导读:本文包含了基因靶向载体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:双靶向载体系统,基因转染,抗ICAM-1,微泡
基因靶向载体论文文献综述
陈鹏,尹家保,谢满英,解芸竹,安鹏[1]（2015）在《超声联合携抗ICAM-1微泡的双靶向载体系统增强基因转染受损内皮细胞》一文中研究指出目的:探讨超声联合携抗细胞间黏附分子(ICAM)-1阳离子微泡的双靶向载体系统介导基质细胞衍生因子(SDF)-1α基因转染受损内皮的效果。方法:实验分组,A组:携SDF-1α基因抗ICAM-1阳离子微泡;B组:携SDF-1α阳离子微泡;C组:空白对照。体外实验:人白细胞介素-1β刺激制备大量表达ICAM-1的血管内皮细胞模型,各组联合超声辐照介导基因转染后测定基因转染率、基因和蛋白表达情况。体内实验:结扎冠状动脉前降支制备兔心肌梗死模型,超声辐照介导基因转染后取心肌组织,Western blot检测各组心肌SDF-1蛋白的表达情况,RT-PCR检测各组SDF-1 mRNA的表达情况。结果:无论是体外实验还是体内实验,A组:携SDF-1α基因抗ICAM-1阳离子微泡组超声辐照后的基因转染率、hSDF-1α基因mRNA表达和hSDF-1α蛋白表达情况均高于其他各组。结论:超声联合携抗ICAM-1微泡的双靶向载体系统能增强SDF-1α基因转染受损内皮细胞。(本文来源于《武汉大学学报(医学版)》期刊2015年01期）
邓思铭[2]（2014）在《携带抑瘤基因IL-24的rDNA区靶向载体对MSCs打靶的初步探索》一文中研究指出随着分子生物学的发展,人类对于DNA重组技术的认识逐渐成熟,肿瘤基因治疗作为治疗肿瘤的新手段应运而生。在肿瘤基因治疗中,载体以及运输细胞的选择尤为关键。我室一直致力于安全,高效的非病毒载体的研究与开发,在前期研究中已经成功构建了针对肿瘤基因治疗的载体：pHrneo-IL24。在靶细胞的选择上,MSCs具有向肿瘤位置迁移和趋近的能力,并且易于分离,可分化为多种细胞,有报道表明MSCs已应用于肿瘤治疗的临床前试验。MSCs的靶向基因修饰可进一步促进其在肿瘤基因治疗中的疗效,但MSCs的基因修饰一直是个技术难题,靶向基因编辑技术——核酸工程酶TALEN的出现为突破此难题提供了良好的工具。因此,本研究拟结合TALENickases(我室已建立的TALEN高效突变体),利用携带IL-24的核糖体基因区靶向载体pHrneo-IL24对MSCs进行基因打靶,以期得到稳定表达有生物学活性IL-24蛋白的定点整合克隆。目的：使用pHrneo-IL24载体系统联合TALENickases打靶MSCs,以期得到稳定表达IL-24的MSC细胞株。方法：1.MSCs的分离与培养：从骨髓标本中分离骨髓中的单核细胞,再用贴壁培养分离出骨髓间充质干细胞(MSCs)。2.流式鉴定扩大培养的MSCs表面标志物。3.将TALENickases以及pHrneo-IL24质粒通过核转,共转染至MSCs,镜下通过观察融合的GFP蛋白表达,分析转染效率。4、转染后细胞分两线接种,一线加入G418筛选定点整合克隆,另一线直接扩增培养。5.抽提打靶后细胞gDNA,定点整合PCR鉴定rDNA区整合细胞。6.收集打靶后细胞上清,ELISA检测细胞克隆IL-24蛋白的表达量。结果：1.从骨髓标本中分离出的MSCs呈短梭形,形态规整,数次传代后,呈成纤维状,流式结果显示符合MSCs的各项表面标志物表达；2.核转后的MSCs镜下可见绿色荧光表达,G418筛选后的细胞大量死亡,未得到定点整合的单克隆细胞。3.扩增未加G418筛选的转染后MSCs,抽提gDNA后,通过定点整合PCR检测到混合细胞中存在一定量的定点整合细胞。4.收集混合细胞上清,通过ELISA可检测到17.459ng/ml的IL-24蛋白表达。结论：成功分离并得到MSCs,初步验证联合TALENickases以及pHrneo-IL24载体能将IL-24表达框靶入到MSCs核糖体基因区,并分泌IL-24蛋白。(本文来源于《中南大学》期刊2014-06-01）
