA3干扰活性最佳（P<0.01）,选择作为用于后续验证实验。体内外验证DNA甲基化对PGCs形成的影响,体外实验中干扰Dnmt3A组第4d出现大量类胚体聚团,6d出现大量即将细胞破裂的类胚体,而干扰Tet1第4d和6d都未出现类胚体;Dot-blot检测发现干扰Dnmt3A组甲基化水平显着降低（P<0.05）,干扰了 Tet1后DNA甲基化水平小幅上升;qRT-PCR检测干扰Dnmt3A组6d后Cvh、C-kit、BMP4、Blimp1和Lin28a表达显着上升（P<0.05）,而干扰了Tet1后各基因组出现显着下调（P<0.05）;而流式细胞分析发现干扰Dnmt3A后PGCs形成率显着提升（P<0.05）,干扰Tet1后的PGCs形成率显着下调。体内实验中qRT-PCR检测发现干扰Dnmt3A组BMP4、Cvh和C-kit的表达都显着提高（P<0.05）,Blimp1和Lin28a的表达极显着上调（P<0.01）,干扰Tet1后Cvh、C-kit、BMP4、Blimp1和Lin28a都发生了极显着下调（P<0.01）;流式细胞仪分析发现干扰Dnmt3A后PGCs形成效率显着提升（P<0.05）,干扰Tet1后PGCs形成效率显着下调（P<0.05）。以上结果表明DNA甲基化抑制PGCs的形成,DNA去甲基化促进PGCs的形成。（2）PGCs形成中DNA甲基化和H3K4me2参与调控BMP4基因对ESCs和PGCs的ChIP-seq以及MBD-seq结果进行联合分析,筛选得到PGCs形成过程中受DNA甲基化和H3K4me2调控的TGF-β通路中关键基因BMP4并作为靶基因研究对象。成功构建pBMP4-EGFP-N1载体,验证具有启动活性;成功构建BMP4不同长度缺失片段启动子-basic载体,双荧光素酶报告系统验证pGL3-613极显着高于pGL3-508和pGL3-281（P<0.01）,说明508-613bp为BMP4的核心启动子区。生物信息学方法预测BMP4核心启动子区的CpG岛并通过重亚硫酸盐测序的方法比较在CEFs、ESCs和PGCs中DNA甲基化水平,结果发现ESCs中BMP4启动子区平均DNA甲基化水平显着高于PGCs（P<0.05）;基于组蛋白H3K4me2的ChIP-qPCR发现PGCs中BMP4启动子上H3K4me2富集水平显着高于ESCs（P<0.05）,并且主要集中于核心启动子区;进一步通过qRT-PCR检测发现PGCs中BMP4和Smad1显着高于ESCs（P<0.05）,Bmpr1、Bmpr2和C-kit则极显着高于ESCs（P<0.01）;通过Western Blot检测BMP4信号下游磷酸化p-Smad1/3/5复合蛋白在PGCs中显着高于ESCs（P<0.05）。以上结果说明PGCs形成关键基因BMP4在ESCs和PGCs表达上升伴随着启动子区DNA甲基化水平下降和H3K4me2的富集增多。（3）CRISPR-dCas9介导的TET1靶向BMP4启动子DNA去甲基化促进PGCs形成针对BMP4启动子区CpG岛分别设计三对sgRNA序列,连接至pgRNA-humanized载体重组构建成功sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3引导载体,与dCas9-TET1CD分别组合转染DF1细胞检测激活BMP4效果,经过qRT-PCR检测发现sgRNA和dCas9-TET1CD载体的组合都能极显着增强BMP4表达（P<0.01）,当sgRNA1、2和3混合与dCas9-TET1CD组合共转时BMP4表达达到最高（3.473±0.187）,说明多个sgRNA靶定同一个基因可以达到最佳激活效果。在体外ESCs诱导过程中sgRNA1-3和dCas9-TET1CD共转后通过重亚硫酸盐转化测序发现BMP4启动子区甲基化水平显着下降（P<0.05）,而通过qRT-PCR检测发现BMP4表达极显着升高（P<0.01）,下游信号基因Bmpr1、Smad1表达显着升高（P<0.05）,PGCs的标记基因Blimp1和Lin28a表达量也显着升高（P<0.05）,而Cvh和C-kit的上调更为显着（P<0.01）,而Dnmt3A和Tet1表达无明显差异;Western Blot检测BMP4下游磷酸化p-Smad1/3/5蛋白表达显着上升（P<0.05）;流式细胞仪分析检测PGCs的形成率显着提高（P<0.05）。体内0d尿囊腔注射sgRNA1-3和dCas9-TET1CD后通过qRT-PCR检测BMP4和PGCs形成中的标记基因Cvh、C-kit、Blimp1以及Lin28a表达都显着升高（P<0.05）,Western Blot检测p-Smad1/3/5蛋白显着增加（P<0.05）,流式分析检测发现注射sgRNA1-3和dCas9-TET1CD组的PGCs形成效率显着升高（P<0.05）。以上结果说明靶向BMP4启动子区DNA去甲基化可以增加BMP4表达,促进PGCs的形成。（4）DNA甲基化和组蛋白甲基化拮抗调节BMP4信号参与PGCs的形成通过生物信息学预测BMP4启动子区潜在转录因子LIN54、ZEB1和NFAT5,并通过构建缺失结合位点的核心启动片段连接Basic载体,转染DF1细胞后通过双荧光素酶报告系统检测发现只有在缺失了 ZEB1的结合位点之后启动活性极显着降低（P<0.01）,说明ZEB1是BMP4核心启动子区域的关键转录因子。构建Zeb1的过表达载体之后转染DF1细胞,qRT-PCR检测过表达Zeb1后的Zeb1和BMP4表达量显着上升（P<0.05）,并且Zeb1在体内0-6d的过程中表达逐渐升高;而oe-Zeb1与核心启动片段basic载体共转DF1细胞,双荧光素酶检测BMP4核心启动子片段的启动活性显着升高（P<0.05）,以上结果表明Zeb1作为BMP4转录因子可促进其转录表达。成功构建Dnmt3A和Tet1的过表达载体,与组蛋白去甲基化酶LSD1过表达载体一起共转染DF1细胞后,48h后双荧光素酶报告系统检测发现启动活性极显着下调（P<0.01）,接着转染Tet1和Zeb1的过表达载体96h后再次检测启动活性发生了显着上调（P<0.05）。结果说明DNA甲基化和H3K4去甲基化能够抑制BMP4转录活性,而在DNA去甲基化和转录因子Zeb1能够挽救和增强BMP4的转录活性。ChIP-qPCR检测PGCs细胞发现ZEB1和H3K4me2在BMP4启动子的核心区域都存在富集,干扰了 Dnmt3A时,H3K4me2的富集水平和ZEB1的结合都发生了显着的增加（P<0.05）,CpG岛的DNA甲基化水平显着下降（P<0.05）;而在干扰了组蛋白甲基化酶MLL2后BMP4启动子区的H3K4me2的富集水平和ZEB1的结合都发生了显着的减少（P<0.05）,DNA甲基化水平发生了显着上升（P<0.05）。结果表明DNA去甲基化可以增加BMP4的核心启动子区里H3K4me2的富集和转录因子ZEB1的结合,而H3K4me2去甲基化能够相应的减少H3K4me2和ZEB1的富集和结合,并且DNA甲基化和H3K4me2的富集水平呈拮抗关系,为下一步深入探索表观遗传通路在PGCs形成的具体机制奠定了良好基础。
艾锦新[2]（2020）在《黔北麻羊BMP2、BMP4基因甲基化与生长性状的遗传效应研究》文中研究指明骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic proteins-2）和骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic proteins-4）属转化生长因子超家族（TGF-β）重要成员,是动物机体生长发育过程中的必需因子,其生物学作用几乎涉及全身所有系统,尤其是在诱导动物骨组织形成及生长方面具有重要的调控作用。鉴于BMP2和BMP4基因具有如此重要的功能,本研究将BMP2和BMP4基因作为影响黔北麻羊生长性状的候选基因,从分子遗传角度,通过直接测序技术检测黔北麻羊BMP2和BMP4基因的多态性,并筛选出与黔北麻羊生长性状显着相关的位点。从表观遗传学角度,运用亚硫酸氢盐处理后测序（BSP）技术探究BMP2和BMP4基因启动子区Cp G岛的甲基化状态,并与荧光定量PCR检测到的m RNA表达量进行相关分析,以明确甲基化程度与基因表达水平间的关系。从细胞分子生物学角度,构建BMP2、BMP4基因真核表达载体,并转染黔北麻羊成肌细胞,MTT法检测过表达后细胞的增殖情况,为阐释BMP2和BMP4基因对骨骼肌生长发育的生物学作用及机制提供理论参考。主要研究结果如下:1、BMP2和BMP4基因的多态性及其对黔北麻羊生长性状的影响利用直接测序法检测200只4～6月龄黔北麻羊（公、母羊各100只）BMP2和BMP4基因的SNPs位点,其中BMP2基因共筛选出3个SNPs位点,分别为g.48698728 T>C,g.48700188 G>A和g.48700206 G>A（位于内含子2）;BMP4基因共筛选出5个SNPs位点,分别为g.33676037 T>C和g.36676044 G>A（位于启动子区）,g.36679942 G>A和g.36680005 G>T（位于内含子1）,g.36681702T>C（位于内含子2）。根据测序结果,各突变位点均存在三种基因型,遗传特性分析表明,各突变位点均属于中度多态性（0.25<P<0.50）。卡方（χ2）检验结果显示,在BMP2基因3个SNPs位点中,g.48698728T>C和g.48700206G>A突变位点的基因型分布未偏离Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）,g.48700188G>A突变位点的基因型分布极显着偏离了Hardy-Weinberg平衡（P<0.01）;在BMP4基因5个SNPs位点中,各SNPs位点均未偏离Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。单倍型和连锁不平衡分析表明,BMP2基因3个SNPs位点在群体中存在5种单倍型,其中有3种发生频率最高,g.48700188G>A和g.48700206G>A位点存在强连锁不平衡效应;BMP4基因5个SNPs位点在群体中存在10种单倍型,其中有4种发生频率最高,g.33676037T>C和g.36681702T>C、g.36676044G>A和g.36679942G>A、g.36676044G>A和g.36680005G>T、g.36676044G>A和g.36681702T>C、g.36679942G>A和g.36680005G>T、g.36679942G>A和g.36681702T>C位点间存在强连锁不平衡效应。关联性分析结果表明,BMP2和BMP4基因的多态性与多个生长性状存在显着差异（P<0.05）。因此,有望将这些SNPs作为候选分子遗传标记进一步研究。2、黔北麻羊BMP2、BMP4基因组织表达谱分析实时荧光定量PCR结果显示,BMP2、BMP4基因在黔北麻羊各组织中广泛表达,在肺脏组织中的表达量差异极显着（P<0.01）。其中,BMP2基因表达量的依次为:肺脏>下丘脑>脂肪>肌肉>肾脏>小肠>胸腺>肝脏>胃脏>心脏>脾脏;BMP4基因表达量的依次为:肺脏>肌肉>肾脏>下丘脑>脂肪>下丘脑>小肠>心脏>胃脏>脾脏>胸腺>肝脏。除胃外,BMP2、BMP4基因在6月龄黔北麻羊各组织中的表达量显着高于1.5周岁黔北麻羊各组织中的表达量（P<0.05）。3、BMP2、BMP4基因启动子区Cp G岛甲基化水平与m RNA表达的关系利用亚硫酸氢盐处理后测序（BSP）技术,对不同生长发育阶段黔北麻羊肺脏、肌肉、脂肪组织中BMP2、BMP4基因启动子区Cp G岛的甲基化状态进行探究。结果表明,BMP2、BMP4基因在肺脏、肌肉、脂肪组织中甲基化水平相对较低,3种组织的甲基化程度存在差异。在不同生长发育阶段,6月龄黔北麻羊肺脏、肌肉中的甲基化水平显着低于1.5周岁黔北麻羊肺脏、肌肉中的甲基化水平（P<0.05）。BMP2、BMP4基因甲基化程度与m RNA表达量相关分析显示,二者之间呈负相关趋势。4、BMP2、BMP4基因过表达对成肌细胞增殖分化的影响利用同源重组法构建BMP2、BMP4基因过表达载体p EGFP-N3-BMP2和p EGFP-N3-BMP4,成功转染已鉴定的黔北麻羊成肌细胞,q RT-PCR检测过表达后BMP2、BMP4基因及分化标志基因Myo D、Myf5、Myf6基因的m RNA表达量,结果显示,与对照组（p EGFP-N3空载体）相比,实验组（过表达载体）BMP2和BMP4基因的表达水平极显着上升（P<0.01）,分化标志基因Myo D、Myf5、Myf6基因的表达水平显着提高（P<0.05）。MTT法检测过表达与未过表达BMP2、BMP4基因细胞的增殖情况,发现过表达BMP2、BMP4基因对细胞的增殖具有一定的促进作用。
李婷婷[3]（2020）在《Bmp4基因对鸡PGCs形成及分化的作用研究》文中研究指明原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）是精子和卵子的前体,负责遗传信息的传递,在物种世代繁衍进程中发挥着重要作用。鸡（鸟类）的PGCs在胚胎发育过程中,随着血液不断迁移,最终在生殖嵴中定居,增殖。研究表明异体移植后的鸡PGCs能够归巢至受体生殖嵴并继续发育,这一特性为禽类物种保存和资源保护提供新的材料;在PGCs上进行基因编辑,并通过移植后产生的配子将这些修饰在世代间传递,为转基因动物生产和优良品种育种材料创制提供新的方法。然而,正常情况下,一个鸡胚中最多可分离获取约3000-5000个PGCs,而异体间移植时每个受体鸡胚至少需要5000-10000个细胞,尤其对稀少或者濒危禽类来说,更不可能毁坏原种来获取PGCs,因此体内分离的PGCs远不能满足实际生产需要。目前,由于体外培养体系不完善,使得体外大量扩增PGCs仍有困难,如何大量获取PGCs仍是其有效利用的难题。近年来,已有报道体外诱导ESCs或iPSCs分化形成PGCs,但是效率低,所以需要深入探索影响PGCs形成的重要因子及其作用。研究表明BMP4是哺乳动物PGCs起源的关键因子,利用外源BMP4蛋白在体外能将哺乳动物ESCs（Embryonic stem cells）诱导分化为PGCs。本课题组前期也建立了鸡PGCs的体外BMP4诱导模型,说明BMP4蛋白在PGCs形成过程中起关键作用,但鸡Bmp4基因的功能仍未见报道。基于此,本研究结合基因编辑技术通过构建鸡Bmp4基因的敲除及通过同源重组技术构建过表达载体,设计体内外试验探究Bmp4基因在鸡PGCs形成过程中的具体功能,为后期探究其分子机制及构建Bmp4基因敲除鸡模型奠定基础,也为进一步完善PGCs形成的调控网络提供理论依据。本试验的研究结果如下:（1）Bmp4基因过表达载体构建及活性验证扩增鸡Bmp4基因CDS区,利用同源重组技术将其连接到过表达载体中,构建pCDH-CMV-Bmp4-EF1-copGFP重组载体。转染DF-1细胞,观察到绿色荧光表达,证明载体已成功转染细胞,通过qRT-PCR检测发现Bmp4表达量极显着高于对照组（5347±1.2,P<0.01）,结果显示pCDH-CMV-Bmp4-EF1-copGFP重组载体具有过表达活性,可用于后续试验。（2）Bmp4基因敲除载体构建及活性验证在Bmp4基因外显子区设计3个敲除靶点序列,分别连接到CRISPR/Cas9系统的PGMLV-GM1载体骨架上,构建Bmp4敲除载体Bmp4-sgRNA1、Bmp4-sgRNA2、Bmp4-sgRNA3,慢病毒包裹后转染 DF-1 细胞,T7E1酶切结果显示3个载体均被切成两条带,基因组上已实现Bmp4基因的敲除。同时TA克隆测序检测结果显示转染敲除载体后基因组上Bmp4序列存在碱基缺失,初步统计敲除效率分别为6.25%、12.5%、18.75%。因此,选用敲除效率最高的Bmp4-sgRNA3载体用于后续试验。（3）体外Bmp4基因功能验证体外分离培养鸡ESCs,随后分6组处理:Control组（自分化）、sg3组（转染Bmp4敲除载体）、BMP4组（添加BMP4蛋白）、OE组（转染Bmp4过表达载体）、sg3+OE组（转染敲除载体后再转染过表达载体）、sg3+BMP4组（转染敲除载体后进行BMP4蛋白诱导）。处理后观察细胞形态变化,结果显示OE组和BMP4组细胞发生分化,4d时有类胚体出现,6d时类胚体增大且数目变多;sg3和Control组无类胚体形成;sg3+OE组4d时有类胚体出现,sg3+BMP4组4d时无类胚体出现,而6d时两组均有少量类胚体。6d时qRT-PCR检测PGCs形成与分化及迁移关键基因的表达变化,结果显示,与Control组相比,OE组Bmp4（9.85±0.2）、Cvh（6.09±0.2）、C-kit（10.20±0.15）及迁移基因 Cxcr4（14.60±0.2）及 BMP4 组Bmp4（7.41 ± 0.1）、Cvh（7.02±0.24）、C-kit（7.88±0.05）、Cxcr4（14.07±0.2）基因表达量均极显着升高（P<0.01）;sg3组相关基因的表达量Bmp4（0.52±0.08）、Cvh（0.55±0.08）、C-kit（0.50±0.07）、Cxcr4（0.61 ±0.09）显着下降（P<0.5）。sg3+OE 组 Bmp4（2.88±0.05）、Cvh（2.69±0.2）、C-kit（3.19±0.1）、Cxcr4（4.91±0.1）和sg3+BMP4组Bmp4（1.98±0.1）、Cvh（2.19±0.3）、C-kit（2.47±0.04）、Cxcr4（4.19±0.26）表达量显着升高（P<0.5）。6d时流式检测Cvh阳性细胞率,OE组和BMP4组分别为15.0%±0.12和14.5%±0.10,极显着高于对照组（P<0.01）;sg3组阳性率仅为4.79%±0.01,与对照组差异不显着;sg3+OE组和sg3+BMP4组分别为7.41%±0.23、8.66%±0.19,均显着高于对照组（P<0.5）。间接免疫荧光结果与流式结果一致。以上结果均说明Bmp4基因在体外能促进鸡PGCs形成。（4）体内Bmp4基因功能验证鸡胚发育2.5d时分6组进行血管注射:Control组（空白对照）、sg3组（注射Bmp4敲除载体）、BMP4组（注射BMP4蛋白）、OE组（注射Bmp4过表达载体）、sg3+OE组（同时注射敲除和过表达载体）、sg3+BMP4组（同时注射敲除载体和BMP4蛋白）。孵化至4.5d时观察鸡胚发育情况,结果显示sg3组鸡胚小于对照组;sg3+OE和sg3+BMP4组鸡胚均比对照组大,但小于OE和BMP4组。qRT-PCR检测PGCs形成及迁移关键基因的表达变化,结果显示OE组Bmp4（4.48±0.09）、Cvh（4.71±0.1）、C-kit（4.20±0.2）及迁移基因 Cxcr4（4.76±0.22）和 BMP4 组Bmp4（3.39±0.08）、Cvh（4.36±0.13）、C-kit（4.53±0.11）、Cxcr4（5.56±0.2）与对照组相比基因表达量均极显着上调（P<0.01）;sg3 组 Bmp4（0.32±0.01）、Cvh（0.38±0.01）、C-kit（0.38±0.08）、Cxcr4（0.33±0.09）相关基因表达量与对照组相比显着下调（P<0.5）;sg3+OE 组 Bmp4（1.67±0.1）、Cvh（1.53±0.2）、C-kit（1.35±0.05）、Cxcr4（1.93±0.12）和sg3+BMP4 组 Bmp4（1.69±0.09）、Cvh1.48±0.2)、C-kit（1.21±0.1）、Cxcr4（1.87±0.13）基因表达量与对照组相比均显着上调（P<0.5）。流式检测结果显示,OE组和BMP4组Cvh基因阳性细胞率与对照组相比极显着升高（35.0%±0.10、32.5%±0.11,P<0.01）;sg3组阳性细胞率与对照组相比显着降低（5.24%±0.10,P<0.5）;sg3+OE组（15.31%±0.21）和sg3+BMP4组（17.43%±0.30）阳性细胞率均显着高于对照组（P<0.5）。WB检测结果显示sg3组BMP4蛋白表达量减少;sg3+OE和sg3+BMP4组BMP4蛋白表达量均比对照组增多,但少于OE组和BMP4组蛋白表达量。体内外功能验证结果均证明Bmp4基因促进PGCs的形成。