王科[3]（2012）在《利用PERV靶向载体构建转基因猪源细胞模型的初步研究》一文中研究指出猪是一种重要的食用动物,同时生理结构的某些方面也与人非常相似,因此,猪成为了医学研究中重要的动物模型和异种器官移植及组织移植时的重要供体。但是目前还缺少有效的构建猪动物模型和细胞模型的方法,在常用的转入方法中,外源基因经常是随机整合进靶细胞的基因组中,外源基因的随机插入会破坏重要基因的功能,从而造成发育缺陷。研究和建立效率较高的转基因方法体系对培育转基因猪和构建实验猪动物模型具有重要的意义。在猪基因组内存在多拷贝的猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV),通常这些前病毒的基因序列没有功能并且与发育无关,并会随着细胞染色体的复制而复制。本研究以PERV的全基因序列为基础构建靶向基因敲入载体,利用PERV两端的LTR作为同源序列,以同源重组的方式将外源基因定向的整合到猪基因组中的PERV相应位点中,通过筛选得到稳定表达的基因整合,之后对筛选得到的细胞基因组同源重组发生位点进行PCR检测,结果证明外源基因确实以同源重组的方式整合到了细胞基因组中。此方法的成功不仅能大大提高基因敲入的效率,且会在不影响靶细胞固有基因功能的情况下,使外源基因更好的表达。研究包括以下工作：1. 同源重组PERV转基因载体的构建用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切除去了质粒pPM-1-GFP-21上面的5'LTR-ψ,通过PCR的方法从质粒pEGFP-N3上扩增得到了CMVie启动子,将其与5'LTR连接,构成了5'LTR-CMVie片段,并用其替换5'LTR-ψ,得到质粒pPCM1后通过酶切对其进行了鉴定。随后从pORF9-HSV1tk质粒上扩增得到HSVtk基因,并将HSVtk基因插入pPCM1质粒3'LTR的下游,构建得到了pPCM1-tk,并通过酶切和PCR的方法对该重组质粒进行了鉴定,结果与预期一致。分别用LipofectamineTM 2000将质粒pPCM1-tk和pPM-1-GFP-21转染293T细胞,结果显示pPCM1-tk在表达效率上要高于之pPM-1-GFP-21,说明插入的CMVie有助于提高外源基因的表达效率。2.转染试剂和细胞的筛选使用LipofectamineTM 2000脂质体将质粒pPCM1-tk分别转染ST, SK-6, PK15, IBRS2, CPK这5种猪源细胞,对转染结果进行初步观察,表明其中ST细胞和SK-6细胞的荧光表达效率较高；同时使用EntransterTM-D和X-tremeGENE HP两种转染试剂分别转染ST细胞,通过观察荧光发现,X-tremeGENE HP试剂转染效率最高并且毒性最小,可作为实验使用的转染试剂。3. 同源重组细胞的筛选使用不同浓度的G418和GANC对ST细胞和SK-6细胞进行了培养和观察,确定了G418和GANC的使用浓度和时间：对发生同源重组的ST细胞的筛选需G418(浓度为600ug/ml)培养10天,GANC(浓度为1000ug/ml)培养2天；对发生同源重组的SK-6细胞的筛选,需G418(浓度为400ug/ml)培养10天,GANC(浓度为500ug/ml)培养2天。按照上述条件对转染pPCM1-tk的细胞进行筛选之后,提取细胞基因组。4. 同源重组的检测选取4个可能发生同源重组的位点设计引物,对细胞的基因组进行PCR扩增以检测同源重组,结果显示4个位点中的3个在猪细胞基因组中是存在的,ST没有在这3个位点发生同源重组,SK-6在其中的2个位点发生了重组。由于猪的基因组内存在多个拷贝的PERV基因序列,同源重组可能发生于这3个位点之外,因此对其他位点进行检测也有可能得到阳性结果,有必要进一步的实验加以验证。综上所述,本研究成功的构建了PERV基因靶向载体pPCM1-tk,将该载体转染猪源细胞ST和SK-6后,筛选得到同源重组的细胞,并利用PCR的方法检测同源重组的发生位点,证明了利用PERV靶向载体构建转基因细胞这种方法的可行性。(本文来源于《河北师范大学》期刊2012-03-26）
蒋磊,林飞燕,王福乐,叶爱芳,吴建波[4]（2011）在《慢病毒介导TIEG1基因乳腺癌靶向载体的构建及活性测定》一文中研究指出目的:构建慢病毒介导的TIEG1基因乳腺癌特异性靶向载体,并鉴定其活性。方法:将乳腺癌特异性survivin启动子片段和TIEG1基因先后克隆进带有绿色荧光蛋白的慢病毒载体中,构建survivin启动子驱动的TIEG1基因慢病毒表达载体,酶切及测序鉴定。包装纯化慢病毒颗粒,感染人脐静脉内皮细胞HUVEC和乳腺癌细胞SK-BR-3,观察绿色荧光蛋白的特异性表达。结果:成功构建带有肿瘤特异性survivin启动子驱动的TIEG1基因慢病毒表达载体。感染细胞后,乳腺癌SK-BR-3细胞可观察到绿色荧光表达,而人正常脐静脉内皮细胞基本无表达。半定量RT-PCR证实TIEG1基因在乳腺癌SK-BR-3细胞中过表达。结论:构建的survivin启动子驱动的慢病毒表达载体具有一定的肿瘤特异性,将为实现以慢病毒为载体的TIEG1基因肿瘤靶向治疗提供良好的实验基础。(本文来源于《实用医学杂志》期刊2011年11期）
肖涤[5]（2011）在《核糖体基因区锌指酶位点靶向载体的构建及其打靶研究》一文中研究指出核糖体基因(rDNA)区可能是一个安全有效的基因打靶区域,我室基于此开发的非病毒人源基因载体系统——核糖体基因区靶向载体,能携带多种治疗基因在多种细胞系中成功打靶rDNA 18S区+5468位点,且外源基因能长期稳定地表达。进一步提高rDNA区的打靶效率可以更充分地发挥该区域作为基因治疗靶位点的潜能,尤其在打靶病人来源的原代细胞方面带来突破。近年来,锌指酶作为提高基因打靶效率的有力工具被广泛应用,甚至能将打靶效率提高5000倍以上。我室针对rDNA内部转录间隔1(ITS1)区+6523-+6546位点设计的锌指酶ZFN-S3,体内体外实验检测均表明其具有较高的切割双链DNA的活性。ZFN-S3可能是用于提高rDNA区打靶效率有效工具。目的：针对ZFN-S3的切割位点设计、构建核糖体基因区锌指酶位点靶向载体——pHr1-NL、pHr2-NL,证实该载体打靶rDNA区的可行性,为该载体联合锌指酶ZFN-S3高效打靶rDNA区奠定基础。方法：载体pHr1-NL的构建：首先用PCR法克隆约2kb的rDNA同源序列。然后将无启动子但5’端有EMCV-IRES序列的新霉素磷酸转移酶(Neo)基因亚克隆至同源序列的rDNA ITS1区,利用“启动子陷阱”策略富集同源重组子。并在Neo基因两侧加入同向的loxP位点,用于后续的特异性基因删除。载体pHr2-NL的构建：将pHr1-NL上rDNA+5513-+6523的同源序列替换成rDNA+937-+6523同源序列。将构建好的载体pHr1-NL、pHr2-NL利用核转染技术转染人类纤维肉瘤(HT1080)细胞,通过筛选、挑取和计数细胞克隆、鉴定定点整合等步骤,对其rDNA区的打靶进行研究。结果：1、构建的载体pHr1-NL经EcoR V、ClaⅠ酶切鉴定,所获得的酶切片段大小与理论值相符。