聂杨帆[4]（2019）在《藏羊初级毛囊发育诱导期分子调控网络和候选基因转录调控机制研究》文中研究指明藏羊是我国典型的粗毛羊品种,其羊毛以初级毛囊形成的髓状毛为主,是优质的地毯毛来源,目前关于地毯毛性状的遗传机制报道较少。胚胎发育过程中,表皮细胞与真皮细胞的信号分子之间相互作用,诱导皮肤细胞增殖分化形成初级毛囊。分析藏羊初级毛囊诱导形成过程中的分子调控网络,筛选参与调控初级毛囊诱导形成的关键基因,挖掘地毯毛性状相关的种质资源,对提高羊毛品质具有重要意义。本研究通过转录组测序分析藏羊初级毛囊发育诱导期的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和信使RNA（messenger RNA,mRNA）的分子调控网络,解析初级毛囊早期发育过程中相互作用的关键激活因子EDAR和抑制因子BMP4的转录调控机制,阐明其诱导藏羊初级毛囊形成的潜在分子机制。具体结果如下:1.藏羊初级毛囊发育诱导期关键lncRNAs和mRNAs的筛选和鉴定通过组织形态学分析藏羊胚胎的皮肤结构发现初级毛囊诱导形成时期（stage 1）相比于诱导形成前时期（stage 0）,皮肤的表皮和真皮明显增厚,并形成毛囊基板和真皮凝集体。通过分析藏羊初级毛囊诱导形成前后皮肤转录组测序数据鉴定到36个显着上调的lncRNAs、26个显着下调的lncRNAs、228个显着上调的mRNAs、225个显着下调的mRNAs和80个新的差异表达转录本（stage 1 vs stage 0）。差异表达lncRNA的靶基因和差异表达mRNA的GO分析都显着富集到系统发育、单-多细胞器官发育、器官发育等发育过程,KEGG分析都显着富集到TGF-β、Hedgehog、PI3KAkt、Focal adhesion和ECM-receptor interaction信号通路。WNT信号通路（WNT16、WNT2B、LEF1、WIF1、LRP4、SFRP1和SFRP4）,EDAR信号通路（EDAR、EDARADD和FOXI3）,BMP信号通路（BMP3、BMP4和BMP7）,FGF信号通路（FGFR2和FGF20）的基因,以及lncRNAs（XLOC539599、XLOC556463、XLOC015081、XLOC1285606、XLOC297809和XLOC764219）等在藏羊初级毛囊诱导形成前后的皮肤样品中差异表达,揭示这些基因在藏羊初级毛囊发育诱导期发挥着重要作用。采用qRT-PCR方法检测了关键候选lncRNAs和mRNAs的表达水平,并通过原位杂交技术检测发现藏羊初级毛囊诱导形成时期（stage 1）,XLOC297809和XLOC764219都在初级毛囊基板和真皮凝集体中表达,XLOC764219在表皮中也有少量表达。2.藏羊EDAR基因的转录调控机制研究克隆了藏羊EDAR基因的5’侧翼序列2290 bp并构建了一系列EDAR启动子区缺失片段载体,通过检测双荧光素酶活性发现藏羊EDAR核心启动子为-220/+45。成功构建了转录因子ETS1、EGR1和E2F1与EDAR的结合位点突变载体,点突变试验表明ETS1可能是EDAR基因的转录促进因子。成功构建了转录因子ETS1的超表达载体并发现超表达ETS1能够促进EDAR基因启动子的转录活性,显着增加EDAR基因的mRNA水平。通过Targetscan软件预测发现miR-125a-5p和miR-24-3p可能与EDAR基因结合,双荧光素酶报告系统证明miR-125a-5p可以靶向EDAR基因。过表达miR-125a-5p可以抑制EDAR基因的mRNA表达,抑制miR-125a-5p可以促进EDAR基因的mRNA表达。3.藏羊BMP4基因的转录调控机制研究克隆了藏羊BMP4基因的5’侧翼序列2283 bp并构建了一系列BMP4启动子区缺失片段载体,通过检测双荧光素酶活性发现藏羊BMP4核心启动子为-518/-35。成功构建了转录因子E2F1、SP1、SP3、MYC与BMP4的结合位点突变载体,点突变试验表明E2F1、SP3、MYC可能是BMP4的转录促进因子,SP1可能是BMP4的转录抑制因子。成功构建了转录因子MYC和SP1的超表达载体并发现超表达MYC能促进BMP4基因启动子的转录活性,显着增加BMP4基因的mRNA水平。通过Targetscan软件预测发现miR-340-5p可能与BMP4基因结合,双荧光素酶报告系统证明miR-340-5p可以靶向BMP4基因。过表达miR-340-5p可以抑制BMP4基因的mRNA表达,抑制miR-340-5p可以促进BMP4基因的mRNA表达。本研究筛选和鉴定了藏羊初级毛囊诱导形成过程中的关键lncRNAs和mRNAs,阐明了2个关键候选基因（EDAR和BMP4）的转录调控机制,发现了促进EDAR基因表达的转录因子ETS1及抑制其表达的miR-125a-5p和促进BMP4基因表达的转录因子MYC及抑制其表达的miR-340-5p,建立了候选基因、转录因子、miRNA诱导藏羊初级毛囊形成的分子调控网络,为进一步完善藏羊初级毛囊早期发育的分子机制提供理论依据。
程琳芸[5]（2018）在《西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因序列、遗传多样性及mRNA表达分析》文中指出西藏绒山羊羊绒品质远优于其他地区绒山羊品种,但其目前的羊绒产量远不能满足广大消费者的需求,因此,提高西藏绒山羊羊绒产量显得越来越迫切。目前的研究已经证明β-catenin、BMP4、Noggin基因是调控毛发生长的关键基因,但这三个基因的基因序列、遗传多样性及mRNA表达在西藏绒山羊的研究中未见相关报道。本试验以不同地区的210只西藏绒山羊作为研究对象,扩增了西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因的CDS区,对其编码外显子的遗传多样性进行了分析,进而检测了西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因的mRNA表达水平。取得的主要结果如下:1、西藏绒山羊β-catenin基因CDS全长2346 bp,编码781个氨基酸;BMP4基因CDS全长1230 bp,编码409个氨基酸;Noggin基因CDS全长699 bp,编码232个氨基酸。这三个基因与哺乳动物的氨基酸序列相似性均在97.79%以上。进化树分析显示,西藏绒山羊与山羊、绵羊、牛的亲缘关系较为接近,与非洲爪蟾、斑马鱼的亲缘关系最远。2、成功扩增出β-catenin基因的14个编码外显子,BMP4基因的3个编码外显子和Noggin基因的1个编码外显子。扩增测序未在BMP4基因编码外显子2及Noggin基因编码外显子1中发现SNP位点,β-catenin基因中发现5个SNP位点,且在5个SNP位点中c.621C>T、c.1491C>T、c.63C>T位点杂合度较高,c.687G>A,c.1140C>T位点杂合度较低,群体遗传学分析发现5个SNP位点都符合符合哈迪-温伯格平衡定律（P>0.05）,结果表明这5个SNP位点都能稳定遗传,且c.621C>T、c.1491C>T、c.63C>T位点更具研究潜力。5个SNP位点在6个县中的杂合度与产绒量分析显示c.63C>T、c.621C>T和c.687G>A位点可能与产绒量呈正相关,而c.1140C>T和c.1491C>T位点可能与产绒量呈负相关。3、mRNA表达分析显示革吉县的β-catenin基因表达量显着高于其他县（P<0.05）,改则县和革吉县的BMP4基因表达量显着高于其他县（P<0.05）,6个县之间Noggin基因表达量没有显着差异（P>0.05）,结合产绒量分析表明BMP4基因的表达可能抑制绒毛生长,而β-catenin基因和Noggin基因的与绒毛生长的关系还不清楚。β-catenin基因4个SNP位点不同基因型的mRNA表达分析显示β-catenin基因的基因型可能会影响其表达量的高低。上述研究结果为进一步深入了解西藏绒山羊这一地方特色品种β-catenin、BMP4和Noggin基因的分子特性积累了宝贵的基础资料,为以后培育更高绒产量的西藏绒山羊品种奠定了重要的基础。
孙振梅[6]（2017）在《黔北麻羊BMP4和BMPR-IB基因克隆表达及其多态性与繁殖性状的关联分析》文中研究表明本研究以黔北麻羊为研究对象,以BMPR-IB和BMP4为候选基因,对BMPR-IB和BMP4两个基因的多态性进行检测,进一步分析两个基因SNP位点的不同基因型与黔北麻羊繁殖性状的相关性,对单羔组和多羔组黔北麻羊繁殖相关组织中BMPR-IB和BMP4的表达规律进行分析,克隆BMPR-IB和BMP4基因的CDS区,构建PET32a（+）-BMPR-IB/BMP4原核表达载体,采用Western-blot技术检测黔北麻羊BMP4重组蛋白的表达。旨在研究BMPR-IB和BMP4基因对黔北麻羊繁殖性状的影响,进一步认识黔北麻羊繁殖性状的分子遗传基础,研究结果如下。1、BMPR-IB和BMP4基因多态性检测在黔北麻羊和贵州黑山羊BMPR-IB基因外显子9的C40G检测到1个SNP位点,但未检测到BMP4基因存在多态位点。进一步对BMPR-IB基因多态位点不同基因型与繁殖性状进行关联分析,发现不同基因型黔北麻羊个体的产羔数之间存在差异,但在贵州黑山羊的三种基因型间未检测到差异。2、BMPR-IB和BMP4基因在黔北麻羊繁殖相关组织表达量的研究对于BMPR-IB基因,在多羔和单羔组黔北麻羊的垂体、输卵管、子宫、下丘脑、卵巢5个组织中均检测到其mRNA表达,且表达趋势趋于一致,由高到低依次为卵巢、垂体、子宫、下丘脑、输卵管。在卵巢组织,多羔组黔北麻羊BMPR-IB基因mRNA的表达量显着高于单羔组（P﹤0.01）,而对于其他组织两组间的差异不显着。对于BMP4基因,在两组黔北麻羊的5个繁殖组织中均检测到BMP4基因mRNA的表达,其中在卵巢组织中的表达量最高,在下丘脑中最低。且在卵巢组织,黔北麻羊单多羔组的BMP4基因的表达量达差异显着水平,多羔组表达量显着高于单羔组（P﹤0.05）。3、黔北麻羊BMPR-IB和BMP4基因CDS区的克隆及原核表达载体构建在黔北麻羊卵巢组织中成功克隆BMPR-IB和BMP4基因CDS区,将回收纯化的两个基因的CDS区构建PET32a（+）-BMPR-IB/BMP4原核表达载体,测序结果表明克隆的两个基因为黔北麻羊的BMPR-IB和BMP4基因。利用Western-blot技术对菌株BL21（DE3）中表达的PET32a（+）-BMP4重组蛋白进行验证,获得了黔北麻羊的BMP4原核表达蛋白。