2、构建的载体pHr2-NL经EcoR V、AatⅡ酶切鉴定,所获得的酶切片段大小与理论值相符。3、载体pHr1-NL、pHr2-NL的测序结果与理论序列相符。4、采用核转技术将pHr1-NL转染到HT1080细胞中,G418筛选后PCR鉴定了13个抗性克隆,并未获得定点整合克隆。5、采用核转技术将pHr2-NL转染到HT1080细胞中,G418筛选后PCR鉴定了12个抗性克隆,并获得了1个定点整合克隆。结论：构建的含loxP位点的核糖体基因区锌指酶位点靶向载体PHr2-NL能将Neo基因定点整合至rDNA ITS1区,为联合锌指酶ZFN-S3高效打靶hrDNA区奠定了基础。(本文来源于《中南大学》期刊2011-06-01）
罗清[6]（2011）在《LRG47/EBP50基因共修饰的耻垢分支杆菌治疗性靶向载体疫苗的实验研究》一文中研究指出研究目的：构建LRG47/EBP50和LRG47/EBP50-RFP基因共修饰的耻垢分枝杆菌治疗性载体疫苗,使之能靶向进入MΦ,以便于后续从分子和细胞水平研究其抗Mtb感染的效果和机制。有望克服潜伏感染、多重耐药和再燃等结核病治疗难题,为开辟一条结核病防治的新思路奠定理论基础。研究策略与方法：1.利用RT-PCR从小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中扩增出EBP50基因、LRG47基因分别克隆至pCDNA3.1中,送去测序。测序正确后,通过次序严密的分步克隆,将EBP50基因片段亚克隆入双启动子真核共表达质粒pBudCE4.1的HindⅢ/BaMHl位点中、将LRG47基因亚克隆入pBudCE4.1的KpnlⅠ/Xhol位点中、分枝杆菌复制子OriM基因亚克隆入pBudCE4.1的NheI位点中,形成穿梭/共表达质粒pLEM并转染人293T细胞中进行表达鉴定。通过RT-PCR和Westernblot对目标基因产物进行检测。2.利用PCR从pSIREN-DNA-DsRed-Express中扩增出RFP基因并克隆至pCDNA3.1的EcoRⅠ/Xba I位点中,形成pCDNA3.1-RFP,利用PCR从pLEM中扩增出EBP50基因并克隆至pCDNA3.1的HindⅢ/EcoRI位点,形成pCDNA3.1-EBP50②,测序正确后,将EBP50基因亚克隆至pCDNA3.1-RFP中。通过次序严密的分步克隆,将EBP50-RFP片段亚克隆入双启动子真核共表达质粒pBudCE4.1的HindⅢ/BaMHI位点中、将LRG47基因亚克隆入pBudCE4.1的KpnI/XhoI位点中、分枝杆菌复制子OriM基因亚克隆入pBudCE4.1的NheI位点中,形成穿梭/共表达质粒pERLO并转染人293T细胞中进行表达。通过RT-PCR、荧光显微镜直接观察和Westernblot对目标基因产物进行检测。3.通过Westernblot检测耻垢分枝杆菌Msl-2c对腹腔巨噬细胞(PDMs)内源性表达的EBP50、LRG47的影响。将pLEM、pERLO质粒电转化耻垢分枝杆菌Msl-2c,鉴定无误后分别命名为rMS-pLEM、rMS-pERLO,扩增、洗涤后用于感染小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠腹腔巨噬细胞(PDMs),观察其对巨噬细胞的靶向性。实验结果：1.成功构建了携带小鼠EBP50基因、小鼠LRG47基因、分枝杆菌复制子OriM基因的共表达质粒pLEM,转染入人293T细胞中后通过RT-PCR、Westernblot等方法从转录和翻译水平都检测到了目标基因的表达产物。2.