马百全[7]（2016）在《猪BMP4基因克隆、多态性与表达分析》文中研究表明骨形态发生蛋白4（BMP4）是转化生长因子β（TGF-β）超家族中重要的成员之一,是原始卵泡和卵母细胞生存的必需因子,与哺乳动物的繁殖性能密切相关。目前关于猪BMP4基因的研究较少,其多态性的研究还未见报道。本研究通过PCR扩增和克隆测序技术获得苏淮猪和梅山猪BMP4基因组序列,通过生物信息学方法对其基因组特征和序列特征进行分析:采用池DNA测序技术筛选苏淮猪和梅山猪BMP4基因SNP位点,采用AS-PCR对苏淮猪和梅山猪群体BMP4基因SNP位点多态性;采用RT-PCR技术分析了猪BMP4基因的组织表达特征,并将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,构建猪BMP4基因过表达载体。研究结果为揭示猪BMP4基因特征和生物学功能提供参考。全文结果如下:1、猪BMP4基因克隆与序列分析通过PCR扩增和克隆测序获得了苏淮猪和梅山猪7147bp的BMP4基因组序列序列,两者核苷酸序列的一致性为98.63%。电子染色体定位发现猪BMP4基因定位在猪1号染色体上,位于203773 kb～203781 kb之间。基因组结构分析猪BMP4基因由4个外显子和3内含子组成。在苏淮猪和梅山猪BMP4基因5’端-1051～-801nt处发现一个潜在的启动子区,含有HEN1、STAT1、AP4等转录因子结合位点,但未发现真核生物启动子典型的TATA框和CAAT框。苏淮猪和梅山猪BMP4基因3’-UTR区序列全长为267bp,同源性为100%,含有AC重复序列、加尾信号、polyA结构和保守的ARE等。苏淮猪和梅山猪BMP4基因编码区仅由2个外显子（外显子3和4）构成,序列全长1230 bp,编码409个氨基酸残基,两者核苷酸和氨基酸序列一致性均为100%,与哺乳动物其它物种的一致性分别在91%和97%以上;与其它哺乳动物一样,苏淮猪和梅山猪BMP4蛋白也含有典型的TGF-β前肽和TGF-β样结构域。结果表明苏淮猪和梅山猪BMP4基因与其它哺乳动物在基因组结构、序列、蛋白结构等具有较高的保守性。2、猪BMP4基因3’UTR多态性分析采用池DNA测序技术在苏淮猪和梅山猪BMP4基因3’UTR 20nt处发现一个SNP,碱基由G突变为C,并将其命名为*20G>C。利用建立的AS-PCR方法对苏淮猪和梅山猪群体BMP4基因*20G>C位点多态性进行了检测,结果在苏淮猪和梅山猪群体中共检测到GG、GC和CC等3种基因型。在苏淮猪群体中,GG型和G等位基因为优势基因型和优势等位基因,频率分别为为0.815和0.887,而在高繁殖力猪种梅山猪中则相反,CC型和C等位基因为优势基因型和优势等位基因,频率分别为为0.667和0.770。生物信息学方法预测发现猪BMP4基因*20G>C突变导致miR-7135结合位点的改变,因此本文构建了含有该多态位点的2种荧光素酶表达载体（pmirGLO-G和pmirGLO-C）,与miR-7135mimics共转293细胞,荧光素酶活性分析发现不同荧光素酶表达载体活性无显着差异,说明BMP4基因*20G>C突变可能不是通过影响miR-7135与之结合而发挥作用。研究结果表明BMP4基因*20G>C位点多态性可能与猪繁殖性能有关。3、苏淮猪BMP4基因组织表达特征与真核表达载体构建利用RT-PCR方法对苏淮猪BMP4基因组织表达特征进行分析,结果显示BMP4基因在苏淮猪心脏、肌肉、卵巢、肝脏、肾脏、脾脏6种组织中均有表达,其中在心脏、肌肉、卵巢和肾脏组织中高表达,而在肝脏和脾脏组织中低表达。将猪BMP4基因编码区克隆入pcDNA3.1载体中,构建BMP4基因真核表达载体,酶切鉴定和质粒测序比对发现连接到载体中的目的片段序列完全正确,说明猪BMP4基因真核表达载体构建成功,并命名为pcDNA3.1-BMP4。将重组质粒pcDNA3.1-BMP4转染体外培养的猪卵泡颗粒细胞,Westerm blot分析发现转染重组质粒pcDNA3.1-BMP4组的颗粒细胞23KD处出现明显BMP4蛋白条带,BMP4蛋白表达水平极显着高于对照组,说明pcDNA3.1-BMP4重组质粒可在猪卵巢颗粒细胞中能够高效表达,为进一步研究其功能奠定了基础。
龙石太,胡亮,吴宪红,字向东[8]（2014）在《川中黑山羊BMP2、BMP4基因cDNA克隆及生物信息学分析》文中提出参照GenBank已公布的绵羊BMP2基因序列与牛BMP4基因序列分别设计一对引物,以川中黑山羊卵巢总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增川中黑山羊BMP2基因和BMP4基因的cDNA序列并进行克隆、测序及相关生物信息学分析。结果表明,川中黑山羊BMP2基因编码区全长为1 188 bp（GenBank登录号为KF492982）,BMP4基因编码区全长为1 230 bp（GenBank登录号为KF492983）,分别编码395、409个氨基酸。川中黑山羊与绵羊、牛、猪、人、马、鼠、鸡BMP2基因编码区序列的同源性分别为99.7%、98.7%、92.0%、89.6%、91.4%、86.1%、78.9%;川中黑山羊与绵羊、牛、猪、人、马、鼠、鸡BMP4基因编码区序列的同源性分别为99.3%、99.1%、95.9%、95.2%、94.4%、92.0%、80.1%。用MEGA 4.0构建物种间分子系统进化树,结果显示,BMP2基因和BMP4基因的聚类反应基本一致,川中黑山羊首先与绵羊聚类,再分别与牛、猪、马、人和鼠聚类,最后与鸡聚类,这与动物分类学基本吻合。
路鹏[9]（2013）在《新西兰白兔骨形态发生蛋白（BMPs）的克隆及时空差异性表达》文中指出骨形态发生蛋白（BMPs）是TGF-β超家族中最大和增速最快的成员，近年来，随着研究成果的不断深入，发现其不光在诱导软骨及骨组织定向分化中作用强大，在中胚层诱导、肢体发育、牙齿发育、造血细胞形成及动物繁殖性状表达等方面也起着重要作用。本研究在实验室前期工作的基础上，对BMPs进行克隆测序及电子克隆分析，研究了新西兰白兔在不同发育时期及不同组织中的时空差异性表达，以期确定BMPs在不同发育阶段中所起的作用，从基因角度阐明新西兰白兔的组织表达谱规律。根据NCBI中GenBank已经公布的人、猪、牛、绵羊、小鼠和大鼠骨形态发生蛋白2（BMP-2）和骨形态发生蛋白4（BMP-4）的序列，利用计算机软件DNAMAN进行基因序列的同源性比对，找出BMP-2基因和BMP-4基因cDNA的保守区域，设计特异性引物，采用RT-PCR技术克隆这两种基因，利用克隆的序列作为探针继续进行电子克隆，用生物信息学软件对两种基因的分子结构和特征进行分析和预测，然后采用实时荧光定量PCR方法在mRNA水平上检测两种基因在新西兰白兔不同发育时期中卵巢、子宫、输卵管、肾脏、肝脏、脾脏和十二指肠组织的表达情况。通过上述方法得出如下试验结果：1、根据保守区域，设计特异性引物，采用RT-PCR方法从新西兰白兔卵巢、输卵管、子宫中扩增BMP-2和BMP-4基因部分cDNA序列，片段长度分别为299bp和175bp。2、分别以克隆测序出的BMP-2和BMP-4部分cDNA序列为探针，在nr数据库及EST数据库中电子克隆两个基因，克隆后的BMP-2基因为1150bp，BMP-4基因为920bp。3、应用生物信息学软件分析电子克隆BMP-2和BMP-4基因，其中BMP-2基因CDS区全长1149bp，编码383个氨基酸；BMP-4基因CDS区全长918bp，编码306个氨基酸。4、利用生物信息学方法和相关软件分析新西兰白兔BMP-2和BMP-4基因的同源性，试验结果表明：新西兰白兔BMP-2基因核苷酸序列与羊（XM004014353）一致性为86%，与牛（BC134682）一致性为86%，与猪（EU854587）一致性为86%，与小鼠（BC100344）一致性为93%，与大鼠（L20678）一致性为93%，与人（AB463447）一致性为87%；新西兰白兔BMP-4基因核苷酸序列与羊（AF508312）一致性为93%，与牛（NM001045877）一致性为94%，与猪（EU334835）一致性为94%，与小鼠（BC013459）一致性为91%，与大鼠（NM012827）一致性为92%。5、通过实时荧光定量PCR技术检测到新西兰白兔BMP-2基因在30日龄、60日龄和180日龄中卵巢组织中相对表达含量最高，在120日龄中肝脏组织中相对表达量最高；而BMP-4基因则在60日龄和180日龄中卵巢组织表达含量最高，30日龄中十二指肠表达含量最高，妊娠6天的母兔中肝脏表达含量最高。6、两基因同一组织在不同生长发育时期的表达规律表现为：卵巢中BMP-2的mRNA变化幅度最大，60日龄达到最高峰，输卵管、子宫、脾脏均在120日龄时表达含量最高，30日龄时肝脏表达含量最高；卵巢中BMP-4的mRNA在60日龄时表达含量最高，输卵管、子宫、肾脏、肝脏、脾脏则在妊娠6天母兔中表达含量最高，十二指肠在30日龄表达含量最高。7、BMP-2基因和BMP-4基因在卵巢组织中都有较一致的表达趋势，即60日龄最高，后下降，到180日龄又呈现上升趋势。在十二指肠中的表达也存在明显的相似性，即随着日龄的增大，两基因的表达呈现出下降趋势。
刘秋英,陈伟,毛国梁,熊盛,钱垂文,利奕成,王一飞[10]（2012）在《人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建》文中研究表明以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒。酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子。重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100%相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带。
二、CLONING AND SEQUENCING OF MATURE FRAGMENT OF HUMAN BMP4 GENE（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CLONING AND SEQUENCING OF MATURE FRAGMENT OF HUMAN BMP4 GENE（论文提纲范文）
（1）DNA甲基化和H3K4me2拮抗调节BMP4促进鸡PGCs形成的机制研究和潜在应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 PGCs起源和迁移 |
| 1.1.1 PGCs的起源和分子特征 |
| 1.1.2 PGCs的迁移 |
| 1.2 PGCs发生的分子调控进展 |
| 1.2.1 调控PGCs的相关细胞因子 |
| 1.2.2 调控PGCs的相关基因 |
| 1.2.3 调控PGCs的相关信号通路 |
| 1.3 PGCs形成过程中的表观遗传因素 |
| 1.3.1 DNA甲基化研究进展 |
| 1.3.2 组蛋白甲基化研究进展 |
| 1.4 CRISPR-dCas9技术应用进展 |
| 1.4.1 CRISPR-dCas9技术概述 |
| 1.4.2 CRISPR-dCas9在转录调控和表观遗传中应用 |
| 1.5 本课题组前期研究发现 |
| 1.6 本课题的研究目的意义 |
| 1.7 本研究应用与展望 |
| 1.8 参考文献 |
| 第2章 DNA甲基化调控PGCs的形成 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 细胞分离培养 |
| 2.1.5 Dnmt3A和Tet1干扰载体构建和活性检测 |
| 2.1.6 体外验证DNA甲基化在PGCs形成中的功能 |
| 2.1.7 体内验证DNA甲基化在PGCs形成中的功能 |
| 2.1.8 数据分析统计 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 DNA甲基化酶的表达分析和筛选 |
| 2.2.2 2.2 DNA甲基化和去甲基化酶干扰载体构建及活性检测 |
| 2.2.3 体外验证DNA甲基化调控PGCs的形成 |
| 2.2.4 体内验证DNA甲基化调控PGCs的形成 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第3章 PGCs的形成中DNA甲基化和H3 K4me2参与调控BMP4基因 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 ChIP-seq和MBD-seq联合分析筛选PGCs形成中关键基因 |
| 3.1.5 BMP4启动子核心区域分析和筛选 |
| 3.1.6 BMP4启动子区CpG岛预测和引物设计 |
| 3.1.7 BMP4启动子区甲基化检测 |
| 3.1.8 ChIP-qPCR检测BMP4启动子区H3 K4me2的富集情况 |
| 3.1.9 qRT-PCR检测BMP4信号在不同细胞中表达 |
| 3.1.10 Wersterm blot检测BMP4信号在不同细胞中表达 |
| 3.1.11 数据分析统计 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 BMP4基因受表观遗传调控 |
| 3.2.2 BMP4启动子核心区域筛选分析 |
| 3.2.3 PGCs的形成中DNA甲基化靶基因BMP4的验证 |
| 3.2.4 PGCs形成中BMP4上H3K4me2富集情况 |
| 3.2.5 BMP4和下游信号在不同细胞中表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第4章 CRISPR-dCas9介导的TET1靶向BMP4启动子DNA去甲基化促进PGCs形成 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 dCas9-TET1系统构建和活性验证 |
| 4.1.5 体内外验证靶向BMP4去甲基化对PGCs形成的影响 |
| 4.1.6 数据分析统计 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 dCas9-TET1去甲基化系统构建和活性验证 |
| 4.2.2 体内外验证靶向BMP4去甲基化促进PGCs形成 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第5章 DNA甲基化和组蛋白甲基化拮抗调节BMP4信号参与PGCs的形成 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.1.4 BMP4启动子区转录因子预测和筛选 |
| 5.1.5 DNA甲基化和H3K4me2调控BMP4转录机制的探索 |
| 5.1.6 数据分析统计 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 转录因子的预测筛选和验证 |
| 5.2.2 DNA甲基化和H3K4me2对BMP4启动活性影响 |
| 5.2.3 探索DNA甲基化和H3K4me2拮抗调控BMP4转录机制 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 本文结论与创新 |
| 本文结论 |
| 本文创新点 |
| 论文有待进一步探究问题和计划 |
| 附录 |
| 实验室细胞分离方法 |
| 原始数据附表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 论文发表 |
| 专利申请和主持科研项目 |
| 致谢 |
（2）黔北麻羊BMP2、BMP4基因甲基化与生长性状的遗传效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 黔北麻羊概况 |
| 1.2 BMPs家族基因研究进展 |
| 1.2.1 BMPs的发现与分类 |
| 1.2.2 BMPs的结构及功能 |
| 1.2.3 BMPs信号通路 |
| 1.3 BMP2基因研究进展 |
| 1.3.1 BMP2基因结构特征 |
| 1.3.2 BMP2基因生物学功能 |
| 1.4 BMP4基因研究进展 |
| 1.4.1 BMP4基因结构特征 |
| 1.4.2 BMP4基因生物学功能 |
| 1.5 表观遗传学与DNA甲基化 |
| 1.5.1 表观遗传学概述 |
| 1.5.2 DNA甲基化概述 |
| 1.5.3 DNA甲基化在动物遗传育种上的应用 |
| 1.5.3.1 DNA甲基化在猪遗传育种上的应用 |
| 1.5.3.2 DNA甲基化在牛遗传育种上的应用 |
| 1.5.3.3 DNA甲基化在羊遗传育种上的应用 |
| 1.5.3.4 DNA甲基化在鸡遗传育种上的应用 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 BMP2、BMP4 基因多态性及其对黔北麻羊生长性状的影响 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 黔北麻羊血样的采集及数据测量记录 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试验主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黔北麻羊血样DNA的提取 |
| 2.2.2 DNA样品的纯度检测 |
| 2.2.3 构建DNA池 |
| 2.2.4 引物设计 |
| 2.2.5 PCR扩增 |
| 2.2.6 PCR扩增产物的SNP检测 |
| 2.3 统计分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 黔北麻羊DNA样品的检测 |
| 2.4.2 黔北麻羊BMP2、BMP4 基因PCR扩增结果 |
| 2.4.3 黔北麻羊BMP2、BMP4 基因SNP鉴定 |
| 2.4.4 连锁不平衡以及单倍型分析 |
| 2.4.4.1 BMP2 基因SNPs位点连锁不平衡以及单倍型分析 |
| 2.4.4.2 BMP4 基因SNPs位点连锁不平衡以及单倍型分析 |
| 2.4.5 SNP位点的遗传多样性分析 |
| 2.4.5.1 BMP2 基因SNPs位点的遗传多样性分析 |
| 2.4.5.2 BMP4 基因SNPs位点的遗传多样性分析 |
| 2.4.6 SNPs位点基因型与生长性状之间的关联分析 |
| 2.4.6.1 BMP2 基因SNPs位点基因型与生长性状之间的关联分析 |
| 2.4.6.2 BMP4 基因SNPs位点基因型与生长性状之间的关联分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 BMP2基因的遗传效应分析 |
| 2.5.2 BMP4基因的遗传效应分析 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 黔北麻羊BMP2、BMP4 基因组织表达谱分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 试验主要试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 组织RNA的提取 |
| 3.2.2 cDNA合成 |
| 3.2.3 引物设计 |
| 3.2.4 PCR检测 |
| 3.2.5 实时荧光定量PCR |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RNA质量检测 |
| 3.3.2 PCR引物检测结果 |
| 3.3.3 q RT-PCR扩增曲线和溶解曲线 |
| 3.3.4 BMP2、BMP4 基因组织表达分析 |
| 3.3.4.1 BMP2基因在不同组织中的表达差异 |
| 3.3.4.2 BMP2基因在不同生长阶段各组织中的表达差异 |
| 3.3.4.3 BMP4基因在不同组织中的表达差异 |
| 3.3.4.4 BMP4基因在不同生长阶段各组织中的表达差异 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 黔北麻羊BMP2、BMP4 基因组织表达分析 |
| 3.4.2 BMP2、BMP4 基因在黔北麻羊不同生长阶段的表达差异分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 黔北麻羊BMP2、BMP4 基因启动子区甲基化调控分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 试验主要试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 黔北麻羊组织DNA提取与检测 |
| 4.2.2 引物设计 |
| 4.2.3 亚硫酸氢盐修饰基因组DNA |
| 4.2.4 PCR扩增 |
| 4.2.5 PCR产物纯化回收、连接以及转化 |
| 4.2.6 阳性克隆测序及序列比对 |
| 4.2.7 甲基化程度分析 |
| 4.2.8 甲基化状态与mRNA表达量的关联分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 CpG岛预测及引物设计 |
| 4.3.2 PCR扩增结果 |
| 4.3.3 菌液PCR鉴定 |
| 4.3.4 测序结果比对分析 |
| 4.3.5 黔北麻羊BMP2、BMP4 基因Cp G岛的甲基化分析 |
| 4.3.5.1 黔北麻羊BMP2 基因Cp G岛的甲基化分析 |
| 4.3.5.2 黔北麻羊BMP4 基因Cp G岛的甲基化分析 |
| 4.3.6 黔北麻羊BMP2、BMP4 基因Cp G岛的甲基状态与m RNA表达量的关系 |
| 4.3.6.1 黔北麻羊BMP2 基因Cp G岛的甲基状态与m RNA表达量的关系 |
| 4.3.6.2 黔北麻羊BMP4 基因Cp G岛的甲基状态与m RNA表达量的关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 BMP2、BMP4 基因过表达对黔北麻羊原代成肌细胞增殖的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 主要仪器设备 |