成功构建了携带小鼠EBP50-RFP表达基因、小鼠LRG47基因、分枝杆菌复制子OriM基因的共表达质粒pERLO,转染入人293T细胞中后通过RT-PCR、荧光观察和Westernblot方法均检测到了目标基因的表达产物。转染入小鼠RAW264.7中观察到红色荧光表达。3.Msl-2c能促进小鼠腹腔巨噬细胞内的EBP50、LRG47内源性表达。成功得到了靶向性良好的重组耻垢分枝杆菌rMS-pLEM、rMS-pERLO。结论：1.LRG47与EBP50能同时在真核细胞中表达出来。2.EBP50与RFP能融合表达,便于后续动物实验中EBP50在巨噬细胞内的定位检测。3.Msl-2c能作为巨噬细胞的靶向性载体。4.Msl-2c能上调巨噬细胞内内源性的EBP50与LRG47的表达。(本文来源于《南昌大学》期刊2011-06-01）
苏清秀[7]（2010）在《短双歧杆菌作为靶向载体在乳腺癌的基因治疗中的实验研究》一文中研究指出乳腺癌是我国妇女常见的恶性肿瘤,其发病率呈上升趋势。近年来,我国乳腺癌发病率的增长速度高出欧洲等高发国家1-2个百分点,每年有20余万妇女患乳腺癌,而且呈明显的年轻化趋势,30-40%的乳腺癌病人最终会发生远处转移。如何采取综合治疗手段来提高乳腺癌病人的生存率,已成为肿瘤学家们所关注的热点问题。基因治疗是一种新的癌症治疗模式,是一种以预防和治疗疾病为目的的人类基因转移技术,是通过改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗手段。基因治疗癌症成功的关键是治疗基因的获取、构建及传递载体的靶向性。只有把治疗基因高选择性地传递到达靶细胞并能在靶细胞高效表达才可以达到治疗的目的。由于目前所使用的基因传递载体的靶向性较差,所以缺乏高效、特异性的、靶向性高的转移载体是肿瘤基因治疗中存在的主要问题。因此选择具有靶向性强的传递载体已成为肿瘤基因治疗研究的一个焦点。这也是基因治疗难以突破的难题。先天致病性的厌氧菌,可以在肿瘤组织的乏氧区选择性富集,而且肿瘤的乏氧区又是肿瘤治疗的难点。因此选择双歧杆菌作为传递载体,可以高效、特异地将目的基因传递给肿瘤细胞,从而实现有效的抑瘤作用。本研究根据双歧杆菌的靶向性及IFNy的抗肿瘤作用,证实了B-b-pNZ44-IFNy质粒的抑瘤效应明显优于单纯基因治疗,其抑瘤机制可能是联合发挥IFNy的免疫调节作用和直接杀伤肿瘤作用及双岐杆菌的在肿瘤组织的乏氧区选择性富集的作用。本研究为提高肿瘤基因治疗效果开辟了新的途径,为基因治疗的临床应用奠定了理论和实验基(本文来源于《吉林大学》期刊2010-03-01）
赵春梅[8]（2009）在《鸡败血支原体黏附素GapA的表达及基因靶向载体的构建》一文中研究指出鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)能引起鸡及其它禽类的慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease, CRD)和火鸡传染性窦炎(Infectious sinusitis),该病广泛分布于世界上所有养禽的国家,且常继发或并发新城疫、传染性支气管炎等其他呼吸道传染病,造成巨大的经济损失。MG感染和寄生最重要的步骤是牢固地黏附在呼吸道黏膜固有层。因此,为了深入研究MG致病机制,本研究对MG主要黏附素GapA的相关免疫特性进行探索,并成功构建MG通用型转座载体和oriC可复制型载体用于MG基因靶向缺失研究。1鸡败血支原体强弱毒株gapA基因的克隆及序列测定本研究通过RT-PCR和PCR扩增MG不同毒力毒株的gapA基因N端序列,测定各基因片段序列,并比较其在转录水平、翻译水平和序列之间的差异性。结果表明:gapA基因存在于一个大型的mRNA转录产物中,与licA、mgc2、crmA叁个基因同在一个基因簇中;不同毒株之间,gapA基因N端存在明显的差异,GapA的90～290aa之间即为GapA的高变区(图1-9、图1-10)。