| 5.1.3 试验主要试剂 |
| 5.1.4 主要溶液配制 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 真核表达载体引物设计 |
| 5.2.2 真核表达载体构建 |
| 5.2.3 原代成肌细胞的分离培养 |
| 5.2.4 成肌细胞间接免疫荧光鉴定 |
| 5.2.5 成肌细胞转染 |
| 5.2.6 肌细胞分化相关基因的表达 |
| 5.2.7 细胞增殖检测 |
| 5.2.8 数据统计与分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 BMP2和BMP4 基因克隆 |
| 5.3.2 重组真核表达载体的构建和鉴定 |
| 5.3.3 成肌细胞形态观察 |
| 5.3.4 成肌细胞间接免疫荧光鉴定 |
| 5.3.5 q RT-PCR检测转染后BMP2和BMP4 基因在成肌细胞中的表达 |
| 5.3.6 q RT-PCR检测肌细胞分化相关基因的表达 |
| 5.3.7 MTT检测成肌细胞增殖及生长曲线绘制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（3）Bmp4基因对鸡PGCs形成及分化的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 PGCs的起源和迁移、鉴定及应用 |
| 1.1.1 PGCs的起源及迁移 |
| 1.1.2 PGCs的鉴定 |
| 1.1.3 PGCs的起源及迁移的调控 |
| 1.1.4 PGCs的应用 |
| 1.2 基因功能验证方法的研究进展 |
| 1.3 基因编辑技术的发展及应用 |
| 1.3.1 基因编辑技术简介 |
| 1.3.2 基因编辑技术在生产中的应用 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第2章 Bmp4基因CDS区扩增及过表达载体构建 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 试剂及配制 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Bmp4基因CDS区扩增 |
| 2.2.2 pCDH-CMV-Bmp4-EF1-copGFP载体构建 |
| 2.2.3 DF-1细胞的培养与转染 |
| 2.2.4 qRT-PCR检测pCDH-CMV-Bmp4-EF1-copGFP载体活性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 Bmp4基因敲除靶点设计及载体构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 仪器与设备 |
| 3.1.3 试剂及配制 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Bmp4-sgRNA敲除载体构建 |
| 3.2.2 DF-1细胞转染及药物筛选 |
| 3.2.3 T7E1酶切检测 |
| 3.2.4 TA克隆测序 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 Bmp4基因对鸡原始生殖细胞形成及分化的影响研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 仪器与设备 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 ESCs的分离与培养 |
| 4.1.5 鸡胚注射 |
| 4.1.6 qRT-PCR检测 |
| 4.1.7 间接免疫荧光 |
| 4.1.8 流式细胞分析 |
| 4.1.9 WB |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 体外检测Bmp4基因促进PGCs的形成 |
| 4.2.2 体内检测Bmp4基因促进PGCs形成与迁移 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 全文结论与创新 |
| 全文结论 |
| 全文创新点 |
| 后续试验 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 定量及流式原始数据 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（4）藏羊初级毛囊发育诱导期分子调控网络和候选基因转录调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 综述 |
| 1 前言 |
| 2 毛囊的发育及其分期 |
| 3 调控毛囊发育的关键信号通路 |
| 3.1 WNT信号通路在毛囊发育中的研究进展 |
| 3.2 EDAR信号通路在毛囊发育中的研究进展 |
| 3.3 BMP信号通路在毛囊发育中的研究进展 |
| 3.4 FGF信号通路在毛囊发育中的研究进展 |
| 3.5 初级毛囊发育诱导期EDAR和 BMPs的互作 |
| 4 非编码RNA在毛囊发育中的研究进展 |
| 4.1 miRNA在毛囊发育中的研究进展 |
| 4.2 LncRNA在毛囊发育中的研究进展 |
| 5 基因的转录调控机制 |
| 5.1 启动子区的转录调控 |
| 5.2 miRNA对基因的转录后调控作用 |
| 6 研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验样品 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要试剂和试剂盒 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 细胞系和载体 |
| 1.6 主要的生物信息学网站和分析软件 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 皮肤形态学分析 |
| 2.1.1 石蜡切片 |
| 2.1.2 苏木精&伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色 |
| 2.2 总RNA提取和c DNA合成 |
| 2.2.1 总RNA提取 |
| 2.2.2 cDNA反转录 |
| 2.3 基因组DNA的提取 |
| 2.4 转录组测序和生物信息学分析 |
| 2.4.1 RNA质量检测、cDNA文库构建和测序 |
| 2.4.2 测序数据质量检测和序列比对组装 |
| 2.4.3 LncRNA的筛选和鉴定 |
| 2.4.4 LncRNA与mRNA的结构比较 |
| 2.4.5 LncRNA和mRNA的表达水平分析 |
| 2.4.6 LncRNA靶基因预测 |
| 2.4.7 LncRNA和 mRNA的功能富集分析 |
| 2.4.8 互作网络分析 |
| 2.5 qRT-PCR |
| 2.6 切片原位杂交 |
| 2.6.1 候选lncRNA的克隆 |
| 2.6.2 原位杂交探针制备 |
| 2.6.3 切片原位杂交 |
| 2.7 候选基因启动子缺失载体的构建 |
| 2.8 候选基因启动子活性分析 |
| 2.8.1 细胞的复苏、培养、冻存和转染 |
| 2.8.2 双荧光素酶活性的检测 |
| 2.9 候选基因核心启动子的转录因子结合位点预测 |
| 2.10 转录因子结合位点突变载体的构建 |
| 2.11 转录因子结合位点突变载体的双荧光素酶活性检测 |
| 2.12 转录因子超表达载体的构建 |
| 2.13 核心启动子区质粒与转录因子超表达质粒共转染细胞 |
| 2.14 转录因子的超表达 |
| 2.15 与候选基因3’UTR结合的miRNA预测 |
| 2.16 候选基因3’UTR双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.17 候选基因3’UTR突变型双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.18 miRNA与候选基因结合位点的验证 |
| 2.19 miRNA对候选基因表达水平的影响 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 藏羊初级毛囊发育诱导期关键lncRNAs、mRNAs的筛选和鉴定 |
| 1.1 藏羊初级毛囊发育诱导期皮肤形态学分析 |
| 1.2 藏羊初级毛囊发育诱导期皮肤转录组测序和生物信息学分析 |
| 1.2.1 测序数据质量 |
| 1.2.2 参考序列比对 |
| 1.2.3 样品间相关性分析 |
| 1.2.4 候选lncRNAs和mRNAs的筛选 |
| 1.2.5 LncRNAs与mRNAs的结构比较 |
| 1.2.6 差异表达lncRNAs与mRNAs的鉴定 |
| 1.2.7 差异表达lncRNAs靶基因与差异表达mRNAs GO分析 |
| 1.2.8 差异表达lncRNAs靶基因与差异表达mRNAs KEGG分析 |
| 1.2.9 差异表达mRNA-mRNA、lncRNA-mRNA的互作网络分析 |
| 1.3 qRT-PCR检测藏羊初级毛囊发育诱导期关键lncRNAs的表达水平 |
| 1.4 切片原位杂交检测藏羊XLOC_297809和XLOC_764219的表达 |
| 1.5 qRT-PCR检测藏羊初级毛囊发育诱导期关键基因的表达水平 |
| 1.5.1 qRT-PCR检测WNT信号通路中差异基因的表达水平 |
| 1.5.2 qRT-PCR检测EDAR信号通路中差异基因的表达水平 |
| 1.5.3 qRT-PCR检测BMP信号通路中差异基因的表达水平 |
| 1.5.4 qRT-PCR检测其它关键差异基因的表达水平 |
| 2 藏羊EDAR基因的转录调控机制研究 |
| 2.1 藏羊EDAR启动子区的转录调控机制 |
| 2.1.1 EDAR启动子缺失载体构建 |
| 2.1.2 EDAR启动子活性分析 |
| 2.1.3 EDAR启动子进一步缺失载体构建 |
| 2.1.4 EDAR启动子活性进一步分析 |
| 2.1.5 EDAR核心启动子的转录因子结合位点预测 |
| 2.1.6 EDAR核心启动子的转录因子结合位点定点突变 |
| 2.1.7 超表达ETS1对EDAR启动子活性的影响 |
| 2.1.8 超表达ETS1对EDAR基因表达水平的影响 |