而对于Rhigh,常出现在多个位置插入有单一“A”的现象,如:第105位、385位和910位,导致随后的基因序列移码成TAA终止子,致使翻译提前终止;而对于ts-11株,gapA N端的第142nt处由“C”突变为“A”,形成TAA密码子,致使翻译提前终止。而强毒株Rlow、S6、DC9604和弱毒株F、6/85均能编码gapA基因全长,编码大约110～120kD左右的蛋白。这几个毒株之间的区别在于:GapA的N端100~300aa之间存在高变区。这为GapA的表达和抗体制备奠定了基础。2鸡败血支原体Rlow株GapA氨基端(GapAN)的高效表达本研究通过PCR扩增GapA蛋白N端多肽(98~322aa)(GapAN)和C端(882aa-1115aa),分别连入pGEX-6P-1载体,转化BL21(DE3),经IPTG诱导,结果发现GapAN获得高效表达;而GapA C端未能成功表达。将GapAN亚克隆入pFAST-Bac1载体中,转座DH10Bac细菌,通过转染Sf9细胞,获得GapAN的重组杆状病毒。抗GapAN的多抗利用IFA检测,结果显示:GapAN成功地在杆状病毒中高效表达。3鸡败血支原体GapAN单抗制备利用GapAN的原核表达产物免疫Balb/c小鼠,并利用Bac-to-Bac表达系统表达的GapAN进行筛选,成功制备获得5株抗GapAN特异性单抗(1B5、1D7、3D4、4B3、5B10)。对单抗的免疫特性研究发现:单抗5B10株可以检测强弱毒株表达差异的GapA,表明该毒株极可能针对GapAN的高变区;3D4株出现荧光阳性效价,且其WB反应性最强,虽然不能区分强弱毒株,但该单抗可以用于GapA的常规表达鉴定;其余单抗的反应特异性不强,也在WB反应中出现多个条带。这一研究为GapA的功能研究及缺失筛选研究提供了必要的工具。4通用型转座载体mini-Tn4001tetM构建为了方便黏附素GapA等功能基因的研究工作,本研究根据转座子原理成功构建了MG的通用型转座载体:mini-Tn4001tetM。该转座载体包含有外置的金黄色葡萄球菌转座酶基因(tnp)和IS256重复序列(含Inner和Outer),筛选基因为粪肠球菌Tn916转座子的四环素抗性基因tetM。本研究对筛选基因、启动子进行了改造,置换了lacZ基因和MG tuf启动子等元件。电转化的初步结果显示:该转座载体可以在MG中连续传代。对插入区域和转座的稳定性鉴定工作正在进行中。5鸡败血支原体oriC复制型载体构建根据MG假定的oriC区域,设计不同引物扩增MG不同大小的oriC片段,分为:Long oriC(LoriC)、Short oriC(SoriC)和Whole oriC(WoriC)。分别将片段插入到pBlueScript SK(+)载体中,并插入含有Tn916四环素抗性基因(tetM)中,成功构建MG oriC可复制型载体。本研究将为研究MG功能基因提供必要的手段。(本文来源于《扬州大学》期刊2009-05-01）
梁宗敏[9]（2007）在《人源基因核糖体DNA区靶向载体VEGF165的构建及其在细胞中的定点表达研究》一文中研究指出血管内皮生长因子具有特异性促进内皮细胞增殖，诱发新生血管生长的作用。利用血管内皮生长因子(VEGF)基因诱导治疗性新生血管生成，从而治疗缺血性心脏病和缺血性下肢疾病，是一种很有前景的方法。VEGF基因成功治疗肢体血管闭塞症和心脏缺血性疾病的临床试验在国外已有较多的报道。将外源基因VEGF导入到机体或细胞内是基因治疗的前提，目前，已有很多种技术和方法可将外源基因转移到真核细胞中。病毒载体因其体内、外转染效率均较高，而成为在当前VEGF基因治疗的基础和临床研究中应用得最多的载体。然而，病毒载体的安全性仍然是一个不容忽视的问题。病毒载体的安全性问题主要存在于两个方面，首先，由于它们易被机体识别为异源物质而可能具有免疫原性(immunogenicity)，另外一个更大的威胁是它可能将外源基因或者自身基因片段随机插入到宿主基因转录与／或调控区域，造成宿主细胞正常功能基因的失活与某些沉默基因的激活，从而可能引发肿瘤或其它疾病。因此，病毒载体并不是基因治疗最理想的载体。医学遗传学国家重点实验室构建的人源基因载体—核糖体基因(rDNA)区靶向表达载体pHrneo能携带外源基因以较高的效率(10~(-4)-10~(-5))定点整合至人rDNA基因区。人每细胞有约600-800拷贝的rDNA基因，破坏一个拷贝对细胞维持正常的功能没有影响，是安全的基因治疗靶位点；而另一方面rDNA基因区编码核糖体RNA(rRNA)，是转录异常活跃的染色体区域，外源基因整合于rDNA基因区可以有效的表达。因此，以人源基因载体pHrneo将外源基因VFGE定点整合于人rDNA基因区，将能实现外源基因安全、稳定和有效的表达。本实验先成功地克隆出了VEGF基因片段，然后构建了携带VEGF基因的人源基因载体pHrneo-VEGF165，将构建的载体转入细胞内，测定定点整合及筛选定点细胞克隆，通过ELSA、RT-PCR、Western-blot等实验方法，检测出了VEGF的定点表达，为利用VEGF基因治疗缺血性心脏病和缺血性下肢疾病提供新的视角。(本文来源于《中南大学》期刊2007-05-01）
王娟,顾锦法,杨水云,肖田,齐荣[10]（2006）在《癌特异性双靶向载体的安全性及其携带基因的杀伤性》一文中研究指出背景与目的:我们创导的“癌症的靶向双基因-病毒治疗”策略可消灭移植性肿瘤,目前最重要的是要提高其安全性,使其只靶向肿瘤细胞,而在正常细胞内不复制或者很少复制。本研究旨在构建肿瘤特异性的双靶向腺病毒TD55,并研究其安全性;在TD55中插入凋亡基因TRAIL,构建成TD55-TRAIL,研究其杀伤性。方法:用hTERT启动子控制腺病毒复制必需的E1A基因,并将E1B55KD基因删除,构建肿瘤特异性的双靶向腺病毒TD55,使其只靶向p53功能缺乏的肿瘤。在TD55中插入凋亡基因TRAIL,构建成TD55-TRAIL,通过分子克隆构建质粒pTD55和pTD55-TRAIL,并与包装腺病毒的大质粒pBHGE3在293细胞中同源重组,得到腺病毒TD55和TD55-TRAIL。构建好的病毒体外感染人胚肺细胞MRC5、WI38,人结肠癌细胞SW620、HCT116、人肺癌细胞A549,分别用结晶紫染色法和MTT法检测其对细胞生长的影响。用流式细胞仪测定肿瘤细胞的凋亡率。结果:结晶紫染色结果和MTT结果表明,双靶向腺病毒TD55-TRAIL对正常细胞MRC5和WI38的杀伤作用比ZD55-TRAIL小很多。病毒复制能力分析表明,单靶向腺病毒在正常细胞中的复制倍数是双靶向腺病毒的3～5倍。TD55和TD55-TRAIL均能引起SW620细胞的凋亡,后者是前者的3.3倍。结论:双靶向腺病毒TD55-TRAIL对正常细胞的安全性比以往所构建的单靶向腺病毒ZD55-TRAIL更好,说明双靶向载体TD55比单靶向载体ZD55靶向性更高,如做为治疗药物可增加安全性,在治疗中可大大增加药物的安全性。携带的TRAIL基因能引起肿瘤细胞的凋亡,杀伤力较TD55增加数倍。(本文来源于《癌症》期刊2006年04期）
基因靶向载体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