| 2.2 miRNA对藏羊EDAR基因表达的调控 |
| 2.2.1 与EDAR基因3’UTR结合的miRNA预测 |
| 2.2.2 miR-125a-5p和 miR-24-3p的成熟序列保守性分析 |
| 2.2.3 EDAR基因3’UTR与miRNA的结合位点分析 |
| 2.2.4 双荧光素酶报告系统验证 |
| 2.2.5 miR-125a-5p对 EDAR基因表达水平的影响 |
| 3 藏羊BMP4基因的转录调控机制研究 |
| 3.1 藏羊BMP4启动子区的转录调控机制 |
| 3.1.1 BMP4启动子缺失载体构建 |
| 3.1.2 BMP4启动子活性分析 |
| 3.1.3 BMP4核心启动子的转录因子结合位点预测 |
| 3.1.4 BMP4核心启动子的转录因子结合位点定点突变 |
| 3.1.5 超表达MYC和SP1对BMP4启动子活性的影响 |
| 3.1.6 超表达MYC和SP1对BMP4基因表达水平的影响 |
| 3.2 miRNA对藏羊BMP4基因表达的调控 |
| 3.2.1 与BMP4基因3’UTR结合的miRNA预测 |
| 3.2.2 miR-340-5p的成熟序列保守性分析 |
| 3.2.3 BMP4 基因3’UTR与miRNA的结合位点分析 |
| 3.2.4 双荧光素酶报告系统验证 |
| 3.2.5 miR-340-5p对BMP4基因表达水平的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 1 藏羊初级毛囊发育诱导期形态学分析 |
| 2 调控藏羊初级毛囊诱导形成的关键mRNAs |
| 3 调控藏羊初级毛囊诱导形成的关键lncRNAs |
| 4 调控藏羊初级毛囊诱导形成的候选基因的选择 |
| 5 候选基因的转录调控机制研究 |
| 6 调控藏羊初级毛囊诱导形成的候选lncRNAs、基因、转录因子和miRNAs |
| 第五章 结论 |
| 1 主要结论 |
| 2 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（5）西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因序列、遗传多样性及mRNA表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩略语中英文对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 西藏绒山羊简介 |
| 2 β-catenin、BMP4、Noggin概述 |
| 2.1 β-catenin基因概述 |
| 2.1.1 β-catenin基因结构与定位 |
| 2.1.2 β-catenin基因功能 |
| 2.1.3 β-catenin基因多态性研究进展 |
| 2.2 BMP4基因概述 |
| 2.2.1 BMP4基因结构与定位 |
| 2.2.2 BMP4基因功能 |
| 2.2.3 BMP4基因多态性研究进展 |
| 2.3 Noggin基因概述 |
| 2.3.1 Noggin基因结构与定位 |
| 2.3.2 Noggin基因功能 |
| 2.3.3 Noggin基因多态性研究进展 |
| 3 单核苷酸多态性概述 |
| 3.1 SNP的检测方法 |
| 3.1.1 利用凝胶电泳的SNP检测方法 |
| 3.1.2 高通量SNP检测方法 |
| 3.2 SNP的研究进展 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因序列、遗传多样性及mRNA表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 DNA、RNA提取和cDNA合成 |
| 1.2.2 西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因CDS扩增 |
| 1.2.3 编码外显子扩增测序及遗传多样性分析 |
| 1.2.4 荧光定量PCR检测mRNA表达水平 |
| 2 结果 |
| 2.1 西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因CDS扩增及序列分析 |
| 2.1.1 西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因CDS扩增 |
| 2.1.2 西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因CDS序列分析 |
| 2.1.3 西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因氨基酸序列分析 |
| 2.1.4 西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因进化树构建 |
| 2.2 编码外显子扩增测序及遗传多样性分析 |
| 2.2.1 编码外显子扩增 |
| 2.2.2 遗传多样性分析 |
| 2.3 西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因mRNA表达量分析 |
| 2.3.1 西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因在不同地区的表达情况 |
| 2.3.2 西藏绒山羊β-catenin基因4个SNP位点不同基因型的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 β-catenin、BMP4、Noggin基因CDS序列分析 |
| 3.2 β-catenin、BMP4、Noggin基因遗传多样性分析 |
| 3.3 β-catenin、BMP4、Noggin基因mRNA表达量分析 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）黔北麻羊BMP4和BMPR-IB基因克隆表达及其多态性与繁殖性状的关联分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 世界山羊产业发展概况 |
| 2 贵州地方山羊产业发展概况 |
| 2.1 贵州地方山羊产业存在问题 |
| 2.2 贵州地方山羊产业发展趋势 |
| 3 贵州山羊主要品种 |
| 3.1 黔北麻羊 |
| 3.2 贵州黑山羊 |
| 4 山羊高繁殖力性能的分子遗传基础 |
| 4.1 骨形态发生蛋白4基因（BMP4）研究进展 |
| 4.2 骨形态发生蛋白受体IB基因（BMPR-IB）研究进展 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 山羊BMPR-IB和BMP4基因多态性及其与繁殖性状的关联研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 山羊血液基因组DNA的提取 |
| 2.2 基因组DNA浓度和纯度的检测 |
| 2.3 DNA池的构建 |
| 2.4 引物设计及合成 |
| 2.5 PCR反应 |
| 2.6 PCR-SSCP反应 |
| 2.7 PCR片段测序 |
| 2.8 遗传学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因组DNA检测结果 |
| 3.2 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果 |
| 3.3 BMPR-IB和BMP4基因的品种DNA池PCR产物测序结果 |
| 3.4 BMPR-IB基因第9外显子C40G位点的SSCP分析 |
| 3.5 BMPR-IB基因第9外显子 40 bp位点的遗传学分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCR-SSCP方法影响因素分析 |
| 4.2 BMPR-IB基因的多态性及其与繁殖性状的关联分析 |
| 第三章 黔北麻羊BMPR-IB和BMP4基因表达规律的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 动物材料及样品采集 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 组织RNA的提取 |
| 2.2 总RNA质量的检测 |
| 2.3 第一链cDNA的合成 |
| 2.4 BMPR-IB和BMP4基因荧光定量PCR引物的设计 |
| 2.5 荧光定量PCR反应条件的探索与优化 |
| 2.6 标准曲线的建立 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 组织总RNA的提取和纯度检测 |
| 3.2 扩增产物特异性检测 |
| 3.3 实时荧光定量PCR反应的特异性分析 |
| 3.4 BMPR-IB基因表达差异分析 |
| 3.5 BMP4基因表达差异分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 实时荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 4.2 BMPR-IB基因mRNA表达研究 |
| 4.3 BMP4基因m RNA表达研究 |
| 第四章 山羊BMPR-IB和BMP4基因原核表达载体的构建及生物信息学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验样品 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 黔北麻羊卵巢组织总RNA的提取 |
| 2.2 RNA的逆转录反应 |
| 2.3 黔北麻羊BMPR-IB和BMP4基因CDS区的克隆 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 3.2 CDS区扩增产物的PCR检测结果 |
| 3.3 目的基因CDS区凝胶回收产物检测 |
| 3.4 pUCm-T-BMPR-IB/BMP4重组载体的菌液PCR鉴定 |
| 3.5 pUCm-T-BMPR-IB/BMP4重组质粒的提取和鉴定 |
| 3.6 pUCm-T-BMPR-IB/BMP4重组质粒的双酶切和测序鉴定 |
| 3.7 PET32a(+)-BMPR-IB/BMP4重组载体的构建 |
| 3.8 黔北麻羊BMPR-IB和BMP4基因CDS区的生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 原核表达载体的选择 |
| 4.2 稀有密码子对蛋白表达的影响 |
| 第五章 黔北麻羊BMP4基因原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组蛋白的表达形式 |
| 2.2 诱导温度和IPTG浓度、时间对表达结果的影响 |
| 3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 小结 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）猪BMP4基因克隆、多态性与表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 BMP蛋白家族 |
| 1.1 BMP家族成员 |
| 1.2 BMP结构特点 |
| 1.3 BMP受体 |
| 1.4 BMP信号通路 |
| 2 BMP4基因 |
| 2.1 BMP4基因结构 |
| 2.2 BMP4的生物学作用 |
| 2.3 BMP4基因多态性研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 试验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 质粒、菌株及细胞系 |
| 1.4 主要生物学常用分析软件 |
| 1.5 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪BMP4基因组序列扩增和测序 |
| 2.2 猪BMP4基因组序列分析 |
| 2.3 猪BMP4基因5'调控区序列分析 |
| 2.4 猪BMP4基因3'-UTR区序列分析 |
| 2.5 猪BMP4基因编码区克隆与序列分析 |
| 2.6 猪BMP4基因3'UTR多态性分析 |
| 2.7 苏淮猪BMP4基因组织表达特征与真核表达载体构建 |
| 3 讨论 |
| 3.1 猪BMP4基因组序列特征 |
| 3.2 猪BMP4基因5'调控区序列特征 |
| 3.3 猪BMP4基因编码区序列 |
| 3.4 猪BMP4基因3'-UTR特征 |
| 3.5 猪BMP4基因3'-UTR多态性 |
| 3.6 苏淮猪BMP4基因表达 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 全文创新点 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）川中黑山羊BMP2、BMP4基因cDNA克隆及生物信息学分析（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1． 1 试验动物 |
| 1. 2 试剂和载体 |
| 1. 3 卵巢总RNA的提取 |
| 1. 4 c DNA第一链的合成 |
| 1. 5 引物设计及PCR扩增目的基因 |
| 1. 6 克隆及重组子筛选和鉴定 |
| 1. 7 生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2. 1 川中黑山羊总RNA提取 |
| 2. 2 PCR扩增结果 |
| 2. 3 川中黑山羊BMP2、BMP4 基因CDS区的核苷酸序列及其特征 |
| 2. 4 川中黑山羊BMP2、BMP4 蛋白的结构特征 |
| 3 讨论 |
| 3. 1 序列比对 |
| 3. 2 分子系统进化关系 |
| 3. 3 结构与功能 |
| 4 结论 |
（9）新西兰白兔骨形态发生蛋白（BMPs）的克隆及时空差异性表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 骨形态发生蛋白家族（BMPs）及其受体的研究应用进展 |
| 1.1.1 BMPs 家族的发展简史 |
| 1.1.2 BMPs 的种类及结构特征 |
| 1.1.3 BMPs 的受体类型及信号传导途径 |
| 1.1.4 BMPs 及其受体的生物学功能 |
| 1.2 BMP-2 的研究进展 |
| 1.2.1 BMP-2 的基因结构 |
| 1.2.2 BMP-2 的生物学功能 |
| 1.3 BMP-4 的研究进展 |
| 1.3.1 BMP-4 基因结构及基因调控 |
| 1.3.2 BMP-4 的生物学功能 |
| 1.3.3 BMP-4 与哺乳动物繁殖性能的关系 |
| 1.4 实时荧光定量 PCR 技术 |
| 1.4.1 实时荧光定量 PCR 原理 |
| 1.4.2 荧光定量 PCR 的定量方法 |
| 1.4.3 实时荧光定量 PCR 技术的应用 |
| 1.5 引言 |
| 2 新西兰白兔 BMP-2 基因和 BMP-4 基因的克隆与生物信息分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株和克隆载体 |
| 2.1.2 试验动物组织样 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 主要试剂和溶液 |
| 2.2 试验方法和步骤 |
| 2.2.1 PCR 引物设计和合成 |
| 2.2.2 动物组织总 RNA 的提取 |
| 2.2.3 RT-PCR 法扩增 BMP-2 和 BMP-4 部分序列 |
| 2.2.4 DNA 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 cDNA 的克隆及重组质粒的筛选和鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 总 RNA 的提取结果 |
| 2.3.2 反转录反应中 18srRNA 的扩增 |
| 2.3.3 RT-PCR 扩增结果 |
| 2.3.4 阳性克隆的筛选和鉴定 |
| 2.3.5 RT-PCR 产物的测序 |
| 2.4 新西兰白兔 BMP-2 基因和 BMP-4 基因部分 cDNA 序列的电子克隆 |
| 2.4.1 电子克隆新西兰白兔 BMP-2 基因 cDNA 序列的生物信息学分析 |
| 2.4.2 电子克隆新西兰白兔 BMP-4 基因 cDNA 序列的生物信息学分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 新西兰白兔 BMP-2 和 BMP-4 不同组织及不同时期的表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物和样品准备 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 RNA 提取和 cDNA 合成 |
| 3.1.4 PCR 引物设计与扩增条件优化 |
| 3.1.5 实时荧光定量 PCR 的表达分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA 的纯度与完整性 |
| 3.2.2 荧光定量 PCR 扩增曲线和溶解曲线 |
| 3.2.3 新西兰白兔不同发育时期 BMP-2 基因的组织表达研究 |
| 3.2.4 新西兰白兔不同发育时期 BMP-4 基因的组织表达研究 |
| 3.2.5 BMP-2 基因和 BMP-4 基因在新西兰白兔不同发育时期的组织表达特点比较 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BMP-2 基因组织表达特点和不同时期表达特点的分析 |
| 3.3.2 BMP-4 基因组织表达特点和不同时期表达特点的分析 |
| 3.3.3 BMP-2 基因和 BMP-4 基因的组织表达比较分析 |
| 3.4 小结 |
| 4 结论 |
| 5 创新点及下一步的工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒与细菌 |
| 1.1.2 酶及试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 人胎盘组织总RNA的提取 |
| 1.2.2 BMP-4基因的克隆 |
| 1.2.3 p MD18-T-BMP4质粒的构建及鉴定 |
| 1.2.4 p ET22b-BMP4载体构建及鉴定 |
| 1.2.5 IPTG诱导BMP4蛋白表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 BMP-4基因的克隆 |
| 2.2 pMD18-T-BMP4载体构建 |
| 2.3 pET22b-BMP4载体构建及鉴定 |
| 2.4 BMP4重组蛋白的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
四、CLONING AND SEQUENCING OF MATURE FRAGMENT OF HUMAN BMP4 GENE（论文参考文献）
- [1]DNA甲基化和H3K4me2拮抗调节BMP4促进鸡PGCs形成的机制研究和潜在应用[D]. 张明. 扬州大学, 2021
- [2]黔北麻羊BMP2、BMP4基因甲基化与生长性状的遗传效应研究[D]. 艾锦新. 贵州大学, 2020
- [3]Bmp4基因对鸡PGCs形成及分化的作用研究[D]. 李婷婷. 扬州大学, 2020
- [4]藏羊初级毛囊发育诱导期分子调控网络和候选基因转录调控机制研究[D]. 聂杨帆. 华中农业大学, 2019(01)
- [5]西藏绒山羊β-catenin、BMP4、Noggin基因序列、遗传多样性及mRNA表达分析[D]. 程琳芸. 四川农业大学, 2018(02)
- [6]黔北麻羊BMP4和BMPR-IB基因克隆表达及其多态性与繁殖性状的关联分析[D]. 孙振梅. 贵州大学, 2017(04)
- [7]猪BMP4基因克隆、多态性与表达分析[D]. 马百全. 南京农业大学, 2016(04)
- [8]川中黑山羊BMP2、BMP4基因cDNA克隆及生物信息学分析[J]. 龙石太,胡亮,吴宪红,字向东. 江苏农业科学, 2014(03)
- [9]新西兰白兔骨形态发生蛋白（BMPs）的克隆及时空差异性表达[D]. 路鹏. 河南农业大学, 2013(04)
- [10]人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建[J]. 刘秋英,陈伟,毛国梁,熊盛,钱垂文,利奕成,王一飞. 生物技术通报, 2012(02)