随着分子生物学的发展,人类对于DNA重组技术的认识逐渐成熟,肿瘤基因治疗作为治疗肿瘤的新手段应运而生。在肿瘤基因治疗中,载体以及运输细胞的选择尤为关键。我室一直致力于安全,高效的非病毒载体的研究与开发,在前期研究中已经成功构建了针对肿瘤基因治疗的载体：pHrneo-IL24。在靶细胞的选择上,MSCs具有向肿瘤位置迁移和趋近的能力,并且易于分离,可分化为多种细胞,有报道表明MSCs已应用于肿瘤治疗的临床前试验。MSCs的靶向基因修饰可进一步促进其在肿瘤基因治疗中的疗效,但MSCs的基因修饰一直是个技术难题,靶向基因编辑技术——核酸工程酶TALEN的出现为突破此难题提供了良好的工具。因此,本研究拟结合TALENickases(我室已建立的TALEN高效突变体),利用携带IL-24的核糖体基因区靶向载体pHrneo-IL24对MSCs进行基因打靶,以期得到稳定表达有生物学活性IL-24蛋白的定点整合克隆。目的：使用pHrneo-IL24载体系统联合TALENickases打靶MSCs,以期得到稳定表达IL-24的MSC细胞株。方法：1.MSCs的分离与培养：从骨髓标本中分离骨髓中的单核细胞,再用贴壁培养分离出骨髓间充质干细胞(MSCs)。2.流式鉴定扩大培养的MSCs表面标志物。3.将TALENickases以及pHrneo-IL24质粒通过核转,共转染至MSCs,镜下通过观察融合的GFP蛋白表达,分析转染效率。4、转染后细胞分两线接种,一线加入G418筛选定点整合克隆,另一线直接扩增培养。5.抽提打靶后细胞gDNA,定点整合PCR鉴定rDNA区整合细胞。6.收集打靶后细胞上清,ELISA检测细胞克隆IL-24蛋白的表达量。结果：1.从骨髓标本中分离出的MSCs呈短梭形,形态规整,数次传代后,呈成纤维状,流式结果显示符合MSCs的各项表面标志物表达；2.核转后的MSCs镜下可见绿色荧光表达,G418筛选后的细胞大量死亡,未得到定点整合的单克隆细胞。3.扩增未加G418筛选的转染后MSCs,抽提gDNA后,通过定点整合PCR检测到混合细胞中存在一定量的定点整合细胞。4.收集混合细胞上清,通过ELISA可检测到17.459ng/ml的IL-24蛋白表达。结论：成功分离并得到MSCs,初步验证联合TALENickases以及pHrneo-IL24载体能将IL-24表达框靶入到MSCs核糖体基因区,并分泌IL-24蛋白。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
基因靶向载体论文参考文献
[1].陈鹏,尹家保,谢满英,解芸竹,安鹏.超声联合携抗ICAM-1微泡的双靶向载体系统增强基因转染受损内皮细胞[J].武汉大学学报(医学版).2015
[2].邓思铭.携带抑瘤基因IL-24的rDNA区靶向载体对MSCs打靶的初步探索[D].中南大学.2014
[3].王科.利用PERV靶向载体构建转基因猪源细胞模型的初步研究[D].河北师范大学.2012
[4].蒋磊,林飞燕,王福乐,叶爱芳,吴建波.慢病毒介导TIEG1基因乳腺癌靶向载体的构建及活性测定[J].实用医学杂志.2011
[5].肖涤.核糖体基因区锌指酶位点靶向载体的构建及其打靶研究[D].中南大学.2011
[6].罗清.LRG47/EBP50基因共修饰的耻垢分支杆菌治疗性靶向载体疫苗的实验研究[D].南昌大学.2011
[7].苏清秀.短双歧杆菌作为靶向载体在乳腺癌的基因治疗中的实验研究[D].吉林大学.2010
[8].赵春梅.鸡败血支原体黏附素GapA的表达及基因靶向载体的构建[D].扬州大学.2009
[9].梁宗敏.人源基因核糖体DNA区靶向载体VEGF165的构建及其在细胞中的定点表达研究[D].中南大学.2007
[10].王娟,顾锦法,杨水云,肖田,齐荣.癌特异性双靶向载体的安全性及其携带基因的杀伤性[J].癌症.2006